具有光聚合溶胶-凝胶组分的分离柱和相关的方法 本发明的领域
本发明一般地涉及分离柱，和特别地涉及包括光聚合溶胶-凝胶组分的分离柱和相关的方法。
本发明的背景
在过去的十年中，毛细管区带电泳(CZE)，以它的高的峰容量(即每单位时间分离的峰的数目)，已经发展成利用它们的电泳淌度来分离离子物质的有效的和广泛使用的技术。在CZE中对于未带电荷的被分析物的选择性的缺乏仍然是有问题的。已经开发了几种方法，如胶束的动电学色谱分析(MEKC)，可通过提供假静止相(其中未带电荷的化合物能够被分离)有助于克服这一问题。MEKC之类的方法的应用是受限制的，因为能够用于该技术中的假静止相地有限数量。
随着毛细管电色谱法(CEC)的到来，其中结合了色谱分析和电泳转运机理，能够以高的拆分和效率使用低样品体积来实现未带电荷的被分析物的混合物的分离和分析。CEC在分析应用中的更多兴趣归因于所实现的大的板数和较高分离速度和所能够使用的宽范围的静止相(通常用于高效液相色谱中的那些)。
虽然CEC已经用于许多不同领域，但是填充柱制备和低的探测灵敏度使这一技术面临挑战。含有小的硅石填充物的毛细管柱已经成为CEC的主要依靠。填充柱的一个缺点是具有控制的孔径、长度和高的机械稳定性的多孔熔结玻璃料(frit)的制造。虽然与熔结玻璃料对此类毛细管性能的影响有关的系统研究还没有报导，但是应该认为这些熔结玻璃料能够降低这些毛细管柱的效率。
尽管如此，当分离柱需要使用熔结玻璃料的填充材料时，仍然希望具有简单和可再现的制造熔结玻璃料的程序。用于颗粒填充柱的熔结玻璃料制造的常规方法包括填充材料如十八烷基硅石微粒(ODS)的区段的热烧结。这一方法具有几个缺点，包括(1)可靠地和可再现地生产熔结玻璃料的困难，(2)在熔结玻璃料本身中静止相的特性的改变，(3)控制熔结玻璃料的孔隙度的困难，(4)在熔结玻璃料的位置处该毛细管的薄弱，(5)由熔结玻璃料引起的谱带增宽，(6)在熔结玻璃料上气泡形成和极性被分析物的吸附。这些问题能够直接影响柱性能和柱-到-柱的可再现性。
另一种方法已经被报道用于毛细管柱的制备，它避免了与淤浆和动电学填充物有关的熔结玻璃料制造和柱制造的技术问题。一种方法使用结合的静止相。然而以这种方式制备的毛细管柱会遇到低的保留率和低的样品容量和长的制备时间。用于开口毛细管柱的制备的另一种方法使用整体单段的(monolithic)填充技术。例如，已经描述了装载了以溶胶-凝胶化学为基础的色谱分析的颗粒的整体单段型多孔毛细管柱的制备和表征(参见，例如，Dulay等人，Anal.Chem.，70，5103-5107页，1998)。整体单段型毛细管柱已经受到很多的关注，因为在渗透性和表面电荷的控制中所获得的优点。
在CEC技术中的主要挑战是含有低浓度的被分析物的样品的检测。在低浓度下的敏感性的缺乏归因于小的样品容积和在线检测的短的光程长度。在样品注入之前富含目标被分析物的专用样品制备历程常常是为了获得许多现实世界分析的必要敏感性所需要的。历程如溶剂-溶剂萃取和固相萃取常常是非常乏味的和耗时的。
这些历程的替代是在线预浓缩。在气相色谱中，这一目标通过让气流通过冷柱(随后加热)来实现。在高性能液相色谱(HPLC)中，这一工艺通常利用梯度HPLC来进行，其中对于第一种溶剂与对于后继的溶剂相比，被分析物更加强烈地保留在柱上。在线的预浓缩也享受着在电泳分离中的一些成功。例如，在毛细管电泳(CE)中，这些包括等速电泳，样品堆积，清扫，和动态pH交点的使用。在CZE中，已经说明在样品和背景溶液区域之间的电场强度的变化能够聚集(即堆积)带电荷的物质(参见，例如，F.E.P.Mikkers，F.M.Everaerts，P.E.M.Verheggen，J.Chromatogr.169(1979)，pp.1-10和R.L.Chien，D.S.Burgi，Anal.Chem.64(1992)pp.489A-496A)。在动电学色谱分析中，已经显示胶束能够用于浓缩(即清扫)中性和带电荷的物质(参见，例如，J.P.Quirino，S.Terabe，Science，282(1998)pp.465-68和J.P.Quirino，S.Terabe，Anal.Chem.71(8)(1999)pp.1638-44)。
在使用颗粒(例如，十八烷基硅石)填充柱的CEC中，已经报道了与在梯度高效液相色谱法中类似的聚集效应。这些聚集效应通过使用(1)分步梯度洗脱，(2)在非洗脱溶剂中的样品的制备，或在样品注入之后水栓的注射，来实现。M.R.Taylor，P.Teale，D.Westwood，D.Perrett，Anal.Chem.69(1997)pp.2554-58最先于1997年报道了分步梯度在甾族样品的预浓缩中的应用。D.A.Stead，R.G.Reid，R.B.Taylor，J.Chromatogr.A 798(1998)pp.259-67利用使用非洗脱样品基体(matrix)的预浓缩来实现了甾族化合物的混合物的检测灵敏度的17倍增加。Y.Zhang，J.Zhu，L.Zhang，W.Zhang，Anal.Chem.72(2000)pp.5744-47也使用非洗脱溶剂分别将苯偶姻和乙基苯基-N-甲基-乙内酰脲预浓缩134和219的因数。C.M.Yang，Z.El Rassi，Electrophoresis 20(1999)pp.2337-42报道了通过使用在长栓塞的样品之后所注射的短栓塞的水，对杀虫剂的稀释样品的预浓缩。M.J.Hilhorst，G.W.Somsen，G.J.de Jong，Chromatographia 53(2001)pp.190-96说明了通过使用非洗脱基体和分步梯度洗脱，对在结构上相关的甾族化合物的预浓缩。报道在敏感性上获得了7到9倍的增加。类似地，T.Tegeler，Z.El Rassi，Anal.Chem.73(14)(2001)pp.3365-72最近刚刚报道了通过联合使用非洗脱基体和分步梯度洗脱，在氨基甲酸酯类杀虫剂的混合物中被分析物的预浓缩。最高允许样品栓塞长度是大约20cm和对于虫螨威(carbofuran)实现了500倍的敏感性提高。由张(Zhang)的同事实现了检测灵敏度的进一步提高，它将电场增强的样品注射与溶剂梯度洗脱相结合。他们说明了在带正电荷的被分析物，propatenene，的峰高度上的17,000倍增加。
所以希望能够容易地制造具有相对于前述方法而言有改进性能的分离柱。
本发明概述
根据本发明的实施方案，分离柱包括分离通道和在通道中的多孔基体。多孔基体包括金属有机光聚合物。在这一实施方案中，多孔基体优选不包含色谱分析的颗粒和一般是均匀的。在本发明的实施方案中，该分离柱可以包括毛细管柱。
在本发明的另一个实施方案中，多孔基体能够包括被设计来将分离介质保留在通道中的熔结玻璃料。该熔结玻璃料能够具有可控孔隙率和能够从可光致固化的、甲基丙烯酸酯取代的硅酸盐形成。因为光聚合反应一般利用辐射来引发，熔结玻璃料的位置能够定位和该孔隙度可再现地控制。
在本发明的又一个实施方案中，多孔基体可以包括分离介质，后者被设计来预浓缩和分离被分析物，没有色谱分析的颗粒的存在。该分离介质可以是非熔结玻璃料(fritless)。可以相信，该分离柱允许预浓缩和分离出比使用色谱分析的颗粒的分离柱更大体积的被分析物。
本发明进一步包括制备分离柱的方法。根据本发明的方法的一个实例，混合物是被引入毛细管柱。混合物包括金属有机化合物。混合物在毛细管柱中经过辐射而利用光引发聚合反应来形成固体多孔基体。在这一实施方案中，多孔基体优选不包含色谱分析的颗粒。没有色谱分析的颗粒的分离柱的制备是比制备有色谱分析的颗粒的分离柱相对容易。
制备多孔基体的光化学途径具有许多优点：(1)短的制备时间，(2)孔隙大小的控制，(3)多孔基体的键接和长度的控制，(4)高的机械强度，和(5)导致开裂的高温的避免。
本发明也包括分离被分析物样品的方法。根据本发明的实施方案，该方法首先提供包括分离通道和位于分离通道中的分离介质的分离柱。该分离介质包括多孔基体，和多孔基体是由金属有机光聚合物形成和优选不包含色谱分析的颗粒。接着，在溶液中携带的被分析物样品通过该柱。该分离介质将被分析物预浓缩在柱中。然后溶液被引起流过该分离柱，因此分离并洗脱该被分析物。该分离介质既预浓缩又分离该被分析物。除了由分离介质所发挥的作用之外，预浓缩能够进一步通过溶剂梯度或样品堆积来增强。
附图的简述
在结合附图阅读下面的详细说明之后，本发明的以上和其它特征和方面将变得更清楚，其中：
图1A是根据本发明的实施方案的分离柱的剖视图；
图1B是分离柱的透视示意图，其中多孔基体用作根据本发明的实施方案的分离介质；
图1C是分离柱的透视示意图，其中多孔基体作为被设计来保留根据本发明的实施方案的分离介质的两种熔结玻璃料来使用；
图2A和2B是使用本发明的实施方案的两个代表性的电色谱图，显示了(a)一根柱和(b)另一根柱的吸收率/保留时间的曲线；
图3是显示了使用本发明的实例的吸收率/保留时间的曲线的代表性色谱图；
图4A和4B是本发明的实施方案的SEM显微照片；
图5A和5B是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了不同被分析物的吸收率/保留时间的曲线；
图6是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图7(a和b)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图8(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图9(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图10是显示使用本发明的实施方案的峰高比的对数对样品中水的百分比的曲线的图示；
图11(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图12A，12B和12C是显示使用本发明的实例的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
图13(a和b)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图14(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图15(a，b，c，d，e，和f)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图16(a和b)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图17(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
图18是根据本发明的实施方案制备的出口熔结玻璃料的SEM显微照片；
图19是根据本发明的实施方案制备的进口熔结玻璃料的SEM显微照片；
图20是根据本发明的实施方案制备的毛细管的填充段的截面的显微照片；
图21A和21B是分别在填充柱和整体单段式柱上的NBD-DL-丙氨酸(Ala)和NBD-DL-苏氨酸(Thr)的样品的电色谱；
图22是在填充多段式柱上NBD-DL-Phe的电色谱；
图23是使用大内径毛细管的硫脲和5种烷基苯基酮类的分离的电色谱；
图24是使用大内径毛细管的硫脲和丙酰苯的分离的电色谱；
图25是使用大内径毛细管的硫脲和丙酰苯的分离的第二个电色谱；
为了描述的简单起见，同样的符号用于在本申请中同样或相似的部分。
详细说明
具有光聚合溶胶-凝胶(PSG)组分的分离柱
图1A是根据本发明的实施方案制备的分离柱11的纵向剖视图。该分离柱11包括在毛细管柱12内的分离通道13，和在分离通道13内的多孔基体15。在本发明的不同实施方案中，分离柱11能够采取不同的形式，包括但不限于另一种类型的管或平面片，并且能够进一步包括检测窗口。
毛细管柱12能够具有许多不同的横截面，其中包括但不限于圆截面。在另一个实施方案中，毛细管柱12能够具有伸长的横截面。这些和其它横截面对于毛细管柱12是可能的并且是在本发明的范围内。毛细管柱12能够是典型地由熔凝硅石制造的圆形毛细管。毛细管的内径(i.d.)能够是约10μm到约1000μm，和更可能在75μm到500μm范围。正如所指出的那样，毛细管柱12能够另外是平面片或限定空间，如由两个片所限定而成的柱。
根据本发明的实施方案，多孔基体15能够用于许多不同应用中。在一个实施方案中，在图1B中所示，多孔基体15作为被设计来预浓缩和/或分离被分析物的分离介质20来使用。在这一实施方案中，多孔基体15倾向于包括一般均匀的较长的和连续的结构。正如这里所使用的，术语“整体单段(monolith)”是指用作分离介质的较长和连续的多孔基体15。
在另一个实施方案中，在图1C中所示，多孔基体15作为被设计来将分离介质保留在分离通道13内的熔结玻璃料22来使用。一般，两种熔结玻璃料22用于保持该分离介质，一种在进口熔结玻璃料中和另一种是出口熔结玻璃料。在这一实施方案中的分离介质(在图1C中未显示)能够包括许多材料，其中包括但不限于填充的、球形的ODS颗粒或手性颗粒。在图1C中该颗粒位于熔结玻璃料22之间。在这一实施方案中，多孔基体15倾向于包括较短的结构，当与图1B的实例对比时，其中多孔基体15用作实际分离介质20本身。
在又一个实施方案中，多孔基体15作为固相萃取材料来使用。在这一类型的使用的一个实例中，多孔基体15能够用于将蛋白质与生物材料样品中的盐分离。这是有益的，因为盐常常引起对用于测量或分析样品中蛋白质的仪器的损害。而在又一个实施方案中，多孔基体15用作化学反应器。例如，蛋白质能够保留在多孔基体15上，和酶然后被加入到多孔基体15中与蛋白质反应。所形成的肽能够随后被多孔基体15分离。
多孔基体15填充分离通道13的至少一部分并能够附着于分离通道13的通道壁17上。优选，多孔基体15可以以共价键键接于该通道壁17上。与已知的分离介质不同，多孔基体15是均匀的和不含有色谱分析的颗粒。均匀的分离介质的使用是有利的，因为，在一些已知的应用中，色谱分析的颗粒的使用会引入不需要的变宽(即拆分度不足)。在本发明的其它实施方案中，多孔基体15能够分成两段，该两段被另一个段如具有不同的孔隙大小或表面电荷的整体单段所分开。
根据本发明的实施方案，多孔基体15通过使用金属有机光聚合物来形成。该光聚合物的前体能够包括金属醇盐。该金属可以是任何数目的金属，包括但不限于铝，钡，锑，钙，铬，铜，铒，锗，铁，铅，锂，磷，钾，硅，钽，锡，钛，钒，锌和锆。例如，如果所选择的金属是硅，则相应的金属醇盐是硅烷。根据本发明的实施方案，该前体能够进一步包括光活性基团如甲基丙烯酸酯。例如，该前体能够是甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。在其它实施方案中，该光活性基团能够是不同的丙烯酸酯或任何其它合适光活性基团。
不同的官能化或衍生化单体可用于多孔基体15的形成。单体的选择影响多孔基体15的物理性能，如孔隙大小，孔隙形状，聚合物电荷密度，和疏水性。利用不同孔隙产生剂(porogen)控制孔隙尺寸和形状能够获得具有宽的孔隙尺寸分布(即孔隙尺寸梯度)的多孔基体15。
光聚合溶胶-凝胶(PSG)分离介质
根据本发明的实施方案，多孔基体15能够包括分离介质。一般，当多孔基体15用作分离介质时，在分离通道13中不需要熔结玻璃料来将分离介质保持在位。作为分离介质的多孔基体15倾向于对被分析物具有亲和性并能够用于同时预浓缩和分离被分析物的样品。被分析物的亲合性能够由被分析物的保留系数，k，来表述。该保留系数，k，能够通过下列方程式测定：
该保留系数k也能够表达为：
k=tR-t0t0---(2)]]>
其中tR是被分析物的迁移时间，和t0是“未保留”被分析物的迁移时间。该保留系数受到溶剂的性质，被分析物的性质，柱的长度，多孔基体的渗透性，多孔基体的疏水性，和多孔基体的详细形态的影响。
分离柱11能够用于许多不同的目的，其中包括分析或半制备的工作。被分析物分离到亚毫克到毫克级量对于在分离柱11上的预浓缩而变得可能。例如，超过约100nL的处于mM水平的被分析物浓度下的样品溶液能够注入到该柱中，但没有超负载的明显证据。
正如所指出的那样，利用不同孔隙产生剂(porogen)控制孔隙尺寸和形状能够获得具有孔隙尺寸梯度的多孔基体15。从具有孔径尺寸梯度的多孔基体15形成的分离介质能够用作毛细管电泳和毛细管电色谱法中的“分子分类器”。此类分离介质能够分离尺寸结构或化学性质不同的大分子的混合物(例如，DNA片段)。另外，分离柱11能够为反转相，尺寸排阻，亲合性，离子交换色谱分析等等而设计。另外地，从多孔基体15形成的分离介质可以是从单体的混合物制备的混合相多孔基体。例如，该单体可以包括甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷，和双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷。该混合相多孔基体能够具有不同的性能，如疏水性。
光聚合溶胶-凝胶熔结玻璃料
根据本发明的另一个实施方案中，多孔基体15可用于在毛细管柱中形成光聚合物熔结玻璃料。光聚合物方法具有与现有烧结硅石方法相比的几个优点，其中包括(i)容易和快速的制备，(ii)在室温下短的反应时间，(iii)光聚合物的UV透明度，(iv)孔径尺寸的精确控制，和(v)熔结玻璃料长度和熔结玻璃料位置的控制。
在本发明的一个实施方案中，光聚合物熔结玻璃料通过光固化甲基丙烯酸酯取代的硅酸盐来制备。合适的光固化型溶胶-凝胶是本技术中已知的并用于实施本发明的这一方面。简要地说，单体如3-(三甲氧基甲硅烷基)甲基丙烯酸丙基酯(MAPTMS)经过辐射而形成溶胶-凝胶基体。在另一个的实施方案中，其它合适单体包括但不限于金属有机单体，如金属醇盐。当凝胶固化时，获得硬的多孔玻璃。
当产生用作熔结玻璃料的多孔基体15时，能够使用孔隙产生剂。在不同的实施方案中，该孔隙产生剂可以是溶剂(例如甲苯或己烷和甲苯的1∶1混合物)，聚合物，或无机盐(例如氯化钠粉末或硫酸钠)。聚合物孔隙产生剂的例子包括聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚苯乙烯。其它孔隙产生剂包括，但不限于，苯，乙腈，异辛烷，己烷，醇，四氢呋喃，和丙酮。根据本发明的实施方案，异辛烷和甲苯的混合物能够作为孔隙产生型溶剂用于以甲基丙烯酸酯为基础的多孔聚合物的制备。
在多孔基体15中的孔径尺寸能够通过不同孔隙产生型溶剂的使用来控制，和进一步通过在单体和孔隙产生剂的摩尔比率上的变化来控制。大到5.0微米和可能更大的孔径尺寸能够通过使用本发明的方法来形成。
制备分离柱的方法
本发明进一步包括制备分离柱11的方法。在本发明的实施方案中，该方法使用典型地由熔凝硅石形成的圆形毛细管柱12而形成分离柱11。毛细管柱12的内径(i.d.)能够是约10μm到约1000μm，和优选是在75μm到500μm范围。
根据本发明的方法的一个实例，多孔基体15是形成内部毛细管柱12使用A混合物那些 通过使用一般包括金属有机单体，孔隙产生剂和光引发剂的混合物在毛细管柱12内形成多孔基体15。混合物被引入到用于形成分离柱11的毛细管柱12中，并通过使用注射器让混合物流过毛细管柱12而引入。毛细管柱12的末端因此被密封。
在进行光引发的聚合反应之后，混合物形成固体多孔基体。用于混合物中的金属有机单体可以是金属醇盐，如硅烷，或金属醇盐的混合物。该金属可以包括以下任何一种，但不限于：铝，钡，锑，钙，铬，铜，铒，锗，铁，铅，锂，磷，钾，硅，钽，锡，钛，钒，锌，或锆。金属醇盐能够包括光活性基团，如甲基丙烯酸酯。在一个实施方案中，该前体(这里金属醇盐和光活性基团)能够包括甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。在另一个实施方案中，该前体可以是甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和另一种前体，如双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷或双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷的混合物。
在本发明的实施方案中，金属醇盐能够被添加到用于前体的水解的酸或碱催化剂中。该催化剂将烷氧基转化为羟基。例如，硅烷能够经历下列水解反应而形成全水解的硅烷：
(3)
该水解反应能够在部分水解的硅烷，Si(OR)4-n(OH)n上停止。该金属有机单体和催化剂能够搅拌一段时间，常常在几秒到二十四小时范围。
正如所指出的那样，混合物也包括孔隙产生剂或孔隙产生剂的混合物。孔隙产生剂能够与金属有机单体和催化剂混合，和混合物搅拌搅拌一段时间，再次在几秒到二十四小时范围。在这一时间中，该金属有机单体倾向于经历缩合反应而形成二聚物，三聚物，和其它低聚物。例如，部分水解的硅烷能够经历下列缩合反应：
(4)
较大的低聚物能够通过提高反应的温度来形成。
该孔隙产生剂提供分子模板而在多孔基体15内形成孔隙。例如，如上所述，该孔隙产生剂能够是溶剂，聚合物，或无机盐。能被使用的溶剂包括甲苯或己烷和甲苯的1∶1混合物；能被使用的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚苯乙烯；和能被使用的无机盐包括氯化钠粉末或硫酸钠。多孔基体15的孔隙度(即孔隙大小和形状)可以通过所使用的孔隙产生剂的类型以及它在反应溶液中的体积或浓度来控制。例如，单体与孔隙产生剂的克分子或体积比能够经过选择以在混合物中形成孔隙。通过调节单体和孔隙产生剂的摩尔比率，多孔基体15的物理性能(例如，孔隙尺寸)可以得到控制。
当混合物被辐射时该聚合过程开始，并且光引发剂或在单体上的光活性基团吸收来自辐射源的辐射。这启动了光化反应，该反应会催化金属有机化合物的聚合反应而在毛细管柱12内形成均匀的多孔基体15。毛细管柱12能够在一段短时间如大约五分钟暴露于辐射。辐射能够包括可见光或紫外光，和辐射的波长取决于用于该反应中的光引发剂或光活性基团的类型。如果用于形成分离柱11的毛细管柱12具有对光源不透明的外涂层，则涂层首先被除去以制造辐射窗口。涂层的长度将决定了在分离柱中所形成的多孔基体15的长度。
该光活性基团甲基丙烯酸酯能够在约300nm或365nm的波长下光聚合，如分别在C.Yu，F.Svec，J.M.J.Frechet，Electrophoresis 21(1)(2000)pp.120-27和H.-G.Woo，L.-Y.Hong，S.-Y.Kim，S.-H.Park，S.-J.Song，H.-S.Ham，Bull.Korean Chem.Soc.16(1995)pp.1056-59中所报道。在其它实施方案中，所使用的光引发剂能够是Irgacure 1800，它在大约365nm的波长下光聚合。Irgacure1800是从Ciba Geigy，Tarrytown，New York获得。
多孔基体15的制备的光化学途径具有与形成基体的其它已知方法相比的许多优点，其中包括短的制备时间，基体的孔隙大小的精确控制，多孔基体15的键接(placement)和长度的控制，高的机械强度，和导致毛细管柱12或基体的开裂的高温的避免。此外，根据本发明的方法所形成的多孔基体15不需要熔结玻璃料或色谱分析的颗粒，因此分离柱11的制备是比使用熔结玻璃料或色谱分析的颗粒的已知分离介质的制备更容易。
在本发明的方法的实例中，在多孔基体15形成之后让有机溶剂通过分离柱11以除去任何未反应的物质，孔隙产生剂，和光引发剂。能被使用的一种此类有机溶剂是乙醇。溶剂能够通过使用注射器或其它器具而流过该分离柱11。
分离柱11也能够在分离柱11用于分离被分析物之前用分离溶液调理。分离溶液能够包括缓冲剂，如含水乙酸铵，和洗脱溶剂，如乙腈。
分离被分析物样品的方法
本发明也包括分离被分析物样品的方法。首先，该被分析物在分离柱11上预浓缩。这通过让在样品溶液中含有的被分析物样品通过分离柱11来进行。被分析物能够包括中性物质，如多环芳族烃，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物，和带电荷的物质，如肽。样品溶液能够包括缓冲剂，如含水乙酸铵，和洗脱溶剂，如乙腈。
样品溶液能够通过对分离柱11施加电压或压力而被引起流过分离柱11。如果使用压力，则在大多数的分离柱11上施加的压力典型地是在0psi到20psi范围。如果必要，对于分离柱11也能够使用更大的压力，尤其当使用具有较大内径的分离柱11时。该压力能够施加各种时间长度，在一秒到半小时之间。如果使用电压，大约40V/cm的电场强度能够对大多数的分离柱11施加一段时间。应该指出，所使用的具体压力或电压将以许多因素为基础来变化，其中包括所使用的分离柱的设计。注射栓塞长度也发生变化，和超过两厘米的栓塞长度能够被注入到分离柱11中。
随着样品溶液穿过分离柱11，多孔基体15将被分析物预浓缩在该柱上。预浓缩的程度纯粹地取决于保留系数，该k值。该保留系数受到许多因素的影响，其中包括溶剂的性质，被分析物的性质，和分离介质的详细形态。该流速最低限度地影响了预浓缩的程度。
多孔基体15的高孔隙度的性质导致了对于被分析物的高质量转移速率，它促进该预浓缩效果。高质量转移速率起因于被分析物对于多孔结构的结合部位的增强的可达到性。因为高质量转移速率，被分析物-多孔基体相互作用的动力学(即被分析物在移动相和静止相之间的分配)不是该分离中的速率限制步骤。高质量转移速率使得该分离方法区别于先前形式的色谱分离。对于这一分离方法，因为高质量转移速率，有可能注入和浓缩更大体积的样品溶液，与含有正常的色谱分析材料的柱相比而言。
总的预浓缩效果与保留系数k成正比，其中较长的注射栓塞长度(例如，大于约25mm)导致具有低k值的被分析物的严重的峰加宽。这一行为暗示了在峰形状折中之前，有着各被分析物的样品栓塞的最大长度。
在线预浓缩的主要优点是它降低了给定的被分析物的检测极限。另一个优点是，当多孔基体15用于固相萃取时，预浓缩可用于为被分析物清除在样品基体中见到的可能的干扰物质。
在预浓缩阶段之后，分离溶液通过分离柱11以分离和洗脱该被分析物。该分离溶液能够通过使用以上对于样品溶液所述的相同技术，即施加压力或电压，而通过分离柱11。再次，施加的压力能够是在大多数的分离柱上大约0.5psi到大约20psi范围，典型地经历一秒到半小时的一段时间。如果使用电压，大约40V/cm的电场强度能够对大多数的分离柱11施加一段时间。正如以上所指出，所使用的具体压力或电压将以许多因素为基础来变化，其中包括所使用的分离柱的设计。
分离溶液能够包括缓冲剂，如含水乙酸铵，和洗脱溶剂，如乙腈。在一个实施方案中，该分离溶液与样品溶液相同。
多孔基体15用于从溶液中萃取被分析物以及为被分析物的色谱分离提供静止相。正是这一萃取器-分离器联合，使得这一方法与已知方法相比有优点。例如，具有超过约两厘米的栓塞长度的样品溶液能够装载到分离柱11中并使用与该样品溶液相同的分离溶液来预浓缩。
在一个实施方案中，除了由多孔基体15所发挥的效果，溶剂梯度可用来进一步增强被分析物的预浓缩。在这一实施方案中，样品能够溶于溶液中，后者具有比在分离溶液中更高浓度的缓冲剂(例如，水)。缓冲剂在样品溶液中的较高浓度会提高样品对静止相的亲合性。当使用溶剂梯度时，栓塞长度能够长于分离柱11的长度。例如，使用本发明已经发现，91.2cm栓塞的注射，它是毛细管的总长度的三倍以上，是可能的，而仅仅在拆分率上有轻微损失。在梯度条件下获得的峰高度的改进能够是大于一千倍。
对于中性被分析物，现有在多孔基体15上使用梯度的两种途径。第一种途径是提高在分离溶液和样品溶液之间的有机溶剂比率。第二种途径是通过提高水在分离溶液中的百分比，同时维持在分离溶液和样品溶液之间有机溶剂的合理百分比，来提高在分离中的保留系数k。分析对于第一种途径是更快的，而拆分率对于第二种途径是更好的。
在本发明的另一个实施方案中，除了由多孔基体所发挥的效果，样品堆积可用来进一步增强被分析物的预浓缩。样品堆积是带电荷的被分析物的聚集，当该被分析物经过分开高和低电场强度的区域的浓度边界时。高的电场区域是含有更多洗脱溶剂的较低导电性样品溶液，而低电场区域是较高导电性分离溶液。该洗脱溶剂，如乙腈，具有比缓冲剂如乙酸铵水溶液更低的导电性。因此，较高浓度的洗脱溶剂导致降低样品基体导电性。
在样品堆积中，用分离溶液制备分离柱11。当被分析物被引入该分离柱中和施加电压时，样品溶液中的被分析物在柱的进口快速地加速移向早已在柱中存在的分离溶液(较低电场强度)，而穿越在样品溶液和分离溶液之间的边界时，他们减慢速度并堆积在界面上的窄区段中。
样品堆积基本上是由在浓度边界上电泳速度的变化所引起。电泳速度是电泳迁移率和电场强度的乘积。当电泳速度在浓度边界处降低时发生聚集(样品堆积)。样品堆积也通过使用等速电泳的基本原理和科尔劳施(Kohlrausch)定律来解释。
现有在多孔基体15上进行样品堆积的两种途径。第一种途径是提高有机溶剂如乙腈的百分比。第二种途径是降低缓冲组分在样品溶液中的浓度。提高乙腈或其它合适有机溶剂的百分比尤其可用于含有高浓度盐的真实样品。脱盐，例如通过透渗析，因此是制备供注射用的较低导电性溶液所不需要的。当脱蛋白质是样品制备的一部分时，有机溶剂的使用也用于生物样品。
大体积的被分析物样品的分离
当进行在大体积样品中的被分析物的分离时，已知的分离技术具有许多相关问题。例如，毛细管电泳(CE)没有广泛地用作制备性的分离工具，因为低的样品体积和在与CE相关的小内径(i.d.)毛细管的使用中固有的短的检测通路长度。通过使用一些策略如有分级收集的多次注射和管束式毛细管，仅仅在CE中实现了纳摩尔的量的被分析物的荷载。与试图使用较大i.d.毛细管(200μm i.d.和更大)有关的主要缺点中的一个是焦耳热的产生。
CEC可用于通过使用填充了小直径色谱分析的颗粒的大i.d.毛细管来分离在大体积样品中的被分析物。例如，能够使用具有500μm内径和填充了1μm球形硅石颗粒的毛细管。该硅石颗粒在至少一些情况下，对于在施加高电压时在柱中产生的焦耳热的散逸是有效的。不幸地，颗粒填充柱的大回压常常防止样品的高负载。
本发明与较大i.d.毛细管的结合使用已经显示可用于半制备性应用。在本发明的一个实施方案中，分离柱11是通过使用具有较大内径(例如＞500μm)的毛细管来构造。为了分离大体积的样品，被分析物首先在这一实施方案的分离柱1l上进行预浓缩。已经显示，这一技术允许在多孔基体15填充的540μm i.d.毛细管中荷载多达至少8纳克(ng)的被分析物(例如，丙酰苯)。
本发明利用下列实施例更详细地进行描述。下列实施例仅仅为了进一步说明和公开本发明而给出，不应该认为限制本发明。实施例1-17讨论了PSG分离介质，实施例18讨论PSG熔结玻璃料，和实施例19讨论使用大i.d.直径毛细管柱的PSG分离介质。
实施例1
原料和化学品。熔凝硅石毛细管(75μm i.d.×365μm o.d.)是从Polymicro Technologies，Phoenix，Arizona商购的。
甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)是从Gelest，Tullytown，Pennsylvania和Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin商购的并且在没有提纯的情况下使用。HPLC-级甲苯，菲，芘，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物是从Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin购得。Irgacure 1800是从Ciba，Tarrytown，New York获得。
安装仪器。使用带有UV吸光检测器的Beckman P/ACE2000毛细管电泳仪来进行全部CEC实验。XL-1500 UV cross-linker，可从Spectronics Corp.，Westbury，New York获得，装有主要地365nm波长的六只15W黑光灯管，用于辐射该反应溶液。在从Eindhoven，Netherlands获得的Philips SEM 505扫描电子显微镜上进行扫描电子显微镜(SEM)分析。
聚合反应程序。通过将375μl的MPTMS添加到100μl的0.12N HCl中，刚好在使用之前制备单体贮备溶液。这一溶液在室温下搅拌大约三十分钟而获得透明，单相的溶液。将合适量的甲苯(孔隙产生剂)加入到该单体贮备溶液中，如在下表1中所示。
表1 毛细管柱 ％甲苯(v/v) A 90 B 80 C 75 D 73 E 65 F 50
光引发剂，Irgacure 1800，首先被添加到该甲苯中，按照甲苯/单体贮备溶液的总重量的5％。这一光引发剂溶液然后被加到相应量的单体贮备溶液中，并在室温下搅拌三十分钟而获得黄色，单相的溶液。为了最大程度地减少甲苯的蒸发，该溶液是在具有聚硅酮封盖的管形瓶中制备，在溶液的填充过程中经由该封盖将毛细管插入。
通过使用位于毛细表面的45°角的刀片，除去在30cm长的毛细管上的聚酰亚胺涂层的15cm细条。毛细管的机械稳定性是显著地优良的，尽管有聚酰亚胺涂层的细条的除去。辐射光仅仅通过该15cm细条进入毛细管。在毛细管中没有形成整体单段，其中聚酰亚胺涂层(“掩蔽层”)完整无损。
通过使用0.5ml一次性注射器，在用溶液装填该毛细管之前将大约0.2ml的反应溶液冲洗通过该毛细管以便彻底地湿润壁面。这导致整体单段粘结于毛细血管壁上。不需要毛细血管壁的特殊预处理来将整体单段粘结于壁上。填充好的毛细管在UV cross-linker中使用365nm光进行辐射(900mJ/cm2)五分钟而形成多孔基体。
在辐射后，该毛细管利用手持注射器用乙醇洗涤，以除去未反应的试剂或孔隙产生剂。因为该整体单段是高度渗透性的，不需要高压来驱动液体通过该毛细管。一旦未反应的试剂被除去，该整体单段变成不透明的并且无需借助显微镜就能清楚地透过该毛细管看见。多孔基体的均匀性是在100X放大倍数下证实。紧接着在整体单段区段之后用发烟硫酸烧除聚酰亚胺涂层而形成检测窗口。
一旦制造之后，该毛细管成功地安装在盒中，没有任何损害。使用注射器和手持钳子，该毛细管用分离缓冲液调理大约五分钟。一次在该仪器中，毛细管进一步通过用分离缓冲液加压漂洗(20psi)来调理或通过在5kV或10kV下电动力学调理三十分钟。
表征。SEM用于研究分离柱的形态。毛细管被小心地切开以暴露该整体单段。毛细管的切开段用金进行溅射，之后进行SEM分析。
被分析物分离。在移动相中制备被分析物，以防止在CEC实验过程中的梯度效应。该移动相是由各种比率(v/v)的50mM乙酸铵，水，和乙腈组成。新样品溶液用于每一次注射，以维持在样品溶液和移动相中相同浓度的乙腈。
图2A是显示柱B的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该分离是用50mM乙酸铵/水/乙腈(1/3/6)溶液来进行。样品溶液在0.5psi压力下注入达到三秒钟，和在20℃的温度下用1kV的外加电压进行分离和然后在214nm下检测。分离的洗脱顺序是(1)硫脲，(2)四氢呋喃，(3)萘，(4)菲，(5)荧蒽，(6)芘，(7)1，2-苯并蒽，和(8)1，2，5，6-苯并蒽(bienzanthracene)。
图2B是显示柱D的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该分离是用50mM乙酸铵/水/乙腈(1/4/5)溶液来进行。样品溶液在0.5psi压力下注入达到三秒钟，和在20℃的温度下用15kV的外加电压进行分离和然后在200nm下检测。分离的洗脱顺序是(1)苯，(2)甲苯，(3)乙烯苯，(4)丙基苯，(5)丁基苯，和(6)己基苯。
柱的洗脱顺序类似于利用比小分子量或较高亲水性的被分析物更迟洗脱的较大分子量或较高疏水性的被分析物来进行的反相色谱的洗脱顺序。在两图中的被分析物的洗脱是在低于七分钟内进行。气泡形成不是CEC实验中的问题，为此典型的操作电流是在3和10μA之间。
对于典型的毛细管柱D，对于硫脲，较少保留的化合物，实现了高达100,000板/m的效率。在三天的时间中(n＝33)对于硫脲(0.65％RSD)，萘(1.10％RSD)，菲(1.14％RSD)，和芘(1.14％RSD)观察到洗脱时间的小变化。
图3是显示柱D的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该分离是用50mM乙酸铵/水/乙腈(1/3/6)溶液来进行。样品溶液在0.5psi压力下注入达到三秒钟，和在20℃的温度下用1kV的外加电压进行分离和然后在214nm下检测。硫脲，萘，菲，和芘的样品是在仅仅20psi(仪器的最高界限)的施加的压力下在110分钟中被分离。峰拖尾对于芘是最严重的，因为它与多孔基体的强相互作用，但对于硫脲没有观察到拖尾，因为硫脲在柱上较低停留。
图4A是在75μm-i.d.毛细管柱中用80％(v/v)甲苯(毛细管B)形成的金属有机光聚合物的横截面的扫描电子显微照片。该显微照片显示了1μm球形结构的互连网络，在其中散布了微米级尺寸的大孔(大到5μm)。
图4B是在75μm-i.d.毛细管柱中用50％(v/v)甲苯形成的金属有机光聚合物的横截面的扫描电子显微照片。与图4A中示出的多孔基体相反，在图4B中示出的结构是具有2μm或更低直径的大孔的致密的光聚合物。因此，在图4B中的基体是较低渗透性的，和产生相当大的回压。在接近200psi的压力下没有液体被驱动穿过该柱。
多孔基体的渗透性是通过多孔基体的线速度来决定，它与渗透性成正比，如在达西定律(Darcy’s law)中所述。多孔基体的渗透性与大孔尺寸的关系高度取决于用于制备光聚合物的孔隙产生剂的体积和类型。对于用90％(v/v)甲苯制得的柱(柱A)，线速度是12.3cm/分钟，和80％(v/v)柱(柱B)具有3.3cm/分钟的线速度而用73％(v/v)甲苯制得的柱(柱D)具有0.6cm/分钟的线速度。这些线速度数据提示了大孔随着降低孔隙产生剂浓度而减少。这一行为与在文献中报道的一致。
实施例2
按照在实施例1中所述来制备分离柱。1∶1己烷/甲苯的混合物用于该孔隙产生剂。该分离柱具有与用80/20甲苯/反应溶液制得的分离柱的分离性能类似的分离性能。获得了对于硫脲的68,000板/m(RSD 7.0％，n＝5)的柱效率和3.7cm/分钟的电渗流(EOF)速度。
实施例3
375μl的MPTMS和100μl的0.12M盐酸的混合物在室温下搅拌三十分钟。27份的这一混合物与73份的甲苯混合而得到200μl的最终溶液。添加相当于最终溶液的5wt％的光引发剂Irgacure 1800，和所获得的溶胶-凝胶溶液在使用之前搅拌五分钟。75μm i.d.×365μmo.d.熔凝硅石毛细管用该溶胶-凝胶溶液填充，然后该分离柱在Spectrolinker X1-1500中暴露于365nm的UV光来进行光聚合。多孔基体的聚合反应长度可通过在五分钟的辐射之前除去毛细管的聚酰亚胺涂层的15cm细条来控制。未反应的试剂用乙醇冲洗掉。毛细管的总长度是25.6cm(从进口到检测器窗口为18.8cm)。在使用之前所获得的柱用该分离溶液进行调理。
全部电泳实验用Beckman P/ACE 2000来进行。该毛细管然后恒温在20℃。注射通过使用压力(即，0.5psi和20psi)或电压(1kV到10kV)和在两秒到1920秒之间改变持续时间来进行。检测是在214或254nm下进行。数据分析是用从Galactic Industries Corporation，Salem，New Hampshire获得的GRAMS/32版本4.02来进行。
图5A和5B是显示了使用本发明的实例的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。这些图说明了，在含有小分子，硫脲，三种多环芳族烃(PAHs)，和8种烷基苯基酮的混合物的CEC分离中，随着注入的栓塞长度的增加，检测灵敏度提高。为了消除溶剂梯度影响，样品是在该分离溶液中制备。样品和分离溶液是50mM乙酸铵/水/乙腈(1/4/5)。在图5A中，栓塞长度是0.1mm，6.8mm，13.7mm，27.4mm，和34.2mm。0.1mm栓塞长度属于0.5psi的施加的压力，而全部其它栓塞长度属于20psi的施加的压力。分离的外加电压是20kV，和该吸收率是在214nm下测量。柱的洗脱顺序是(1)12.5μM硫脲，(2)51.0μM萘，(3)1.0μM菲，和(4)123μM芘。
在图5B中，该柱是按照与前面所述的柱同样的方式制备，只是该柱通过(3，3，3-三氟丙基)三氯硅烷在室温下的三十分钟的连续流动和随后用甲苯漂洗来进行后改性。栓塞长度是0.7mm，7.2mm，10.7mm，17.9mm，和28.6mm。外加电压是15kV，和该吸收率是在254nm下测量。柱的洗脱顺序是(1)5μm硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。这些烷基苯基酮中的每一种的浓度是在分离溶液中0.1μg/mL。
对于在图5A中示出的PAH混合物，以0.1mm栓塞长度的典型注射几乎看不见峰，但是当栓塞长度从6.8mm提高到34.2mm时峰高度提高。因此，该分离柱，本发明的实施方案，允许比典型分离柱更长的栓塞长度的注射。类似地，对于在图5中示出的烷基苯基酮混合物，当栓塞长度从0.7mm增加到57.3mm时峰高度提高。随着栓塞长度的增加，全部四个峰都显示更多的变宽，但是后面的洗脱峰则在较小程度上比前面的洗脱峰更对称。这一行为与在典型的色谱分离中观察到的不同，在典型的色谱分离中，后面的洗脱峰因为分散效应而不如前面的峰对称。这些结果显示，在注射过程中被分析物在多孔基体的进口处积聚，其中较多保留性的物质比较少保留性的物质更有效地定位。
在图5A中，与0.1mm的典型注射相比27.4mm注射的峰高度分别对于萘，菲，和芘是50，125和127倍。在27.4mm注射中的样品溶液是在典型的0.1mm注射中的样品的10倍稀释液。
实施例4
按照在实施例3中所述来制备分离柱。样品和分离溶液是50mM乙酸铵/水/乙腈(1/3/6)。样品在1kV下注入。外加电压是15kV，和该吸收率是在214nm下检测。图6是显示了使用本发明的实例的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。在分离溶液中39.0mM的萘被注射五秒钟，由信号a表示，和在分离溶液中的3.9mM的萘被注射八十五秒，由信号b表示。通过控制样品的十倍稀释液的注射时间，两电色谱的矫正峰面积(峰面积/迁移时间)彼此变得更靠近。在a和b两线中电泳图谱的矫正峰面积分别是0.0023(％RSD＝0.02％，n＝3)和0.0025(％RSD＝0.00，n＝3)任意单位/分钟。进行对比，使得每一轮注射的萘分子的量是相同的。
预浓缩是通过稀释样品的较长时间注射的稍高峰高度和对于两实验的几乎相同的矫正峰宽(峰宽/迁移时间)来证实。在信号a和b中电色谱的峰高度分别是0.0869(％RSD＝0.36％，n＝3)和0.0937(％RSD＝0.06％，n＝3)任意单位。在a和b两信号中电色谱的峰宽度分别是0.0253(％RSD＝0.07％，n＝3)和0.0249(％RSD＝0.01％，n＝3)任意单位/分钟。在b线上迁移时间的变化是由较长注射时间所引起，这使得样品栓塞的中心更靠近检测器窗口。
实施例5
575μl的MPTMS和100μl的0.12M盐酸的混合物在室温下搅拌三十分钟。20份的这一混合物与80份的甲苯混合而得到200μl的最终溶液。添加相当于最终溶液的总体积的10％的光引发剂，和所获得的溶胶-凝胶溶液在使用之前搅拌五分钟。如以上在实施例3中所述来制备分离柱。未反应的试剂用甲苯冲洗掉。多孔基体的表面通过五氟苯基三氯硅烷在室温下经由毛细管的四十五分钟的连续流动和随后用甲苯漂洗来改性。
图7(a和b)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。分离溶液是50mM磷酸/水/乙腈(1/5/4)。外加电压是15kV，和该吸收率是在214nm下检测。图7(a)显示了试验肽的在0.1mm栓塞长度的0.5psi注射，和图7(b)显示了试验肽的在12mm栓塞长度的0.5psi注射。试验肽，它们是带电荷的被分析物，是(1)血管舒缓激肽，(2)血管紧张素II，(3)三肽I，(4)三肽II，和(5)蛋氨酸脑啡肽。肽的浓度是16.7μg/ml。肽的阴极引导速度是由电泳和电渗流效应来支配。该肽在分离溶液的pH(pH＝2)下具有净正电荷。与0.1mm栓塞长度的典型注射相比更长时间的注射的峰高度的改进分别对于血管舒缓激肽，血管紧张素II，三肽I，三肽II，和蛋氨酸脑啡肽是21，19，16，18和22倍。这一结果说明了这一方法对于带电荷的被分析物的有用性。
实施例6
与在实施例3中一样制备分离柱。图8(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。图8显示了尿样品的分析结果，掺加0.1mM皮质甾醇(峰1)，0.3mM黄体酮(峰2)和0.2mM可的松(峰3)。四份的掺加或未掺加的尿与六份的乙腈混合和离心处理以除去蛋白质。在注射之前一份的各上层清液与一份的50mM乙酸铵/水/乙腈(1/7/2)混合。图8(a)显示了0.1mm的注射栓塞长度，和图8(b)显示了21.4mm的注射栓塞长度。图8(c)表示了尿空白的21.4mm注射栓塞长度。分离溶液由50mM乙酸铵/水/乙腈(1/5/4)组成。分离的外加电压是17kV，和该吸收率是在254nm下测量。在用乙腈进行蛋白质沉淀后，这些甾族化合物被检测和用样品溶液的21.4mm注射来定量，但是用典型的0.1mm注射来微弱地检测。在空白试验和掺加的试验之间的对比表明，仍然含有其它生物分子的样品基体没有显著地干扰该分离柱的甾族化合物分析。这一结果说明了该技术在生物流体分析中的有用性。
实施例7
按照在实施例3中所述来制备分离柱。图9(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。1.1cm的样品栓塞长度被注入。该分离溶液是在60％乙腈中5mM乙酸铵，和样品溶液是在60％乙腈(a)，50％乙腈(b)，40％乙腈(c)，30％乙腈(d)，和20％乙腈(e)中的5mM乙酸铵。分离的外加电压是15kV，和该吸收率是在254nm下检测。洗脱顺序是(1)硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。各被分析物的浓度是2nl/ml。
该保留系数，k，对于乙酰苯(峰2)，丙酰苯(峰3)，丁酰苯(峰4)，戊酰苯(峰5)，己酰苯(峰6)，庚酰苯(峰7)，辛酰苯(峰8)和癸酰苯(峰9)获得的保留系数k分别是0.18，0.25，0.32，0.41，0.53，0.67，0.85和1.33。在这一研究中，硫脲(峰1)用作供k的测定用的基本上未保留的中性溶质。k的值和迁移时间跟随烷基链长度的增加。通常，当水浓度从40％提高到50％，60％，70％和80％时改进了峰形状和拆分，这可分别由a，b，c，d，和e来证实。
实施例8
该实验条件与在实施例7中相同。图10是曲线的图解表示，显示了峰高比(从样品基体中较高浓度的水获得的峰高度除以从与分离溶液的样品基体类似的样品基体获得的峰高度)的对数/样品基体中水的百分比的关系。该数据显示存在一种限度，在该限度上峰高度能够通过提高样品基体中缓冲剂的浓度来改进。预浓缩得到改进，归因于被分析物对多孔基体的增加的吸引。当峰高度比的对数的值是低于1，约1，或大于1时，与使用分离溶液作为样品基体的类似注射相比，在峰高度中分别有降低，无变化，或提高。对于全部的试验APK，当水浓度从40％提高到50％和从50％提高到60％时，峰高度得到改进。当水的百分比从60％提高到70％或更高时峰高度没有改进，但是，当水的百分比从60％提高到70％时两种最低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)除外。峰高度对于在80％水基体中的较高k值被分析物(庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯)则变恶化。峰高度的降低的原因是高k值被分析物在高度含水样品基体中的溶解度的减少。矫正的峰面积，它是对于辛酰苯和癸酰苯所负载的样品的量的量度，是在80％水基体中比所用其它样品基体降低了10％到60％。为了避免溶解度问题，在接下来的实验上的试验APK是在具有至少30％乙腈的基体中制备的。
实施例9
如以上在实施例3中所述来制备分离柱。图11(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵。栓塞长度是：对于在60％乙腈中的5mM乙酸铵的样品溶液来说的0.2cm(a)；对于用于a的同样样品溶液来说的2.74cm(b)，和对于在30％乙腈中5mM乙酸铵的样品溶液来说的2.74cm(c)。其它条件和峰的鉴别与在实施例7中相同。
该梯度条件，如在图11(c)中所示，显示改良的拆分和峰形状。在图11中所示的在梯度条件下峰高度的改进(c)对于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯分别是36，35，38，41，42，38，32和24倍。所测量的峰高度的％RSDs(n＝5)是在0.9％到2.5％范围。迁移时间的％RSD(n＝5)是在0.3％到0.5％范围。该程序因此在单个柱中可再现。
实施例10
图12A，12B和12C是显示使用本发明的实例的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。栓塞长度是：对于在40％乙腈中的5mM乙酸铵的样品溶液来说的2.74cm(图12A)；对于在30％乙腈中5mM乙酸铵的样品溶液来说的2.74cm(图12B)，和对于与图12B中相同的样品溶液来说的5.48cm(图12C)。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵(图12A)和在50％乙腈中5mM乙酸铵(图12B和12C)。其它条件和峰的鉴别与在实施例7中相同。
在图12B中的k值比在图12A中的高，因为在分离溶液中的水的高百分率。被分析物分子在高百分比的水下更吸引到PSG相上。分配常数K(在PSG相中溶质的摩尔数除以在分离溶液中溶质的摩尔数)，它与k值成正比，随着提高在分离溶液中水的浓度而增大。在图12B中，对于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯的k值分别是0.29，0.47，0.65，0.92，1.28，1.76，2.37和4.25。为了保持该梯度效应恒定，在分离溶液和样品基体之间的有机溶剂比率的百分比被保持与图12A和12B同样的值。因为仍然未知的原因，在图12B中的结果显示，对于具有较低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)，与图12A相比在峰高度上有轻微的提高。对于其它试验溶质，在峰高度上有一些下降。
图12C说明了对于5.48cm的较长注射栓塞和在分离溶液中较高百分比的水所遇到的情况。峰高度的改进对于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯和癸酰苯分别是31，33，55，44，44，37，29和19倍。与图11(c)中一样，峰高度的改进没有跟随k，与在非梯度条件中不同。在峰高度上的改进可以与在分离溶液和样品基体之间的较高百分比的有机溶剂所获得的那些相当(图11，c)。应该指出，在图11中(c)注射栓塞比在图12C中短两倍。
实施例11
图13(a和b)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。栓塞长度是0.22mm(a)和19.5cm(b)。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵。样品溶液是：在60％乙腈中(a)和在36％乙腈中(b)的5mM乙酸铵。样品浓度是11-53μg/ml(a)和1.1-5.3μg/ml(b)。外加电压是30kV，和该吸收率是在214nm下检测。洗脱顺序是硫脲(峰1)，萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)，和benz(e)acephenanthylene(峰5)。
溶剂梯度改进了四种PAH的检测，如在图13中所示(b)。在分离溶液中高百分比的乙腈(60％)，更短的PSG长度(10cm)，和高的电场强度(781.3V/cm)用于更快速的分析时间。图13(a)是在分离溶液中制备的样品的0.22mm典型注射。图13(b)是使用梯度的19.5cm注射，其中样品处于36％乙腈基体中，这在样品溶液和分离溶液之间提供高百分比的有机溶剂。长于19.5cm的栓塞会引起萘峰的变宽。有益的是应该指出，注射长度长于从进口到检测器窗口的长度(18.8cm)。在样品注射过程中实际上观察到快速洗脱硫脲区段。硫脲区段因此是在分离电压开始时的检测窗口。
对于萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)和benz(e)acephenanthylene(峰5)在峰高度上的改进分别是346，437，409和315倍。在图13中的样品浓度(b)比在图13中(a)低10倍。对于萘，菲和芘，以上所述的值是比前面所报导的在非梯度条件下的值分别好了6.9，3.5和3.2倍。
实施例12
图14(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。栓塞长度是0.23mm(a)，7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵。样品溶液是：在60％乙腈中(a)和在40％乙腈中(b，c，d和e)的5mM乙酸铵。样品浓度是9-50μg/ml(a)，0.9-5μg/ml(b，c，d和e)。外加电压是22kV，和该吸收率是在254nm下检测。该洗脱顺序是硫脲(峰1)，癸酰苯(峰2)，和芘(峰3)。
癸酰苯(峰2)和芘(峰3)的峰高度随着增加栓塞长度而提高。该注射是从0.23mm(a)提高到7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)，这对应于总毛细管长度的0.1％，30％，89％，178％，和356％。多孔基体的高孔隙度或低流动阻力使得有可能以相当容易的方式引入更大长度的样品溶液。长于91.2cm注射仍然是可能的。然而，它没有进行，归因于拆分能力的损失，正如在图14(e)中所观察的。在d或e中的电色谱被认为是在CEC中的第一个示范，显示样品注射长于总毛细管长度。所注射的样品的体积也大于1μl。在a和e中获得的峰高度的对比提示了对于癸酰苯和芘而言在峰高度上分别改进1118倍和1104倍。这些值是通过在CEC中使用简单的在线预浓缩技术，对于中性被分析物的最高所报道的敏感性改进。被分析物与多孔基体的强相互作用和多孔基体的固有的快速质量转移特性使得可以观察到此类突出的预浓缩效应。
成功的分离已经用PSG在250μm i.d.毛细管中实现(数据未显示)。这一工作产生了牵涉到长的栓塞注射的进行半制备性分离的可能性。在u1范围中的注射体积能够容易地做到。
实施例13
图15(a，b，c，d，e，和f)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。栓塞长度是0.1mm(a)和1.8cm(b，c，d，e和f)。注射通过使用压力来进行，其中注射时间被固定在1.8cm。该分离溶液是与分离溶液相同(a和b)，在20％乙腈中10mM磷酸(c)，在70％乙腈中10mM磷酸(d)，在40％乙腈中的50mM磷酸(e)，在40％乙腈中的0.05mM磷酸(f)。该分离溶液是在40％乙腈中的10mM磷酸。肽浓度是16.7μg/ml每次，外加电压是12kV，和吸收率检测是在214nm下进行。洗脱顺序是血管舒缓激肽(峰1)，血管紧张素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸脑啡肽(峰5)。
虽然可以预期与非梯度条件(图15，b)相比在梯度条件下峰形状是更好的(图15，c)，但是通过使用在样品基体中更高浓度的乙腈，所获得的峰形状是更好的(图15，d)。在从样品堆积所形成的图15(d)中观察到更好的峰形状。通过在样品溶液中使用较高浓度的洗脱溶剂的变宽效果(因为较高浓度的洗脱溶剂所引起的反向梯度效应)没有观察到，因为一旦施加电压之后阳离子肽立刻迁移到分离缓冲液中，因此在到达多孔基体之前肽区段(zones)早已存在于分离溶液中。样品堆积也示于图15(f)中，其中在具有与分离溶液相比更低浓度的缓冲组分和类似百分比的乙腈的基体中制备样品。
在从去堆积形成的图15(c)中观察到所不希望有的的峰形状。去堆积(Destacking)是当被分析物经过分开低和高电场强度的区域的浓度边界时带电荷的被分析物的变宽。低的电场区段是含有更多水的高电导率样品基体。去堆积也示于图15(e)中，其中在具有与分离溶液相比更高浓度的缓冲组分和类似百分比的乙腈的基体中制备样品。
实施例14
图16(a和b)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。注射是使用0.5psi压力的0.1mm(a)和在5kV下的15-s(b)。样品溶液是：在40％乙腈中10mM磷酸(a)和在40％乙腈中0.5μm磷酸(b)。肽浓度是16.7μg/ml每一种(a)和167ng/ml每一种(b)。分离电压是12kV。其它条件与在实施例13中相同。
在图16中的被分析物(b)是比图16中的那些少浓缩了一百倍。对于血管舒缓激肽(峰1)，血管紧张素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸脑啡肽(峰5)在峰高度上的改进分别是1040，820，810，950和711倍。对于预浓缩程序，峰高度的％RSD(n＝5)是在6.2％-16.2％范围，而迁移时间的％RSD(n＝5)是在0.7％-1.5％范围。借助于内标物的使用应该改进峰高度的可再现性。
通过将样品溶于低导电率基体(在40％乙腈中0.5μM磷酸)中，随后在检测器端使用负电极的电压进行注射，来进行电场增强的样品注射。当施加电压时，低导电率样品基体借助于电渗流(EOF)进入毛细管，而阳离子肽借助于EOF和电泳流两者进入柱中。仅仅非常小栓塞的样品基体被引入，因为分离溶液的低pH显著地减少EOF，这防止在毛细血管壁上硅烷醇基的解离。在30分钟之后实际上检测未保留的中性溶质(硫脲)。
在被引入柱中的样品基体区段中的电场大大高于分离区段。这一效应引起了进入毛细管的阳离子肽的高电泳速度。高的被分析物电泳速度引起大量的肽被引入，与在水动力学注射中不同，负载的样品的体积限制了所引入的样品的量。高的被分析物电泳速度也引起在样品基体和分离溶液之间的浓度边界上肽的聚集或预浓缩(样品堆积)。在动电学注射之前水栓的引入(被建议用于利用动电学注射的样品堆积中)没有改进峰高度，因为EOF和被分析物电泳速度的相似方向。进入毛细管的低导电率样品基体也在注射过程中在毛细管的入口端维持电场的增加。
利用在图16中的条件，在5kV下的最佳动电学注射时间是15秒。比较久的注射导致峰的变宽。在注射之后，利用与在注射中同样的极性来施加分离电压(在检测器侧的负电极)。被分析物运动到阴极和随后以它们在PSG柱上的保留为基础再次预浓缩。该方法被认为对阳离子有选择性，因为阳离子主要被引入毛细管中。所注入的中性物质是在未保留的中性标记物和阳离子之后迁移，因为该EOF是非常缓慢的。在所使用的pH下，全部的被分析物是带阳电荷的或中性。该技术对于其它阳离子样品的适用性也是可能的。
实施例15
表2列出了用于制备不同的前体贮备溶液的试剂的类型和体积，其中酸催化剂与前体(甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷)的比率会改变或其中前体与共前体反应(形成混合相PSG整体单段)。
表2 体积(μL) 溶液 前体1 BTE2 BTO3 HCl4 A 375 0 0 100 K 375 200 0 100 J 575 0 0 100 M 500 0 75 100 P 375 200 0 100
1甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷
2双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷
3双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷
40.12M
改变在反应溶液中前体的浓度或使用用于混合相的形成中的共前体可以改性母体PSG整体单段的化学性质。分别从溶液A和J制备的PSG整体单段，PSG-A和PSG-J，仅仅在前体的体积上不同，该前体用于与含有比A更高体积的前体的J反应。在反应中较高体积的前体会导致在毛细管柱中形成致密的整体单段。PSG整体单段，PSG-K，是用前体和作为共前体的双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷来制备。PSG整体单段，PSG-M和PSG-P，是用前体和不同量的作为共前体的双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷制备的。共前体水解和与前体缩合而形成杂化溶胶(混合相)。
对于溶液A和J，将合适量的前体添加到100μl的酸催化剂(0.12M HCl)中，和所形成的溶液在室温下(在黑暗中)搅拌15分钟。对于K，M和P，将合适体积的前体添加到100μl的0.12M HCl中，随后添加合适量的双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷；所形成的溶液在室温下(在黑暗中)搅拌15分钟。全部这些溶液在两小时中用于它们的制备。
重复类似的程序，利用所添加的光引发剂来制备甲苯/前体贮备溶液。被添加到甲苯/前体贮备溶液中的光引发剂的量是10mg光引发剂/每100μl的甲苯/前体贮备溶液。
该毛细管是按照与前面所述的相同的方法来制备和调理。PSG毛细管柱调理与前面相同。
测定对于烷基苯基酮(APK)和多环芳族烃(PAH)的两种试验混合物而言的整体单段的分离系数。该分离系数是色谱系统的被分析物分离能力的量度。分离系数，α，是由k2/k1导出，其中k是具体的被分析物的保留系数，以及k2和k1是相邻被分析物的k值。保留系数k＝(tR-t0)/t0是按通常方式测定的，其中tR是被分析物保留时间和t0是未保留的标记物的保留时间，对于标记物我们使用硫脲。表3列出了对于萘和芘的各PSG整体单段的分离系数。
表3 整体单段 kn kPy αNpy Rs(N/Py) PSG-A 0.14 0.36 2.57 2.43 PSG-K 0.23 0.56 2.43 4.09 PSG-J 0.31 0.79 2.55 4.35 PSG-M 0.35 0.90 2.57 4.37 PSG-P 0.25 0.69 2.76 9.03
α的值是从PSG-K的2.43变化到PSG-P的2.76，其中PSG-P的分离系数稍微地高于另一个整体单段的分离系数。大于1的分离系数预示着被分析物的成功分离。
图17(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线。硫脲(T)，萘(N)，菲(PH)和芘(Py)的混合物是在PSG-A(图17，a)，PSG-K(图17，b)，PSG-J(图17，c)，PSG-M(图17，d)，和PSG-P(图17，e)。在全部情况下不同被分析物的峰被充分拆分。
拆分能力是从以下表达式确定：
Rs=N4(α-1)αk(k+1)]]>
其中N是效率(理论塔板数)，α是分离系数，和k是具体的被分析物的保留系数。PSG-A对于萘和芘具有2.43的最低拆分能力，而PSG-J对于相同的两种被分析物具有4.35的拆分能力。与PSG-A相比更高体积的前体用于PSG-J的制备中可导致整体单段的提高的疏水性。在PSG-J上对于萘和芘的保留系数分别是0.31和0.79，和这些值反映了整体单段的疏水性的增加。这些值分别代表了55％和54％的提高。
共前体，双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷在PSG-M中和双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷在PSG-K和PSG-P中的使用会导致对于萘和芘的拆分能力分别为4.09和9.03，与在母体PSG-A(Rs＝2.43)上的拆分能力相比有了高达73％的提高。萘(0.23)和芘(0.56)的保留系数两者对于这三个整体单段而言都比PSG-A高60％，。
实施例16
按照与以上在实施例15中对于整体单段PSG-J所述的那样来制备分离柱。对于具有15cm长度的多孔基体，萘和芘的保留系数，分别为kN和kPy，对于用80％甲苯制得的多孔基体分别是0.31和0.79。对于具有10cm长度的类似的多孔基体，kN和kPy分别是0.10和0.24。在长度和kN(r＝0.991)和kPy(r＝0.991)之间有线性关系。15cm，10cm，和5cm多孔基体的分离系数分别地是2.55，2.52和2.40。因此，对于最短的整体单段长度，保持了高的分离系数，而被分析物的洗脱时间显著地减少。降低在毛细管柱中多孔基体的长度会导致试验被分析物的洗脱时间的减少。降低这一长度具有降低萘和芘的保留系数的效果。
实施例17
如以上在实施例15中所述来制备分离柱。对于用80％甲苯制得的PSG-A，kN是0.14和kPy是0.36，而对于用73％甲苯制得的PSG-A，kN是0.30和kPy是0.74。对于用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-A来说的分离系数分别地是2.57(0.1％RSD)和2.47(0.1％RSD)。对于萘和芘，k的值提高了53％和51％，当73％甲苯用于整体单段的制备时。
对于PSG-J观察到类似的趋势，其中对于用80％甲苯制得的整体单段，kN是0.31和kPy是0.79。当甲苯的浓度从80％下降到73％时，kN(0.49)和kPy(1.23)值提高了37％和36％。用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-J的分离系数分别地是2.55和2.51。
当对比用80％和73％甲苯制得的PSG整体单段时，萘和芘的拆分能力差别较大。当孔隙尺寸减少时，这通过使用较低体积的甲苯来实现，随着在相同分离溶液条件下的保留和拆分的增加，PSG表面增大。因此，多孔基体的渗透性影响被分析物的保留。
实施例18
原料。用(S)-N-3，5-二硝基苯甲酰基-1-萘基甘氨酸改性的5μm球形手性颗粒是由the Graduate School of PharmaceuticalSciences，University of Tokyo(东京，日本)和Sumika ChemicalAnalysis Service(大阪，日本)提供。D-和L-氨基酸，D-和L-非蛋白质氨基酸(NPAA)，3甲基丙烯酸-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯和4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑(NBD-F)是从Sigma(St.Louis，Mo，USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)或Fluka(Ronkonkoma，NY，USA)商购并以接收到的形式使用。Irgacure 1800是Ciba(Tarrytown，NY，USA)商购。双次蒸馏水用于全部样品和缓冲剂的制备。HPLC-级乙腈是从Aldrich商购并且无需进一步提纯就使用。
熔结玻璃料制造和柱填充。该光聚合程序是按照在M.Kato，M.Dulay，B.Bennett，J.Quirino，和R.Zare，Journal ofChromatography A，924(2001)，187-195页中所述来进行。现场自由基聚合反应通过辐射在从Polymicro Technologies(Phoenix，AZ，USA)商购的熔凝硅石毛细管(75μm i.d.×365μm o.d.)中的单体溶液来引发。单体溶液的辐射通过XL-1500 UV crosslinker(Spectronics，Westbury，NY，USA)来进行，它具有六只15W荧光黑光灯管，产生主要地365nm波长的UV光。
该溶胶-凝胶溶液是由750μl的甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯，22.5μl的0.12M盐酸和225μl的水组成，并在室温下在黑暗中搅拌30分钟。将170μl体积的甲苯加入到30μl的该溶胶-凝胶溶液中和在室温下搅拌30分钟。将8.9mg量的Irgacure 1800加入到甲苯混合物并在室温下搅拌1小时。这一程序形成了我们称作溶液A的产物。
首先制备出口熔结玻璃料。用剃刀从距离30cm长的毛细管的末端约10cm处除去约3mm区段的聚酰亚胺涂层。该毛细管然后使用注射器填充溶液A。在毛细管暴露于UV光5分钟之前，毛细管的两端用蜡膜(parafilm)密封。熔结玻璃料的存在可在100倍放大下检查来证实。该整体单段材料具有不透明外观和是非常多孔性的。
该毛细管利用来自注射器的压力用乙醇漂洗以除去未反应的溶液。通过用注射器和手持钳子将10mg的手性颗粒的超声波处理(5分钟)过的淤浆引入到毛细管柱中，在毛细管中制备15cm填充手性区段。
最后，在柱中按照与出口熔结玻璃料同样的方式制备进口熔结玻璃料。从距离毛细管的出口约25cm和距离出口熔结玻璃料15cm处除去3mm区段的聚酰亚胺涂层。溶液A使用由手持钳子加压的注射器被引入毛细管中。所形成的熔结玻璃料紧接着该填充区段的末端。
在出口紧接着在填充区段之后通过使用热的硫酸(＞100℃)产生检测窗口。该柱用已经通过超声波处理方法被脱气的运动缓冲液预先调理(用手持钳子将柱进口加压至大约200psi)。接着，通过在15kV的外加电压下以电动力学方式驱动缓冲液移动相通过毛细管，直至达到稳定的基线为止，使该柱进一步在CE仪器中调理。这一程序典型地花费2到3小时来完成。
氨基酸的衍生化。10μl体积的在0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.0)中的各5mM氨基酸或NPAA和10μl的在乙腈中的5mM NBD-F进行混合并在60℃下加热5分钟。在添加20μl的运动缓冲液之后，混合物在10kV下以电动力学方式注射到毛细管中达5秒。
分离。全部分离是在Beckman P/ACE 5000毛细管电泳系统(Fullerton，CA，USA)上进行。该仪器装有空气冷却的488nm氩离子激光器。具有15cm手性填充区段的毛细管柱用于氨基酸的分离。衍生化的氨基酸样品在20℃的温度下以电动力学方式(0.33kV/cm)注射到柱中。在分离过程中的外加电压主要地是0.83kV/cm或0.50kV/cm。未保留化合物的洗脱时间是从注射到第一个溶剂干扰峰出现为止的时间。第一个干扰峰的速度是1.28mm/s，当对柱施加0.83kV/cm的电压时。通过检测它们的荧光强度(激发波长是488nm，对于发射有520nm的波段通过过滤器(band pass filter))来观察被分析物。对映异构体分离的效率是由拆分系数的值测量，后者被定义为：
拆分系数＝2(tA-tB)/(WA+WB)
其中tA是有较多保留性的对映异构体(A)的保留时间，tB是有较少保留性的对映异构体(B)的保留时间，以及WA和WB是物质A和B的峰宽度。
扫描电子显微镜法(SEM)分析。填充的毛细管被切成5mm段。这些段被溅射金，以便于SEM分析。在扫描电子显微镜(PhilipsSEM 505，Eindhoven，The Netherlands)上进行SEM分析。
用于在实施例18中所述的实验中的填充毛细管能够被认为具有三个区段：(1)出口熔结玻璃料，(2)填充的区段，和(3)进口熔结玻璃料。正如在图18中所看出的，该出口熔结玻璃料似乎是由互联1μm直径球形结构的网络组成。在出口熔结玻璃料中没有所包埋的颗粒。在溶胶-凝胶网络中看见有3μm通道(暗区)。这些通道允许离子和液体的通过，但防止手性颗粒的脱逸。
然而，如在图19中所示，该进口熔结玻璃料含有一些包埋的手性颗粒。这是在辐射之前颗粒进入毛细管的填充区段中时，颗粒与溶液A混合的结果。包括出口熔结玻璃料的互联球形结构不再看出。作为替代，SEM显微照片(图19)显示一些无定形结构，它覆盖手性颗粒和结合手性颗粒而形成该进口熔结玻璃料。在颗粒的存在和不存在下在两种熔结玻璃料之间观察到的结构差异类似于其它人的报道。
图20是毛细管的填充段的截面的显微照片。该溶胶-凝胶材料没有在填充段的任何部分中形成，因为在熔结玻璃料的光聚合过程中聚酰亚胺涂层阻断了UV光进入毛细管的该区段中。因此，该填充段仅仅由手性颗粒组成，后者由出口和进口熔结玻璃料固定就位。
手性分离。通过分离荧光衍生化氨基酸，来考察填充手性柱的性能。该结果然后与在使用溶胶-凝胶材料包埋相同的手性颗粒的整体单段式柱上进行的以前报道的氨基酸分离进行对比。在先前的报导中，13种衍生化氨基酸和三种NPAA的混合物是通过使用5mM磷酸盐缓冲液(pH2.5)和乙腈的分离溶液，在手性颗粒填充的整体单段式柱上被分离。通过在与以前同样的条件下使用填充柱分离氨基酸和NPAA的相同的混合物。具体地说，分离溶液是5mM磷酸盐缓冲液(pH2.5)-乙腈(30∶70)的混合物，该电场强度是0.50kV/cm，和该温度是20℃。
表4列出了NBD-氨基酸和NBD-NPAA的保留时间，拆分系数，洗脱顺序，和板高度。
表4
NBD-氨基酸对映异构体分离的洗脱时间，拆分系数，和板高度第一种洗脱对映异构体的洗脱时间(分钟)第二种洗脱对映异构体的洗脱时间(分钟)拆分系数洗脱顺序第一种洗脱对映异构体的板高度(μm)丙氨酸8.288.354.01D.L8.7谷氨酰胺7.237.972.63D.L14谷氨酸39.7242.201.21D.L20甘氨酸8.4316异亮氨酸6.928.104.41D.L12蛋氨酸7.248.634.90D.L12苯丙氨酸7.769.144.68D.L12脯氨酸11.0611.651.38L.D13丝氨酸7.498.293.02D.L11苏氨酸6.246.912.77D.L13缬氨酸7.408.545.03D.L112，3-二氨基丙酸7.178.358.29N.I392-氨基丁酸7.178.353.78N.I133-氨基丁酸6.36.841.89N.I18
N.I.：不鉴别。
大部分的NBD-氨基酸和NBD-NPAA在10分钟内洗脱，而NBD-谷氨酸(Glu)对映异构体在40分钟内洗脱。在填充柱中，与在颗粒填充的整体单段式柱中相同的分离相比，氨基酸的保留时间被缩短。在我们的实验条件下，电渗流是非常小的或可以忽略的以及电泳速度是被分析物迁移通过该柱的主要的驱动力。填充柱和整体单段式柱的分离溶液和外加电压是相同的，因此这些被分析物的电泳速度在填充柱和整体单段式柱之间是类似的。在两种柱之间的不同保留时间是因为在移动相和静止相之间不同分配所引起。在填充柱和整体单段式柱之间的结构差异导致了在被分析物的分配上所观察到的差异。
通过使用由光聚合溶胶-凝胶熔结玻璃料制造手性柱，全部的NBD-氨基酸和NBD-NPAA被很好地拆分。拆分系数是在1.21和8.29之间。这些值比在颗粒填装的整体单段式柱中的值大了约1.5倍。在填充柱上NBD-氨基酸的洗脱顺序与在整体单段式柱上的那些一样，其中NBD-D-氨基酸洗脱得比NBD-L-氨基酸更快，但NBD-Pro除外。NBD-NPAA的洗脱顺序没有证实，因为样品是由外消旋混合物组成而不是由旋光活性混合物组成。
NBD-氨基酸和NBD-NPAA的板高度是在填充柱上低于20μm，但NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸除外。在整体单段式柱中，NBD-氨基酸和NBD-NPAA的板高度是在14和65μm之间。这些板高度是比在填充柱中的那些高约两倍。
这些NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸显示比在填充柱和整体单段式柱两者中其它NBD-氨基酸和NBD-NPAA更差的分离效果。在色谱分离中，导致质量转移速度下降的附加的相互作用会提高被分析物的板高度。Glu具有两个羧基，该羧基与氨基丙基硅胶的改性氨基形成离子相互作用。2，3-二氨基丙酸的两个氨基是用NBD结构衍生化，使得它不同于其它氨基酸和NPAA。这两个NBD结构可以与填充颗粒形成一些附加的π-π相互作用。因此NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸显示出比在填充柱和整体单段式柱两者中的分离效果更差的分离效果。全部NBD衍生物，其中包括NBD-Glu和NBD-2，3-二氨基丙酸，的板高度是填充柱的比整体单段式柱的更小。
图21A显示了NBD-DL-丙氨酸(Ala)和NBD-DL-苏氨酸(Thry)的样品在填充柱上的电色谱，而图21B是同样的样品在整体单段式柱上的电色谱。在填充柱上实现了类似的洗脱时间，与使用0.5kV/cm的外加电场的整体单段式柱相比。在图21B中在约6分钟观察到的峰是从氟产生剂的水解所产生。在氨基酸之间的分离已经在填充柱上大大地改进。在图21中可以看出，用填充柱实现了样品组分的基线分离，与整体单段式柱相比。在填充柱中各NBD-氨基酸的峰形状是比在整体单段式柱中的峰更尖锐。这些合结果表明填充柱的分离效率优于整体单段式柱的分离效率。
与整体单段式柱相比，在填充柱中氨基酸样品的分离效率和拆分系数的改进归因于该氨基酸与手性颗粒的更佳相互作用。在颗粒填充的整体单段式柱中，由于颗粒被包封在溶胶-凝胶基体中，这些颗粒已经部分地被屏蔽。在溶胶-凝胶基体不存在的情况下，质量转移得到改进。在整体单段式柱上较低分离效率的另一个理由是在溶胶-凝胶结构中的一些不均匀性，如小的缝隙或裂纹。在用于包埋手性颗粒的溶胶-凝胶的热聚合过程中，当乙醇从反应混合物中蒸发时产生该缝隙或裂纹。光聚合允许避免使用热量，因此避免了在整体单段式结构中这些缝隙或裂纹的形成。
使用光聚合溶胶-凝胶形成熔结玻璃料的附加优点是在制备中的容易和速度以及在控制熔结玻璃料的长度和位置上的容易性，与其它光聚合的或硅酸盐熔结玻璃料的制备相比。熔结玻璃料是在我们的填充柱中通过暴露于UV光在5分钟中制得。甲基丙烯酸酯型试剂在熔结玻璃料中的使用需要1-16小时的聚合时间。对于硅酸盐熔结玻璃料，制造仅仅需要几秒，但是需要毛细血管壁的预处理。因此，使用硅酸盐熔结玻璃料的填充毛细管的制备需要一个小时来制造该填充柱。此外，更难于控制通过加热制备的熔结玻璃料的位置和置放。
由于溶胶-凝胶熔结玻璃料的高的孔隙度，在极低压力(约200psi，来自手持钳子上的注射器)需要仅仅30分钟在毛细管中填充15cm区段的手性颗粒。背压对于光聚合溶胶-凝胶熔结玻璃料是极低的，与硅酸盐或光聚合的甲基丙烯酸酯熔结玻璃料相比。
短填充多段式柱的性能。在该填充柱中，NBD-氨基酸对映异构体的板高度是比整体单段式柱小两倍。因此，NBD-氨基酸预计以短的脱离时间通过短填充柱来分离。NBD-氨基酸对映异构体(NBD-Phe，-Val，-Gln，-Thr)的分离是在5cm填充段柱上的分离。短的填充柱在仅仅5分钟内分离NBD-Phe对映异构体(图22)。NBD-Phe对映异构体的分离系数和NBD-D-Phe的板高度分别是2.22和8μm。板高度在短填充柱上改进，然而该分离系数却下降，由于短填充段。
实施例19
PSG整体单段的制备。在毛细管柱中母体PSG结构的制备以前已有描述。用于以结合相来使母体PSG的表面衍生化的程序也已经描述。然而，衍生反应的长度通常是在较大i.d.毛细管中长度的两倍，与较小i.d.毛细管相比。
分离。硫脲，乙酰苯，丙酰苯和丁酰苯的混合物(全部以毫摩尔的量)已经以电动力学方式注入到PSG填充的毛细管中。最低注射时间是15秒。该外加电压是8kV到15kV。
紫外吸收检测器用于检测该被分析物峰。高压电源用于为毛细管提供电压。全部其它实验细节类似于早已针对分析用途(小i.d.)PSG填充的毛细管有出版公开的那些。每一种被分析物的贮备溶液是作为1mg烷基苯基酮在1mL乙腈中的溶液来制备。硫脲在水中的50mM贮备溶液用于样品溶液的制备。
结果。被分析物的分离是按照相同的反相机理，其中更多疏水性的被分析物比较少疏水性的被分析物更迟洗脱。当注射时间(即栓塞长度)增加时，观察被分析物的预浓缩。
在图23中，硫脲和烷基苯基酮的混合物是在填充了用C8结合相(PSG-C8)衍生化的10cm PSG整体单段的250μm i.d.毛细管上进行预浓缩和分离。长的注射栓塞长度允许将多达0.74ng的丙酰苯装载到该柱上。荷载越高，峰变得更加尖锐。可以相信，在峰形状和高度上有折中之前能够将更多的被分析物装载到柱上，而且不再能实现预浓缩。
装载到柱上的丙酰苯的量能够通过使用填充了相同的PSG整体单段的350μm i.d.毛细管而增加到7.43ng，如在图24中所示。在拆分系数上有一点损失，但峰已经变宽。
图25显示硫脲和丙酰苯在填充了相同的PSG整体单段的540μm i.d.毛细管中的分离。0.86ng的丙酰苯以3.73mm的短的注射长度被装载到柱上。
已经开发了使用光聚合溶胶-凝胶熔结玻璃料和整体单段来制备填充柱的一种容易和快速的方法。在色谱分析实验的任何一个中没有观察到气泡形成。尽管上面已经参考各种实施方案描述了本发明，但应该理解的是在不脱离本发明的范围的前提下可以作一些变化和改进。本发明包括在所附权利要求的字面上的和合理的范围内的全部变化和改进。以上引用的全部参考文献以它们的全部内容被引入这里供参考。