计算优化的广泛反应性H1N1流感抗原.pdf

本发明描述了用于针对H1N1流感病毒分离物引发广泛反应性免疫应答的优化的H1N1流感HA多肽的生成。优化的HA多肽是基于选定的来自1918-2012的分离的H1N1病毒，通过一系列的HA蛋白比对，以及随后的共有序列的产生而生成的。本发明提供了优化的H1N1 HA多肽，和包括所述HA多肽的组合物、融合蛋白和VLP。本发明进一步提供了编码HA多肽的密码子优化的核酸序列。本发明也提供了在受试对象体内引起针对流感病毒的免疫应答的方法。

1.  重组流感血凝素(HA)多肽，其包括氨基酸序列，所述氨基酸序列
(i)与SEQ ID NO：1具有至少96％的同一性或与SEQ ID NO：1的残基2-566具有至少96％的同一性；
(ii)与SEQ ID NO：2具有至少99％的同一性或与SEQ ID NO：2的残基2-566具有至少99％的同一性；
(iii)与SEQ ID NO：3具有至少99％的同一性或与SEQ ID NO：3的残基2-566具有至少99％的同一性；
(iv)与SEQ ID NO：4具有至少99％的同一性或与SEQ ID NO：4的残基2-566具有至少99％的同一性；
(v)与SEQ ID NO：5具有至少98.4％的同一性或与SEQ ID NO：5的残基2-566具有至少98.4％的同一性；
(vi)与SEQ ID NO：6具有至少99％的同一性或与SEQ ID NO：6的残基2-565具有至少99％的同一性；
(vii)与SEQ ID NO：7具有至少97％的同一性或与SEQ ID NO：7的残基2-566具有至少97％的同一性；或
(viii)包括SEQ ID NO：8。

2.  重组流感HA多肽，包括：
(i)相对于SEQ ID NO：1的不超过10个氨基酸置换；
(ii)相对于SEQ ID NO：2的不超过8个氨基酸置换；
(iii)相对于SEQ ID NO：3的不超过6个氨基酸置换；
(iv)相对于SEQ ID NO：4的不超过7个氨基酸置换；
(v)相对于SEQ ID NO：5的不超过9个氨基酸置换；
(vi)相对于SEQ ID NO：6的不超过6个氨基酸置换；或
(vii)相对于SEQ ID NO：7的不超过10个氨基酸置换。

3.  如权利要求1或2所述的重组流感HA多肽，其包括下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：1的残基2-566、SEQ ID NO：2的残基2-566、SEQ ID NO：3的残基2-566、SEQ ID NO：4的残基2-566、SEQ ID NO：5的残基2-566、SEQ ID NO：6的残基2-565或SEQ ID NO：7的残基2-566。

4.  如权利要求1或2所述的重组流感HA多肽，其由以下氨基酸序列构成：SEQ ID NO：1的残基2-566、SEQ ID NO：2的残基2-566、SEQ ID NO：3的残 基2-566、SEQ ID NO：4的残基2-566、SEQ ID NO：5的残基2-566、SEQ ID NO：6的残基2-565或SEQ ID NO：7的残基2-566。

5.  如权利要求1或2所述的重组流感HA多肽，其包括下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。

6.  如权利要求1或2所述的重组流感HA多肽，其由以下氨基酸序列构成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。

7.  分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求1-6中任一项所述的流感HA多肽。

8.  如权利要求7所述的分离的核酸，其中所述核酸是针对哺乳动物细胞中的表达经密码子优化的。

9.  载体，所述载体包括如权利要求7或8所述的核酸。

10.  如权利要求9所述的载体，所述载体进一步包括启动子，所述启动子可操作地连接至所述编码流感HA多肽的核酸。

11.  分离的细胞，所述分离的细胞包括如权利要求9或10所述的载体。

12.  流感病毒样颗粒(VLP)，所述流感病毒样颗粒包括如权利要求1-6中任一项所述的流感HA多肽。

13.  如权利要求12的流感VLP，所述流感VLP进一步包括流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(M1)蛋白、或它们两者。

14.  流感VLP，所述流感VLP包括如权利要求1-6中任一项所述的流感HA多肽，且通过在足以允许表达HA、M1和NA蛋白的条件下，以编码HA多肽的载体、编码流感NA蛋白的载体和编码流感M1蛋白的载体转染宿主细胞而产生。

15.  融合蛋白，所述融合蛋白包括如权利要求1-6中任一项所述的流感HA多肽的。

16.  组合物，所述组合物包括如权利要求1-6中任一项所述的流感HA多肽、如权利要求15所述的融合蛋白、或如权利要求13-15中任一项所述的VLP，和药学上可接受的载体。

17.  在受试对象体内引起对流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括施用如权利要求1-7中任一项所述的流感HA多肽、如权利要求16所述的融合蛋白、 如权利要求12-14中任一项所述的VLP、或如权利要求16所述的组合物。

18.  使受试对象对流感病毒免疫的方法，所述方法包括对受试对象施用组合物，所述组合物包括如权利要求12-14中任一项所述的VLP和药学上可接受载体。

19.  如权利要求18所述的方法，其中所述组合物进一步包括佐剂。

20.  如权利要求18或19所述的方法，其中所述组合物通过肌肉注射施用。

21.  如权利要求18-20所述的方法，其中所述组合物包括约1-约25μg的所述VLP。

22.  如权利要求21的方法，其中所述组合物包括约15μg的所述VLP。

计算优化的广泛反应性H1N1流感抗原
交叉引用相关申请
本申请要求2012年11月27日提交的美国临时申请号61/730,186的权益，在此整体引入该申请的内容。
技术领域
本公开涉及优化的流感血凝素蛋白，该流感血凝素蛋白对H1N1病毒分离物引起广泛的反应性免疫应答，以及该流感血凝素蛋白作为疫苗的使用。
背景技术
流感病毒是正粘病毒科的成员。有3个亚型的流感病毒，分别命名为A型流感病毒，B型流感病毒和C型流感病毒。流感病毒的病毒粒子含有分段的负股(negative-sense)的RNA基因组，其编码下列蛋白：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(M1)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、非结构蛋白2(NS2)。HA、NA、M1和M2为膜相关蛋白，而NP、PB1、PB2、PA和NS2为核衣壳相关蛋白。在流感病毒粒子中M1蛋白是最丰富的蛋白。HA和NA蛋白为包膜糖蛋白，负责病毒的附着和病毒粒子渗入细胞，并且对于病毒中和和保护性免疫来说是主要的免疫显性表位来源。HA和NA蛋白两者都被认为是预防性流感病毒疫苗的最重要成分。
每年，仅在美国，季节性流感都会导致超过300,000人住院和36,000人死亡(Simonsen等，Lancet Infect Dis 7：658-66，2007)。在2009年，新流感病毒H1N1的出现演示了新的流感大流行能够如何迅速地席卷全球。
目前，在美国有两种许可的流感疫苗方式，分别为灭活的裂解疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗可以有效地诱导体液免疫应答，但通常不能很好地引起细胞免疫应答。因为可能会增加感染的风险，活毒疫苗不能施用于免疫功能低下者和怀孕的病人。因此，存在对更广泛的保护性流感病毒疫苗的需要。
发明概要
本发明公开了优化的H1N1流感HA多肽的产生，该优化的H1N1流感HA多肽用于引发针对H1N1流感病毒分离物的广泛反应性免疫应答。优化的HA多肽是基于选定的来自1918-2012的分离的H1N1病毒，通过一系列的HA蛋白比对(alignments)，以及随后产生共有序列而开发的。
本发明提供了重组流感病毒HA多肽，该重组流感病毒HA多肽具有优化的氨基酸序列，用于对H1N1流感引起广泛的反应性免疫应答。在一些实施方案中，所述HA多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7相比，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是相同的。在一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7，包括不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、或不超过10个的氨基酸置换。在一些实施方案中，HA多肽包含SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，流感HA多肽缺少N末端的蛋氨酸残基。
本发明也提供了编码重组HA多肽的分离的核酸分子和载体。进一步提供了包括这样的载体的分离的细胞。
本发明也提供了包括本文所公开的优化的HA多肽的流感病毒样粒子(VLP)和融合蛋白。
本发明进一步提供了组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的本发明所公开的优化的流感HA多肽、融合蛋白或VLP。本公开也提供通过对受试对象施用所公开的组合物、融合蛋白或VLP而引起对流感病毒的免疫应答的方法。
本发明也提供了通过对受试对象施用包括VLP的组合物而使受试对象对流感病毒免疫的方法，该VLP含有优化的HA多肽。
通过以下参考附图的详细描述，本发明上述的和其它的目标、特征和优点将变得更加清晰。
附图的简要说明
图1是根据方法X-1的用于生成H1N1 HA共有序列的工艺的原理图。
图2是根据方法X-2的用于生成H1N1 HA共有序列的工艺的原理图。
图3是根据方法X-3的用于生成H1N1 HA共有序列的工艺的原理图。
图4是根据方法X-4的用于生成H1N1 HA共有序列的工艺的原理图。
图5是根据方法X-5的用于生成H1N1 HA共有序列的工艺的原理图。
图6是根据方法X-6的用于生成H1N1 HA共有序列的工艺的原理图。
图7是根据方法A-5的用于生成H1N1 HA共有序列的工艺的原理图。
图8A-8B展示了在此处阐明为SEQ ID NO：1-7的H1N1 HA蛋白的序列比对。
图9A-9F的图展示了血凝抑制(HAI)血清抗体效价，该血凝抑制血清抗体效价来自针对H1N1流感分离物的群组的经接种疫苗(0、4、12周)的小鼠。在第14周使用H1N1流感病毒确定每个疫苗组的HAI效价。所展示是的接种VLP的小鼠的HAI效价，所述VLP包含方法X-1 HA(图9A)、方法X-2 HA(图9B)、方法X-3 HA(图9C)、方法X-4 HA(图9D)、方法X-5 HA(图9E)、和方法X-6 HA(图9F)。数值表示log2转化效价的几何平均效价(+95％置信区间)。
序列表
如37 C.F.R 1.822中定义，通过使用标准字母缩写表示核苷酸碱基、三字母代码表示氨基酸，而示出列于所附的序列表中的核酸和氨基酸序列。每个核酸序列只有一条链被表示，而互补链被理解为通过任意参照所显示的链而被包括。序列表以2013年9月6日创建的、大小42.9KB的ASCII文本文件的形式提交。在此通过参考引入本发明。在所附序列表中：
SEQ ID NO：1-7是优化的H1N1 HA蛋白的氨基酸序列，这些序列也在图8中展示。
SEQ ID NO：8是优化的H1N1 HA蛋白的共有氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写
COBRA：计算优化的广泛反应性抗原
HA：血凝素
HAI：血凝抑制
HRP：辣根过氧化物酶
M1：基质蛋白1
NA：神经氨酸酶
PFU：空斑形成单位
VLP：病毒样颗粒
II.术语和方法
除非另有说明，以常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可在以下中找到：Benjamin Lewin，GenesV，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为便于理解本发明的各实施方案，下面提供了对特定术语的解释：
佐剂：非特异性提高对抗原的免疫应答的物质或载体(vehicle)。佐剂可以包括吸收抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝、或磷酸盐)的悬浮液；或者油包水的乳剂，在所述油包水的乳剂中，抗原溶液被乳化在矿物油中(例如：弗氏不完全佐剂)，有时包含杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步提高抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可以作为佐剂使用(例如见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂也包括生物分子，例如共刺激分子。典型的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、INF-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-2、OX-40L和41 BBL。
施用：按本发明的用法，将组合物施用于受试对象的含义是给予、施加或带入组合物与受试对象相接触。施用可以通过多种途径中的任一途径来完成，例如局部、口服、皮下、肌肉、腹膜内、静脉内、鞘内和皮内。
抗体：具有特定氨基酸序列的由B淋巴细胞所产生的免疫球蛋白分子。抗体是在人或其它动物体内通过特定抗原(免疫原)引起的。抗体的特征在于以某种可论证的方式特异性地与抗原的反应，抗体和抗原各自被彼此所定义。“引起抗体应答”是指抗原或其它分子诱导抗体产生的能力。
抗原：可以在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物、 或物质，其中包括注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特异性的体液或细胞免疫的产物(包括由异种免疫原所诱导的那些)进行反应。在所公开的组合物和方法的一些实施方案中，所述抗原是流感HA蛋白。
密码子优化：“密码子优化”核酸是指已经改变的核酸序列，以使得这些密码子对于在特定的系统(如物种的群体中的特定物种)中的表达是最理想的。例如，为了在哺乳动物细胞中的表达，可以优化核酸序列。密码子的优化不改变所编码的蛋白的氨基酸序列。
融合蛋白：通过从编码两个不同(异源)蛋白的至少部分的核酸序列所设计的核酸序列的表达所生成的蛋白。为了创造融合蛋白，核酸序列必须在相同的阅读框中并且含有(contain to)内部终止密码子。例如，融合蛋白包含融合至异种蛋白的流感HA。
血凝素(HA)：是流感病毒的表面糖蛋白。HA介导病毒粒子与宿主细胞的结合以及随后的病毒进入宿主细胞。在该领域中许多流感HA蛋白的核苷酸和氨基酸序列都是已知的，并且是公开可用的，例如那些存储在GenBank中的序列。HA(连同NA)是两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。
免疫应答：免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞(polymorphonucleocyte))对于刺激物(如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御反应的主体(body)的任何细胞，例如包括分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。本发明所使用的保护性免疫应答是指保护对象免于感染(预防感染或阻止与感染相关的疾病的发展)的免疫应答。衡量免疫应答的方法在本领域中是已知的，例如测量淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体的产生等。
免疫原：是在适合的条件下，可以刺激免疫应答(例如在动物内的抗体的产生或T细胞的应答)的化合物、组合物或物质，免疫原包括注射或吸收到动物体内的组合物。本发明所使用的“免疫原性组合物”是包括免疫原(如HA多肽)的组合物。
免疫：通过例如疫苗接种，使受试对象免受传染病。
流感病毒：分段的负链RNA病毒，其属于正粘病毒科。有A、B和C三个型的流感病毒。A型流感病毒可以感染多种鸟类和哺乳动物，其中包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡类。在动物中，大多数A型流感病毒 引起呼吸道和肠道的轻度局部感染。然而，高病原性的A型流感毒株，如H5N1，在家禽中可以引起全身性的感染，并且死亡率可以达到100％。在2009年，H1N1流感是引起人类流感的最普遍原因。在2009年，出现了猪源H1N1的新毒株，其被世界卫生组织公布为流行病。这一毒株称为“猪流感”。H1N1A型流感病毒也是引起1918年西班牙大流感、1976年Fort Dix流感爆发、以及1977-1978年俄罗斯流感传染病的原因。
分离的：“分离的”生物成分(如核酸、蛋白质或病毒)已经从其它生物成分(如细胞碎片、或其它蛋白或核酸)中被充分地分离或者纯化出来。已经被“分离”的生物组分包括那些采用标准纯化方法纯化后的组分。该术语也包括重组核酸、蛋白质或病毒(或VLP)、以及化学合成的核酸或肽。
连接基团：在融合蛋白的两个多肽之间起间隔物的作用的一个或多个氨基酸。
基质(M1)蛋白：是发现于病毒包膜的流感病毒结构蛋白。M1被认为起装配和出芽的功能。
神经氨酸酶(NA)：是流感病毒的膜糖蛋白。NA参与病毒HA的细胞受体破坏，该破坏是通过在感染的细胞表面上的碳水化合物部分切割末端唾液酸残基来实现的。NA也自病毒蛋白切割唾液酸残基以阻止病毒的聚合。NA(连同HA)是两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。
可操作连接：当以与第二核酸序列成功能关系的方式放置第一核酸序列时，所述第一核酸序列是可操作地与第二核酸序列连接的。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，该启动子就是可操作地连接到编码序列上。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并在同一个阅读框下必须连接两个蛋白编码区。
优化的流感HA蛋白：按本发明的用法，“优化的流感HA蛋白”是指HA蛋白共有序列，该HA蛋白共有序列是通过选定的在1918-2012之间分离的H1N1流感病毒的序列比对生成的(如下面的实施例1所述)。针对在哺乳动物细胞中的表达，经由密码子优化和RNA优化(如增加RNA稳定性)来进一步或可以进一步优化编码优化的HA蛋白的核苷酸序列。本发明所公开的优化的流感HA蛋白(且在本文中被阐明为SEQ ID NO：1-7)也被称为“COBRA”序列。设计优化的HA多肽，以在受试对象中引起广泛的免疫应答。在本发明的上下文中，“广泛反应性”是指该蛋白序列在受试对象中引起免疫应答，该 免疫应答足以抑制、中和或预防一系列广泛的流感病毒(如在特定亚型中的大多数或全部的流感病毒)的感染。在一些实例中，优化的流感HA蛋白能够针对大多数或全部H1N1流感病毒分离物引起免疫应答，例如保护性免疫应答。
爆发：按本发明的用法，流感病毒“爆发”指在给定的年份中来自于单个国家内的病毒分离物的组群。
药学上可接受的载体：在本公开中有用的药学上可接受的载体(载体(vehicles))是常见的。在E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack publishing Co.，Easton，PA，15th Edition(1975)中描述了适合一种或多种治疗组合物的药物学输送的组合物和制剂，例如一种或多种流感疫苗，以及额外的药剂。
在一般情况下，载体的性质取决于所利用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，其包括药物学上和生理学上可接受的液体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等作为载体。而对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂、或胶囊的形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、或硬脂酸镁。除了生物学上的中性生物载体外，被施用的药物学组合物也可以包含少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或山梨醇单月桂酸酯。
多肽：是其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸为α-氨基酸时，无论是L型的光学异构体或D型的光学异构体都可以使用。本发明所使用的“多肽”或“蛋白质”这些术语意图包含任何氨基酸序列和包括例如糖蛋白等经修饰的序列。“多肽”这一术语明确地用于涵盖自然生成的蛋白质，和那些通过重组或合成所产生的蛋白。术语“残基”或“氨基酸残基”则是指合并入蛋白、多肽或肽的氨基酸。
保守氨基酸置换是这样的置换：在进行保守氨基酸置换时，尽量对原蛋白属性产生最小的影响，也就是说，蛋白的结构尤其是功能是保守的并且不能通过这样的置换来显著地改变。保守置换的例子如下所示：

保守置换一般维持(a)在置换区域中的多肽骨架的结构，例如片层或螺旋的构象，(b)在靶位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。
通常被期望产生蛋白质中的最大的变化的置换是非保守性的，例如以下这些变化：(a)亲水残基，例如丝氨酰或苏氨酰置换疏水残基(如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)或被疏水残基置换；(b)半胱氨酸或脯胺酸置换任何其它的残基或被任何其它的残基置换；(c)带有正电的侧链的残基，如赖氨酰、精氨酰或组氨酰置换负电残基(如谷氨酰或天门冬氨酰)或被负电残基置换；或(d)带有大体积侧链的残基，如苯丙氨酰，置换(或被置换为)一个不带侧链的残基，如甘氨酸。
预防，治疗或改善疾病：“预防”是指抑制疾病的全过程发展。“治疗”是指在疾病开始发展后改善疾病的迹象或症状或病理状态的治疗干预。“改善”则是指疾病的迹象或症状在数量和严重程度上的减少。
启动子：启动子是指导核酸转录的核酸控制序列的排列。启动子包括靠近转录起始位点的必需核酸序列。启动子也可选择地包括末端增强子或抑制 元件。“组成性启动子”是具有持续活性的、不被外部信号或分子所调节的启动子。相反，“诱导性启动子”的活性受外部信号或分子(例如转录因子)所调节。本发明的一些实施方案中，启动子为CMV启动子。
纯化的：该术语“纯化的”不是要求绝对的纯度，相反，它是一个相对性的概念。因此，例如纯化的多肽、蛋白、病毒、VLP或其它活性化合物是从天然相关蛋白和其它杂质中全部或部分分离出来的。在某些实施方案中，“实质地纯化的”这一术语是指多肽、蛋白、病毒、VLP或其它活性化合物已经从细胞、细胞培养基、或其它粗制备物中分离，并经分馏法除去初始制备物的各种成分，例如蛋白、细胞碎片和其它组分。
重组：重组核酸、蛋白、病毒或VLP是指具有不是自然产生的序列或具有通过人工组合两个原本分离的序列片段而制成的序列。人工组合往往是通过化学合成或更通常地通过人工对分离的核酸片段进行操作，例如，通过基因工程技术来完成。
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性是根据序列之间的相似度来表示，又称为序列同一性。序列的同一性经常根据同一性百分比(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，表示两个序列越相似。使用标准方法比对时，给定的基因或蛋白的同源物或变体具有相对较高水平的序列同一性。
用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。许多软件和比对算法被描述在以下中：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：248，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson和Lipan，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988；Higgins和Sharp，Gene 73：237-244，1988；Higgins和Sharp，CABIOS5：151-153，1989；Corpet等.，Nucleic Acids Research 16：10881-10890，1988；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988；Altschul et al.，Nature Genet.6：119-129，1994。
NCBI基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST^TM)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)可以经几个来源使用，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和在互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。
受试对象：活的多细胞脊椎动物生物体，其是包括人和非人的哺乳动物的类别，例如非人的灵长类动物。
治疗有效量：对于正以特定试剂治疗的对象，足以获得理想的治疗效果 的该试剂的量。例如，这可以是用于引起受试对象免疫应答和/或者用于预防流感病毒引起的感染或者疾病的流感病毒疫苗的量。理想地，在本发明的上下文中，流感疫苗的治疗有效量是这样的量：在没有在受试对象体内引起实质的细胞毒性作用的情况下，增加受试对象的抵抗力的量，以预防、改善和/或治疗由受试对象中的流感病毒所引起的感染。用于增加抵抗力以在受试对象中预防、改善和/或治疗感染的流感疫苗的有效量取决于例如所治疗的受试对象、治疗成分的施用方式和其它因素。
转化的：转化的细胞是一种通过分子生物学技术而引入核酸分子的细胞。如本文所用，转化这一术语包含可将核酸分子引入这样的细胞中的全部技术，包括用病毒载体转染、用质粒载体转化和通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速而引入裸DNA。
疫苗：其是免疫原性物质的制品，其能够刺激免疫应答，施用后用于预防、改善或治疗疾病(如传染性疾病)。免疫原性物质可以包括例如减毒或杀死的微生物(例如减毒性病毒)、或来自于这些减毒或杀死的微生物的抗原蛋白、肽或DNA。疫苗可以引起预防性和治疗性应答。根据疫苗的不同，施用方法也是变化的，但可包括接种、摄入、吸入或其它形式的施用。接种物可以通过许多途径中的任何一种来输送，包括胃肠外，例如静脉内，皮下或肌肉内。疫苗也可以与佐剂一起施用来提高免疫应答。
载体：载体是在不破坏该载体在宿主细胞中复制和/或整合的情况下，使外源的核酸插入其中的核酸分子。载体可以含有使其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制的起始位点。插入载体具有使自身插入到宿主核酸中的能力。载体也含有一个或多个选择性标记基因和其它基因元件。表达载体含有可以使插入的基因进行转录和翻译所必需的调控序列。在本公开的一些实施方案中，这些载体编码流感HA、NA或M1蛋白。在一些实施方案中，所述载体为pTR600表达载体(美国专利申请公开号2002/0106798；Ross等，Nat Immunol.1(2)：102-103，2000；Green等，Vaccine 20：242-248，2001)。
病毒样颗粒(VLP)：病毒粒子由一个或多个病毒结构蛋白构成，但是缺乏病毒的基因组。VLP因为缺少病毒的基因组，所以它们是非感染性的。此外，VLP可以经常通过异源表达生成，并且可以容易地被纯化。大多数VLP包括至少病毒核心蛋白，所述病毒核心蛋白驱动出芽和驱动自宿主细胞释放粒子。这种核心蛋白的一个例子是流感M1。在本文的一些实施方案中，流感VLP 包含HA、NA和/或ML蛋白质。流感VLP可以通过以编码HA和NA蛋白、以及可选的M1蛋白的质粒转染宿主细胞来产生。在以允许蛋白质表达的合适的时间(如大约72小时)孵育转染的细胞之后，VLP可以从细胞培养物的上清液中分离。实施例2提供了从细胞上清液中纯化流感VLP的示例性程序。在这个实施例中，VLP经过低速离心(以除去细胞碎片)、真空过滤和通过使用20％的甘油的超速离心而分离。产生流感VLP的其它方法在本领域中也是已知的(例如见美国专利申请公开号2006/0263804；2008/0031895；2010/0166769和2010/0239610)。
除非另有说明，本发明所使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非文中另有明确说明，单数术语“a”“an”“the”包括复数个事物。类似地，除非文中另有明确说明，词“或”意图包括“和”。因此，“包括A或B”意为包括A、或B、或A和B。可以进一步理解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并且是出于说明的目的提供的。尽管与本发明所述相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下文描述了合适的材料和方法。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料都通过引用整体结合入本发明。如有冲突，以本发明书包括术语解释为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，不构成对本发明的限制。
III.实施方案概述
本发明公开了用于针对H1N1流感引发广泛反应性免疫应答的优化的H1N1流感HA多肽的生成。优化的HA多肽是基于选定的来自1918-2012的分离的H1N1病毒，通过一系列的HA蛋白比对，以及随后的共有序列的产生而开发的。用于生成7个HA序列的方法在实施例1和图1-7中有描述。7个优化的HA多肽的氨基酸序列在此阐明为SEQ ID NO：1-7。此外，SEQ ID NO：1-7的氨基酸的共有序列在此提供为SEQ ID NO：8。
本发明提供了具有优化的氨基酸序列的、用于对H1N1流感引起广泛反应性免疫应答的重组流感HA多肽。在一些实施方案中，HA多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，具有至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5 ％、至少99％或至少99.5％的同一性。在另一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，包括不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个的氨基酸置换。
在特定的实施方案中，提供了包括氨基酸序列的重组流感HA多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：2具有至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：3具有至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：4具有至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：5具有至少98.4％、至少98.6％、至少98.8％、至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：6具有至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：7具有至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、或至少99.5％的同一性；或者包括SEQ ID NO：8。
在其他特定的实施方案中，重组流感HA多肽包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1的残基2-566具有至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：2的残基2-566具有至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：3的残基2-566具有至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：4的残基2-566具有至少99％或至少99.5％的同一性；与SEQ ID NO：5的残基2-566具有至少98.4％、至少98.6％、至少98.8％、至少99％或至少99.5％的同一性，与SEQ ID NO：6的残基2-565具有至少99％或至少99.5％的同一性，与SEQ ID NO：7的残基2-566具有至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％的同一性；或者包括SEQ ID NO：8的残基2-566。
在另外的实施方案中，HA多肽的氨基酸序列包括(i)相对于SEQ ID NO：1的不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个的氨基酸置换；(ii)相对于SEQ ID NO：2的不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个的氨基酸置换；(iii)相对于SEQ ID NO：3的不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个的氨基酸置换；(iv)相对于SEQ ID NO：4的不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不 超过2、或不超过1个的氨基酸置换；(v)相对于SEQ ID NO：5的不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个的氨基酸置换；(vi)相对于SEQ ID NO：6的不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个的氨基酸置换；(vii)相对于SEQ ID NO：7的不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个的氨基酸置换。
在一些实施例中，流感HA多肽包括以下的氨基酸序列或由以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1的残基2-566、SEQ ID NO：2的残基2-566、SEQ ID NO：3的残基2-566、SEQ ID NO：4的残基2-566、SEQ ID NO：5的残基2-566、SEQ ID NO：6的残基2-566、SEQ ID NO：7的残基2-566或SEQ ID NO：8的残基2-566。
在其它实施例中，重组HA多肽包括以下的氨基酸序列或由以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8。
本发明进一步提供的是编码本发明所公开的重组HA多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，针对在哺乳动物细胞中表达，对核酸分子进行密码子优化。可选择地对核酸分子的RNA稳定性进行进一步的优化。
本发明还提供了包括编码重组HA多肽的核酸分子的载体。该载体可以是任何合适的用于表达HA多肽的载体，例如哺乳动物表达载体。在特定实施例中，该载体为pTR600表达载体(美国专利申请公开号2002/0106798，通过引用结合入本发明；Ross等，Nat Immunol.1(2)：102-103，2000；Green等，Vaccine 20：242-248，2001)。
在一些实施例中，载体含有可操作地连接于编码HA多肽的核酸序列上的启动子。在特定的实施例中，该启动子为CMV启动子。
本发明也提供了包含所公开的载体的分离的细胞。在一些实施例中，该细胞可以是任何适合的用于产生或表达VLP的细胞类型，例如哺乳动物细胞。
本发明进一步提供了包括本发明所公开的优化HA多肽的流感VLP。该流感VLP可以进一步包括任何额外的对于形成病毒粒子所必需的流感病毒蛋白。在一些实施方案中，流感VLP进一步包括流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(M1)蛋白，或者两者都有。
本发明也提供了包括本发明所公开的流感HA多肽的流感VLP，所述流 感VLP通过在足以允许表达HA、M1和NA蛋白的条件下，以编码HA多肽的载体、编码流感NA蛋白的载体和编码流感M1蛋白的载体转染宿主细胞而产生。
本发明也进一步提供了包括优化的流感HA多肽的融合蛋白。
本发明也提供了组合物，所述组合物包括如本发明所公开的优化的流感HA蛋白、或者包含所述优化的流感HA蛋白的融合蛋白或VLP。在一些实施方案中，组合物进一步地包括药物学上可接受的载体和/或佐剂。例如佐剂可以是明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)。
本发明更进一步提供了在受试对象体内引起对流感病毒的免疫应答的方法，如本发明所述，该方法通过施用优化的流感HA蛋白、含有优化的流感HA的融合蛋白，含有优化流感HA的VLP、或其组合物来进行。在一些实施方案中，流感病毒为H1N1流感病毒。在一些实施方案中，HA蛋白、HA融合蛋白或VLP可以以任何适当的施用途径施用，例如肌肉内施用。在一些实施方案中，HA蛋白、融合蛋白或VLP可以作为进一步包括药物学上可接受的载体和/或佐剂的组合物施用。例如佐剂可以是明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)。
本发明也提供了通过将含有本发明所公开的优化的流感HA蛋白的VLP或其组合物施用于受试对象来使受试对象对流感病毒免疫的方法。在该方法的一些实施方案中，组合物可进一步地包括药学上可接受的载体和/或佐剂。例如佐剂可以是明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)。在一些实施方案中，VLP(或其组合物)通过肌肉内施用。
在引起免疫应答或使受试对象免疫的方法的一些实施方案中，受试对象被施用约1-约25μg的含有优化HA蛋白的VLP。在特定的实施例中，受试对象被施用约5-约20μg的VLP、或约10-约15μg的VLP。在一个特定的非限定性实施例中，受试对象被施用约15μg的VLP。然而，本领域技术人能够确定施用于受试对象的VLP的治疗有效量(例如针对H1N1流感病毒感染提供保护的量)。
IV.优化的H1N1流感HA多肽
本发明提供了7个不同的优化的H1N1 HA多肽序列。H1N1 HA氨基酸 序列是从NCBI流感病毒资源数据库中下载的。来自于来自1918-2012的分离的流感病毒的H1N1 HA蛋白用于生成共有序列。实施例1描述了用于生成每一个共有序列的方法(也参见图1-7)。
H1N1 COBRA方法X-1(SEQ ID NO：1)
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公布的(Post)1918-1947 H1N1方法X-2(SEQ ID NO：2)
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“季节性”1978-2008H1N1 COBRA方法X-3(SEQ ID NO：3)
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去糖基化的H1N1 COBRA方法X-4(SEQ ID NO：4)
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近30年的H1N1方法X-5(SEQ ID NO：5)
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近20年的H1N1 COBRA方法X-6(SEQ ID NO：6)
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H1N1 COBRA方法A-5(SEQ ID NO：7)
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SEQ ID NO：1-7的共有序列(SEQ ID NO：8)
MXAXLLVLLCAFXATXADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCXLKGIAPLQLGXCXXAGWILGNPECEXLXSKXSWSYIXETPNXENGTCYPGXFXDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPXHXXTXGVXAXCSHXGKSSFYRNLLWLTXKXGXYPXLSXSYXNXKXKEVLVLWGVHHPXNrXDQXXXYXXENAYVSVVSSXYXRXFTPEIAXRPKVRXQXGRXNYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPXYAFALSRGFGSGIITSNAXMXECDXKCQTPQGAINSSLPFQNXHPVTIGECPKYVRSXKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMXDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNXLEXRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKXQLXNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
在本发明所公开的一些实施方案中，HA多肽缺少N末端蛋氨酸残基。因此，在一些实施例中提供了包括SEQ ID NO：1-5和8中的任一序列的残基2-566或包括SEQ ID NO：6残基2-565的HA多肽。
COBRA氨基酸序列可以被反向翻译，和优化在哺乳动物细胞中的表达，包括密码子的使用和RNA的优化(GeneArt；Regensburg，德国)。优化的核酸序列可以插入适合的表达载体中，如pTR600表达载体(美国专利申请公开号2002/0106798；Ross等，Nat Immunol.1(2)：102-103，2000；Green等，Vaccine 20：242-248，2001)。
V.流感
流感病毒是分段的负股RNA病毒，属于正粘病毒科。有A、B和C3个型。A型流感病毒感染多种多样的鸟类和哺乳动物，其中包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡类。在动物中，大多数A型流感病毒引起呼吸道和肠道的轻度局部感染。然而，高病原性的A型流感毒株，如H5N1，在家禽中可以引起全身性的感染，并且死亡率可以达到100％。感染A型流感病毒的动物经常成为流感病毒的储存容器，并且某些亚型表现出可以穿过物种屏障传染给人。
A型流感病毒可以根据编码表面糖蛋白的两个基因的抗原性区域的等位 基因变异来划分亚型，所述表面糖蛋白也就是，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，它们对于病毒附着和细胞释放都是所需的。目前A型流感病毒已知有16个HA(H1-H16)亚型和9个NA(N1-N9)抗原性变体。过去，已知只有3个亚型在人类间传播(H1N1、H1N2和H3N2)。然而，在最近几年，A型禽类流感病毒的致病性H5N1亚型已被报道可以穿过物种屏障而传染给人类，如1997年和2003年在香港所记录的，导致了许多患者的死亡。
在动物中，大多数A型流感病毒引起呼吸道和肠道的轻度局部感染。然而，高病原性的A型流感毒株，如H5N1，在家禽中可以引起全身性的感染，并且死亡率可以达到100％。在2009年，H1N1流感是引起人类流感的最普遍原因。在2009年，出现了猪源的H1N1新毒株，并被世界卫生组织公布为流行病，这一毒株称为“猪流感”。H1N1A型流感病毒也是引起1918年西班牙大流感、1976年Fort Dix所爆发的流感以及1977-1978年俄罗斯流感传染病的原因。
A型流感病毒基因组编码9个结构蛋白和具有调节功能的一个非结构(NS1)蛋白。流感病毒的节段基因组含有8个反义RNA(nsRNA)基因片段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)，这些反义RNA基因片段编码至少10种多肽，包括RNA指导的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(亚基HA1和HA2)、基质蛋白(M1和M2)以及非结构蛋白(NS1和NS2)(Krug等，In“The Influenza Viruses，”R.M.Krug，ed.，Plenum Press，N.Y.，1989，pp.89-152)。
流感病毒具有引起广泛传播的疾病的能力，这是由于其具有通过进行抗原性改变而躲避免疫系统的能力，这种情况被认为在宿主同时感染动物流感病毒和人流感病毒时发生。病毒在宿主体内发生突变和基因重排的过程中，病毒可以将来自于另一种病毒的HA和/或NA表面蛋白基因并入到它自己的基因组上，从而产生新的流感亚型并且躲避免疫系统。
HA是病毒表面糖蛋白，其通常包括约560个氨基酸，占总病毒蛋白的25％。它主要负责在感染的早期阶段使病毒粒子附着宿主细胞和侵入到宿主细胞。为了使病毒感染细胞，病毒HA0前体裂解为HA1和HA2两个子片段是必需的步骤。因此，这种裂解是所需的，以在宿主细胞中使新的病毒粒子转化成可感染新细胞的病毒粒子。裂解已知在完整的HA0膜蛋白从感染细胞的内质网运输到质膜时发生。在运输过程中，血凝素经历了一系列的共翻译 和翻译后修饰，包括前体HA前体蛋白经蛋白水解裂解为氨基末端片段HA1和羧基末端HA2。使流感毒株在主要的组织培养中或在建立的细胞系中生长的主要困难之源自于需要对宿主细胞中的流感血凝素进行蛋白水解裂解的活化。
虽然未裂解的HA可在细胞表面上介导病毒对含神经氨酸的该病毒受体的附着是已知的，但未裂解的HA不能进行感染周期的下一步骤，也就是融合。据报道，通过裂解使HA2的疏水性氨基末端暴露是必需的，以便可以将其插入到靶细胞中，从而形成病毒与靶细胞膜之间的桥梁(bridge)。这个过程之后就是两个膜的融合以及病毒进入靶细胞。
HA蛋白水解活化涉及依靠胰蛋白酶样的内切蛋白酶在精氨酸残基处进行裂解，该胰蛋白酶样内切酶往往是一种细胞内的酶，其对钙有依赖性以及具有中性的pH最佳值。由于所述活化蛋白酶是细胞酶，所以被感染的细胞类型决定了HA是否被裂解。哺乳动物流感病毒的HA和非致病性禽流感病毒仅在有限数目的细胞类型中是易受蛋白水解裂解的。另一方面，在H5和H7亚型中的致病性禽流感病毒的HA由存在于广泛的不同宿主细胞中的蛋白酶所裂解。因此，存在宿主范围上的差异，该宿主范围上的差异是由与病毒致病性相关的血凝素的裂解性差异所导致的。
神经氨酸酶(NA)是流感病毒的第二膜糖蛋白。病毒NA的存在已被证明对于产生针对感染病毒的多面的保护性免疫应答是重要的。对于大多数的A型流感病毒，NA有413个氨基酸的长度，并由具有1413个核苷酸的基因编码。在流感病毒中，已确定了有9个不同的NA亚型(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9)，它们全部都是在野生的鸟类中发现的。NA通过自感染细胞表面的碳水化合物部分裂解末端神经氨酸(也称作唾液酸)残基，而参与病毒HA的细胞受体的破坏。NA也自病毒蛋白裂解唾液酸残基，来阻止病毒的聚合。利用这一机制，假设NA通过阻止新近形成的病毒粒子沿着细胞膜累积，以及通过在粘膜表面上的粘液来促进病毒的运输，可以促进病毒后代的释放。NA是经受抗原性变异的重要的抗原决定簇。
除表面蛋白HA和NA外，流感病毒还包括6个额外的内部基因，其产生8种不同的蛋白，包括聚合酶基因PB1、PB2和PA，基质蛋白M1和M2，核蛋白(NP)，以及NS1和NS2两个非结构蛋白(Horimoto等，Clin Microbiol Rev.14(1)：129-149，2001)。
为了封装成子代病毒粒子，病毒RNA作为由3个流感病毒聚合酶蛋白、核蛋白(NP)、和与流感病毒基质蛋白1(M1)和核输出蛋白相关的病毒RNA所构成的核糖核蛋白(RNP)复合物从细胞核被运输(Marsh等，J Virol，82：2295-2304，2008)。位于包膜中的M1蛋白被认为在装配和出芽中起作用。有限数量的M2蛋白融合入病毒粒子中(Zebedee，J.Virol.62：2762-2772，1988)。它们形成具有H⁺离子通道活性的四聚体，并且在通过核内体内的低pH值进行活化时，酸化病毒粒子的内部，促进其脱壳(Pinto等，Cell 69：517-528，1992)。金刚烷胺是抗流感病毒的药物，其通过干扰M2离子通道的活性，从而抑制病毒的脱壳来防止病毒感染。
NS1蛋白是非结构蛋白，具有多种功能，包括调节细胞的mRNA的剪接和核输出，以及刺激翻译。NS1的主要功能似乎是是抵消(counteract)宿主的干扰素活性，因为敲除NS1的病毒可以存活，尽管它们与亲本病毒相比，在干扰素-非缺陷细胞中低效生长(Garcia-Sastre，Virology 252：324-330，1998)。
在病毒粒子中检测到了NS2(Richardson等，Arch.Virol.116：69-80，1991；Yasuda等，Virology 196：249-255，1993)。在病毒粒子中的NS2蛋白平均数量估计为130-200个分子。体外结合实验表明了M1和NS2之间的直接蛋白接触。NS2-M1配合物在感染病毒的细胞的裂解物中通过免疫沉淀方法被检测。NS2蛋白通过与M1蛋白的相互作用，被认为对自细胞核的RNP输出起着重要的作用(Ward等，Arch.Virol.140：2067-2073，1995)。
六、流感VLP及其施用
本文提供了流感VLP，其包括优化的HA(如具有阐明为SEQ ID NO：1-8中的任一个的氨基酸序列的HA)。流感VLP通常由HA、NA和M1蛋白组成。在现有技术中已经描述了流感VLP的生成，并且流感VLP的生成也在本领域技术人员的能力范围内。例如流感VLP可以通过以编码HA、NA和M1蛋白的质粒转染宿主细胞来产生。在以允许蛋白质表达的合适的时间(如大约72小时)孵育转染的细胞之后，VLP可以从细胞培养上清液中分离。下面的实施例2提供了一个示例性的从细胞上清液中纯化流感VLP的程序。在这个实施例中，通过低速离心法分离(以去除细胞碎片)、真空过滤和使用20％的甘油的超高速离心来分离VLP。
本发明公开的流感VLP可以用作流感疫苗，以引起对H1N1流感病毒的 保护性免疫应答。
流感VLP或其组合物，可以以任一通常用于将重组病毒引入受试对象的途径来向受试对象施用。施用的方式包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、肠胃外、静脉内、皮下、阴道、直肠、鼻内、吸入或口服。胃肠外施用，如皮下、静脉内或肌肉内，一般是通过注射来完成。注射剂可以制成常规的形式，或者是作为液体溶液或悬浮液、适合在注射前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式，或者是作为乳剂。注射溶液和悬浮液可以从之前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。施用可以是全身的或局部的。
流感VLP及其组合物，可以以任何合适的方式施用，如与药学上可接受的载体一起施用。药物学上可接受的载体部分地取决于所施用的特定组合物，以及施用组合物的特定方法。因此，存在各种各样的本发明的药物学组合物的合适剂型(formulations)。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬剂(suspensions)和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、含乙醇的/水性的溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。注射用载体包括氯化钠溶液、Ringer葡萄糖、葡萄糖和氯化钠，乳酸Ringer葡萄糖或不挥发性油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于Ringer葡萄糖的补充剂)和类似物。防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等。
一些组合物可以潜在地被施用为药物上可接受的酸加成盐或碱加成盐而，所述酸加成盐通过与无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)、以及有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸和富马酸)的反应来形成，所述碱加成盐通过与无机碱如(氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)，以及有机碱如单、双、三烷基胺、芳基胺和取代的乙醇胺的反应来形成。
可以通过单剂量或多剂量来完成施用。在本发明的上下文中，施用于受试对象的剂量应足以在一段时间内在受试对象体内充分地引起有益的治疗应答，或抑制或阻止H1N1流感病毒的感染。所需的剂量会随着受试对象而变化，依据受试对象的物种、年龄、体重以及受试对象的整体情况，所治疗的感染的严重程度，所使用的特定组合物和其施用方式而定。本领域技术人员 可以仅通过常规实验来确定合适的剂量。
本发明提供了药物组合物，该药物组合物包括单独的治疗有效量的流感VLP或者流感VLP与药物学上可接受的载体的组合。药物学上可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。载体和组合物是无菌的，并且剂型适合施用方式。该组合物也可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。该组合物可以是液体溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。该组合物可以配制成栓剂，其具有传统的粘合剂和载体如甘油三酯。口服制剂可包含标准的载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、和碳酸镁等。任何常见的药物载体，如无菌盐水溶液或芝麻油，都可以使用。该介质还可以包含常规的药物辅助材料，例如，调节渗透压的药物学上可接受的盐、缓冲液、和防腐剂等。可用于与本发明所提供的组合物和方法一起使用的其它介质是生理盐水和芝麻油。
本发明所描述的流感VLP可以单独施用或与其它治疗药剂组合使用，以提高抗原性。例如流感VLP可以与佐剂如弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂一起施用。
可选择地，一种或多种细胞因子，如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ，一种或多种生长因子，如GM-CSF或G-CSF；一种或多种分子，如OX-40L或41BBL，或者这些分子的组合，可以作为生物佐剂使用(例如见Salgaller等，1998，J.Surg.Oncol.68(2)：122-38；Lotze等，2000，Cancer J.Sci.Am.6(Suppl 1)：S61-6；Cao等，1998，Stem Cells 16(Suppl 1)：251-60；Kuiper等，2000，Adv.Exp.Med.Biol.465：381-90)。这些分子可以全身地(或局部)施用于宿主。
用于在体内和体外诱导细胞应答的许多方式是已知的。脂质被认为是能够在体内针对各种抗原辅助诱导CTL的试剂。例如，如美国专利号5,662,907所述，棕榈酸残基可以连接到赖氨酸残基的α和ε氨基基团上，然后(例如通过一个或多个连接残基，例如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)连接到免疫原性肽上。脂质化肽可以随后以胶束形式直接注入，所述胶束形式被脂质体所包裹、或在佐剂中被乳化。作为另一实例，大肠杆菌脂蛋白，例如当三棕榈酰基-S-丙三基半胱氨丝氨酰-丝氨酸连接在合适的肽上时，可用于引发肿瘤特异性CTL(见Deres等，Nature 342：561，1989)。此外，当用 偶联到显示合适的表位的肽上的相同的分子也能引发对中和抗体的诱导时，可以将两种组合物结合来同时引发体液和细胞介导的应答，这被认为是理想的。
虽然本发明举例说明了施用含有优化的HA蛋白的VLP，但本领域技术人员也可以理解的是，也可以施用优化的流感HA蛋白本身(在病毒粒子不存在的情况下)或作为融合蛋白施用在受试对象内引起免疫应答。
下面提供的实施例用于对某些特定的特征和/或实施方案进行说明。这些实施例不应被认为是将本公开限制于所描述的特定特征或实施方案。
实施例
实施例1：H1N1流感的COBRA序列的生成
从NCBI流感病毒资源数据库下载A型流感H1N1 HA的氨基酸序列。使用1918-2012的H1N1 HA蛋白分离物生成共有序列。使用下面的方法生成了7种不同的共有序列(SEQ ID NO：1-7)。
1.COBRA方法X-1(1918-2012)
根据分离日期对序列进行组织，并利用来自1918-1934(8)、1935-1947(13)、1948-1957(12)、1977-1983(69)、1984-1991(19)，1992-1999(59)、2000-2006(339)、2007-2008(722)和2009-2012(207)的分离物生成9个一级共有序列。利用来自组1948-1957、1977-1983和1984-1991的3个主要共有层，生成来自1948-1991的分离的病毒的第二层共有序列。如图2所示，最后的共有序列(第三层；SEQ ID NO：1)是通过比对6个一级层共有序列(1918-1934、1935-1947、1992-1999、2000-2006、2007-2008和2009-2012)和第二层共有序列(1948-1991)而生成的。
2.COBRA方法X-2(1933-1947)
根据分离日期对序列进行整理，以生成3个一级共有序列：1933-1936(11)、1940-1946(8)和1947(1)。最后的共有序列(SEQ ID NO：2)是通过比对3个一级共有序列而生成，如图2所示。
3.COBRA方法X-3(1978-2008)
根据分离日期对序列进行整理，并利用来自1978-1983(65)、1984-1991(19)、1992-1999(59)、2000-2006(339)和2007-2008(722)的病毒分离物生成5个一级共有序列。利用来自1978-1983组和1984-1991组的2个主要共有序列层，生成了来自1978-1991的分离的病毒的第二层共有序列。如图3 所示，最后的共有序列(SEQ ID NO：3)是通过比对3个一级层共有序列(1992-1999、2000-2006和2007-2008)和第二层共有序列(1978-1991)而生成的。
4.COBRA方法X-4(1918-2005)
根据分离日期对序列进行整理，并利用来自1981-1934(8)、1935-1947(13)、1948-1957(12)、1997-1983(68)、1984-1986(9)、1987-1991(12)、1992-1999(59)和2000-2005(263)的分离物生成8个一级共有序列。生成了两个第二层共有序列(1981-1957和1978-1991)。利用来自1918-1934组、1935-1947组和1948-1957组的3个主要共有层，生成了1981-1957的第二共有序列。利用来自1977-1983组、1984-1986组和1987-1991组的3个主要共有层，生成了1978-1991的第二共有序列。如图4所示，最后的共有序列(SEQ ID NO：4)是通过比对2个主要的层共有序列(1992-1999和2000-2005)和2个第二层共有序列(1918-1957和1978-1991)来生成的。序列在142和177位点上去糖基化。
5.COBRA方法X-5(1982-2012)
根据分离日期对序列进行整理，并利用来自1982-1983(4)、1984-1986(9)、1987-1991(12)、1992-1999(27)、2000-2006(339)、2007-2008(722)和2009-2012(207)的分离物生成7个主要的共有序列。利用1982-1983组和1984-1986组的2个主要共有层，生成了一个第二层共有序列(1982-1986)。如图5所示，最后的共有序列(SEQ ID NO：5)是通过比对5个主要层共有序列(1987-1991、1992-1999、2000-2006、2007-2008和2009-2012)和第二层共有序列(1982-1986)来生成的。
6.COBRA方法X-6(1999-2012)
根据分离日期对序列进行整理，以生成4个主要的共有序列：1995(5)、2000-2006(339)、2007-2008(722)和2009-2012(207)。最后的共有序列(SEQ ID NO：6)是通过比对4个主要的共有序列而生成的，如图6所示。
7.COBRA方法A-5(1918-2008)
根据分离日期对序列进行整理，并利用来自1981(1)、1976(4)、2009-2011(123)、1933-1934(8)、1935-1947(13)、1948-1957(12)、1977-1983(68)、1984-1986(9)、1987-1991(12)、1992-1999(27)、2000-2005(59)和2006-2008(798)的分离物生成12个一级共有序列。通过参考“猪”序列或通过日期(1993-1957、1977-2005和2006-2008)对一级共有序列进行分组，来生成4个二级共有序列，如图7所示。最后的共有序列(第三层共有序列；SEQ ID NO：7)是通过比对4 个二级共有序列来生成的。
根据上述两种方法中任何一种所生成的COBRA氨基酸序列可以被逆向翻译，并且可以针对其在哺乳动物细胞中的表达进行优化，包括密码子的使用和RNA优化(GeneArt；Regensburg，德国)。优化的核酸序列可以插入pTR600表达载体中(美国专利申请公开号2002/0106798；Ross等，Nat Immunol.1(2)：102-103，2000；Green等，Vaccine 20：242-248，2001)，或任何用于表达的其他合适的载体。
实施例2：制备流感VLP并用其免疫接种
下面的方法可以用于生产和表征包括优化的HA的流感VLP。对于小鼠、雪貂和恒河猴进行免疫接种的示例性方法如下所述(见Giles and Ross，Vaccine 29(16)：3043-3054，2011)。
疫苗制备
将表达M1，NA和优化的HA的质粒瞬时转染到293T细胞中，在37℃孵育72小时。针对在哺乳动物细胞中表达，M1、NA和HA的编码序列可以进行密码子优化。收集上清液，通过低速离心去除细胞碎片，接下来通过0.22μm的无菌滤器真空过滤。在4℃下经由超速离心(1000,000×g，通过20％甘油，单位体积重量)纯化VLP 4小时。随后用pH7.2的PBS重悬微球(pellets)，并以单次使用等分部分存储在-80℃直到下次使用。通过Micro BCA^TM蛋白分析试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)确定总蛋白浓度。
剂量确定
HA具体含量可以通过蛋白质印迹法和密度测定法确定。纯化的重组COBRA HA和纯化的VLP以标准的总蛋白量来制备，并在10％SDS-PAGE凝胶上电泳，然后转移到PVDF膜上。利用来自于感染流感病毒的小鼠的鼠多克隆抗血清和HA抗体复合物检测印迹，并通过偶联到辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗鼠IgG(Southem Biotech；Birmingham，AL，USA)检测HA抗体复合物。HRP可以通过化学发光底物检测(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)并曝光成X射线胶片(ThermoFisher；Pittsburgh，PA，USA)。条带的密度用ImageJ软件(NIH)确定。重组HA条带的密度用标准曲线来计算，并且利用来 自重组HA的结果内推纯化的VLP的密度。
小鼠试验研究
BALB/c小鼠(家鼠，雌性，6-8周龄)从Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN，USA)购买。小鼠安置于微隔离器(microisolator)单元中，并允许自由获得食物和水，并根据实验动物的USDA准则进行照顾。基于来自密度测定的HA含量，对小鼠用3个剂量之一的纯化COBRA HA VLP(1.5μg、0.3μg或0.06μg)进行免疫接种，在第0周通过肌肉注射对小鼠进行免疫接种，并在第3周用同样的剂量再接种。每种剂量的疫苗都单独与明矾佐剂(Imject Alum，Pierce Biotchnology；Rockford，IL，USA)、CpG寡核苷酸或介质一同配制。在每一次疫苗接种后的第14-21天，通过麻醉后小鼠的眼眶后丛(retro-orbital plexus)采集血液样本，并转入微离心管中。对血液进行离心，并将血清移出冻存于-80±5℃。在第5周，用典型的重组病毒或COBRA HA VLP对每一个疫苗组的血凝抑制血清抗体的效价进行确定。
在最后一次接种后的第三周，用50μl的体积的高致病性H1N1病毒对小鼠进行鼻腔攻毒。在感染后的14天内每日监测感染后小鼠的体重减少，病情迹象和死亡。在接种后每日对每组按个体体重、疾病评分(Toapanta and Ross，Respiratory Research 10(1)：112，2009)和死亡进行记录。
雪貂试验研究
未接种流感和除味的惠誉雪貂(雪貂(Mustela putorius furo)，雌性，6-12月龄)可以从Marshll Farms(Sayre，PA，USA)购买，雪貂成对安置于含有sani-chips实验动物垫料(P.J.Murphy Forest Products，Montville，NJ，USA)的不锈钢笼(Shor-line，Kansas City，KS，USA)中，并提供Teklad Global公司的雪貂食物(Harlan Teklad，Madison，WI，USA)和不限量的洁净水。用pH 7.2的PBS稀释COBRA HA VLP至达到终浓度。基于如通过密度测定实验所测定的HA含量，在第0周，以纯化的COBRA VLP(15μg，3μg)的两个剂量之一以0.25ml的体积在股四头肌处进行肌肉注射而对雪貂进行疫苗接种，并在第3周用同样的剂量再接种。疫苗在使用前存储在-80℃并在使用前与明矾佐剂(Imject Alum，Pierce Biotchnology；Rockford，IL，USA)现配制。在接种疗程的过程中，每周对动物不良反应进行监控，包括体重减少、体温、活动的减少、流鼻涕、 喷嚏和腹泻。在疫苗接种前，通过HAI试验确定动物对循环性A型流感病毒和B型流感病毒为血清反应阴性的。每一次疫苗接种后的第14-21天，通过前腔静脉采集麻醉雪貂的血液，并转移至微型离心管中。随后对血液进行离心，将血清移出冻存于-80±5℃。在第5周，利用典型的重组病毒或COBRA HA VLP确定每个疫苗组的HAI血清抗体的效价。
最后一次接种后的三周后，用1ml的高致病性的H1N1病毒对小鼠进行鼻腔攻毒。在感染后，在感染后的14天内每日监测雪貂的体重减少、疾病症状和死亡。在接种后每日对每组按个体体重、疾病评分和死亡进行记录。在接种后，持续7天每日用3ml PBS滴入麻痹雪貂的鼻孔进行鼻腔清洗，并收集洗液存储在-80℃直到下次使用。
灵长类动物的免疫
食蟹猴(食蟹猴，雄性，3-5岁)可以从Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN，美国)购买。根据密度测定实验确定的HA含量，用纯化的COBRA HA VLP(15μg)通过静脉注射在第0周对食蟹猴进行疫苗接种，并用同样的剂量分别在第3和第6周再次接种。疫苗在即将使用前与明矾佐剂(Imject Alum，Pierce Biotchnology；Rockford，IL，USA)即刻配制。每次免疫接种后的第21日，通过股静脉从麻醉的猕猴采集血液，并转移至微型离心管中。使管激活凝血，随后对血液进行离心，将血清移出冻存于-80±5℃。在第5周，用典型的重组病毒或COBRA HA VLP确定每个疫苗组的IgG终点效价和HAI血清抗体效价。
最后一次接种后的第三周，用1ml的高致病性的H1N1病毒通过鼻内、气管和眼眶对食蟹猴进行攻毒。在感染后的5天内每日监测感染后食蟹猴的体重减少，疾病症状和死亡。在接种后每日对每组按个体体重、疾病评分和死亡进行记录。
实施例3：在用含COBRA HA的VLP对小鼠免疫接种后的HAI的研究
按照实施例2所述生成含COBRA HA的流感VLP。对雌性的BALB/c小鼠(6-8周龄)肌肉接种3μg VLP，所述VLP含方法X-1(SEQ ID NO：1)、方法X-2(SEQ ID NO：2)、方法X-3(SEQ ID NO：3)、方法X-4(SEQ ID NO：4)、方法X-5(SEQ ID NO：5)或方法X-6(SEQ ID NO：6)的COBRA HA。小鼠在第 0周接种(首剂量)，在第4和第12周升高剂量。疫苗与明矾佐剂(ImjectAlum，Pierce Biotechnology；Rockford，IL，USA)一起配制。在第0、4、8、12和14周，经麻醉后的小鼠的眼眶后丛静脉采集血液样本。在第14周确定对流感病毒群组的血凝抑制效价(HAI)，同样在第14周对小鼠用致病性H1N1病毒进行鼻腔攻毒。
在第14周确定HAI血清抗体对H1N1流感毒株群组(Puerto Rico/8/1934、Fort Monmouth/1/1947、Brazil/1978、Chile/1983、Singapore/6/1986、Texas/36/1991、Beijing/1995、New Caledonia/20/1999、Solomon Island/2006、Brisbane/59/2007和California/07/2009)的效价。结果如图9A-9F所示。
考虑到所公开的原发明的原理则可用在许多可能的实施方案中，应当认为所说明的实施方案仅是本发明的优选实施例，而不是对本发明范围的限制。相反地，本发明的范围由随后的权利要求限定。因此我们要求将在这些权利要求的范围和精神之内的所有内容作为我们的发明加以保护。