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1、10申请公布号CN104059159A43申请公布日20140924CN104059159A21申请号201410269480122申请日20140617C08B37/0020060171申请人湖南农业大学地址410128湖南省长沙市芙蓉区农大路1号72发明人贺建华符晨星瞿俊勇游思湘刘湘新74专利代理机构湖南兆弘专利事务所43008代理人江巨鳌54发明名称纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法57摘要本发明属于中药活性成分提取生产工艺领域，具体涉及一种响应面分析优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖方法及最佳提取工艺条件。本发明采用纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖，用纤维素酶法热水浸提、灭活酶、浓缩、醇。
2、沉、脱蛋白、醇沉、脱色素、醇沉、提取率测定等步骤，即按照1812料液比和添加2左右的纤维素酶热水浸提两次，80醇沉三次，三氯乙酸脱蛋白两次，活性炭吸附脱色两次。本发明由响应面三维图获得白花蛇舌草多糖最佳提取工艺条件为PH7左右、温度55、纤维素酶用量2，在此条件下白花蛇舌草多糖提取率为983。51INTCL权利要求书2页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页10申请公布号CN104059159ACN104059159A1/2页21一种纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法，其特征在于按照白花蛇舌草与水重量比1812的料液比配制提取液，在提取液中添加纤。
3、维素酶热水浸提，80醇沉，脱蛋白，脱色素，最后精制而成；具体按如下步骤进行1热水浸提将白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，按1812重量比的料液比加入水配制成白花蛇舌草提取液；用磷酸缓冲液调节PH为7，加入1525的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌加热提取60分钟，抽滤得滤液；将滤渣按1812重量比的料液比加入水，用磷酸缓冲液调节PH为7，再加入1525的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌加热提取60分钟再提取一次，抽滤得滤液，合并两次滤液，对滤液进行90灭活酶10分钟；2浓缩将滤液真空旋转减压浓缩至浓度为含生药051克/毫升，放至室温；3第一次醇沉在浓缩液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严。
4、，静置2448小时；抽滤，得白花蛇舌草粗多糖；4脱蛋白将白花蛇舌草粗多糖加适量水溶解，加等体积5的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上清液，再重复以上操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；5第二次醇沉在脱蛋白后的白花蛇舌草多糖液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置2448小时；抽滤，用无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得白花蛇舌草多糖；6脱色素将白花蛇舌草多糖用适量水溶解，加入重量1的活性炭，混匀，加热至80温度搅拌30分钟，过滤，收取滤液；将滤液加入重量1的活性炭，混匀，加热至80温度搅拌30分钟，过滤，得脱色素白花蛇舌草多糖溶液；7第三次醇沉。
5、将脱色素白花蛇舌草多糖液加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得精制白花蛇舌草多糖。2根据权利要求1所述的纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法，其特征在于1取白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，称取白花蛇舌草粉末20克，加水至200毫升，混合均匀；用磷酸缓冲液调节PH为7左右，在料液中添加2的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸提60分钟；对滤渣进行第二次热水浸提，加水至200毫升，混合均匀，用磷酸缓冲液调节PH为7左右，添加2的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸提60分钟，抽滤得滤液，合并二次滤液进行90灭活酶10分钟；2浓缩将滤液真空旋转。
6、减压浓缩至3040毫升，放至室温；3第一次醇沉以上制备的浓缩液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，真空干燥，得白花蛇舌草粗多糖；4第一次脱蛋白将以上所制得的白花蛇舌草粗多糖加2030毫升超纯水溶解，加等体积5的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上清液；5第二次脱蛋白将上清液再加等体积5的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上清液，得脱蛋白多糖溶液；6第二次醇沉以上脱蛋白多糖溶液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；进行抽滤，用无水乙醇洗涤23次，脱蛋白多糖与无水乙醇WV权利。
7、要求书CN104059159A2/2页3为135KG/L，真空干燥，得脱蛋白多糖；7第一次脱色素将以上制得的脱蛋白多糖加2030毫升超纯水溶解，按照1重量加入活性炭，搅匀，加热至80搅拌30分钟，过滤，取滤液；8第二次脱色素将以上所得滤液再按照1浓度加入活性炭搅匀，加热至80搅拌30分钟，过滤，取滤液；9第三次醇沉将以上制得的脱色素多糖液加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得白花蛇舌草精制多糖176179克。权利要求书CN104059159A1/7页4纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法技术领域0001本发明属于中药活性成分提取。
8、生产工艺领域，具体涉及一种用响应面分析优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖方法及最佳提取工艺条件。背景技术0002多糖又称为多聚糖，是由醛糖或酮糖等单糖通过苷链聚合在一起的一类天然高分子化合物，其分子量一般为数万甚至达数百万，广泛存在于动物细胞膜，植物和微生物细胞壁中，到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被提取出来，其中从中药材中获得的水溶性多糖最为重要。研究表明中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝等多种功能，其中中药多糖的免疫调节活性及抗肿瘤作用倍受关注，是中药多糖研究的中心课题。目前，多糖提取的主要方法有热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、。
9、超声波提取法和微波提取法等，这些方法都存在一定的不足，如提取率较低、纯度不高，或者提取温度太高破坏多糖活性，或者会引起多糖分子的降解等。目前，多糖提取工艺多为均匀设计和正交设计，这些设计是采用固定其他因素，改变一个因素的单因素考察法确定工艺条件，不能考察因素之间的相互作用，同时也很难考察多个响应值与因素之间的交互作用关系，因此精确度不高。近年来，国内已开始将生物酶应用于中药活性成分的提取，多糖存在于植物的细胞壁中，纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，裂解植物的细胞壁，从而增大细胞内有效成分向提取介质的扩散而提高多糖得率。响应面分析是一种最优化方法，它是将体系的响应作为一个或多个因素的函数，。
10、运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件，可以准确找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，是理想的方法。响应面分析法克服了正交试验设计只能处理离散的水平值，无法找出整个区域上的最佳组合和响应值的最优值的缺陷，用该法研究提取工艺参数，求得的回归方程精确度高。白花蛇舌草是茜草科RUBIACEAE耳草属植物白花蛇舌草HERBAHEDYOTIS的干燥全草，白花蛇舌草多糖是其重要的活性成分，具有抗菌消炎、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。为提高白花蛇舌草多糖的提取率，并准确地找出工艺条件的最佳组合，本发明提供了响应面分析优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的。
11、工艺，以酶解与热水浸提相结合的方法提取白花蛇舌草多糖，工艺简便、省时，提取率高；提取工艺采用响应面分析设计，所得最佳工艺参数可靠、精确，为白花蛇舌草多糖的规模生产和应用提供了一种实用的方法，对于白花蛇舌草的综合开发利用及提高其经济价值具有实际意义。发明内容0003本发明采用纤维素酶法对白花蛇舌草多糖进行提取，并采用响应面设计确定最佳工艺条件，最大限度的去除蛋白质、色素等杂质，制备出含量相对稳定的白花蛇舌草多糖。0004本发明所用的方法为采用纤维素酶法从白花蛇舌草提取白花蛇舌草多糖的工艺方法。说明书CN104059159A2/7页50005本发明采用纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖的工艺方法为将干燥。
12、的白花蛇舌草进行粉碎，加入纤维素酶进行浸提，酶灭活、浓缩、醇浓、脱蛋白、脱色素步骤，具体要求为，按照白花蛇舌草与水重量比1812料液比配制进行浸提，在上述料液中加入1525的纤维素酶，用热水浸提两次，灭活酶、80醇沉三次，三氯乙酸脱蛋白两次，活性炭吸附脱色两次，苯酚硫酸法测定多糖含量和提取率。工艺分为添加纤维素酶热水浸提、灭活酶、浓缩、醇沉、脱蛋白、醇沉、脱色素、醇沉等步骤，具体按如下步骤进行00061添加纤维素酶热水浸提两次浸提，将白花蛇舌草粉碎过40目筛。称取白花蛇舌草粉末，按重量比1812的料液比加入水，混合均匀；用磷酸缓冲液调节PH为7左右，添加1525的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸。
13、提60分钟；90灭活酶10分钟，抽滤得滤液；将滤渣按重量比1812的料液比加入水，混合均匀，用磷酸缓冲液调节PH为7左右，添加1525的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸提60分钟；90灭活酶10分钟，抽滤得滤液；合并两次滤液。00072浓缩将滤液真空旋转减压浓缩至浓度为含生药051克/毫升左右，放至室温；00083第一次醇沉浓缩液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置2448小时；抽滤，得白花蛇舌草粗多糖；00094脱蛋白将白花蛇舌草粗多糖加适量水溶解，白花蛇舌草粗多糖与水比例WV为1115KG/L，加等体积5的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上。
14、清液；再重复以上操作进行第二次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；00105第二次醇沉脱蛋白多糖液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置2448小时；抽滤，无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得脱蛋白多糖；00116脱色素将以上所得多糖用适量水溶解，白花蛇舌草粗多糖与水比例WV为1115KG/L，加入重量1的活性炭，混匀，加热至80搅拌30分钟，过滤，取滤液。滤液再按照以上重复操作一次，得脱色素多糖溶液；00127第三次醇沉将以上制得的脱色素多糖液加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得精制多糖。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，并计算。
15、多糖得率。0013本发明应用了响应面分析优化设计的方法对多糖的提取工艺进行了优化设计。00141各单因素对白花蛇舌草多糖提取率的影响00151纤维素酶用量对多糖提取率的影响纤维素酶用量对多糖提取率的影响见表1。从表1可以看出，随着纤维素酶用量的增加，多糖的提取率也随之增大，当纤维素酶用量达2时，继续增加纤维素酶用量，多糖提取率基本不再增加。0016表1纤维素酶用量对多糖含量和多糖提取率的影响0017纤维素酶用量05115225多糖含量G06140702102417821740多糖提取率307351512891870说明书CN104059159A3/7页600182提取温度对多糖提取率的影响提取。
16、温度对多糖提取率的影响见表2。从表2可看出，在3050范围内随着提取温度的升高提取率也随之上升，50左右时达到最高点，之后随着温度上升，提取率反而下降，这说明纤维素酶的最适温度在50附近。0019表2提取温度对多糖含量和提取率的影响0020提取温度4050607080多糖含量G10161224115007820794多糖提取率50861257539139700213提取时间对多糖提取率的影响提取温度对多糖提取率的影响见表3。从表3可看出，随着提取时间的增加，多糖提取率无明显变化。0022表3提取时间对多糖含量与多糖提取率的影响0023提取时间MIN306090120150多糖含量0802086。
17、2089410061076多糖提取率40143144750353800244提取PH对多糖提取率的影响提取PH对多糖提取率的影响见表4。从表4可看出，在PH37范围内，随着PH增大白花蛇舌草多糖的提取率也随之增加，到达PH7后，提取率下降，说明纤维素酶的最适PH是7左右。0025表4提取PH对多糖含量与多糖提取率的影响0026PH345678多糖含量G030205120866101611340844多糖提取率15125643350856742200272用响应面分析优化设计提取方案0028根据响应面设计的要求，统计模型发现3个影响因素提取PH、温度、纤维素酶用量对多糖提取率和含量有显著影响。因。
18、此在单因素的基础上进行三因素三水平的响应面设计分析。试验因素及水平如下表5。0029表5纤维素酶响应面优化提取还花蛇舌草的因素与水平0030水平提取温度PH值纤维素酶用量140305说明书CN104059159A4/7页70507218082500313纤维素酶响应面提取白花蛇舌草多糖试验结果及显著性分析0032根据响应面设计的DESIGNEXPERT软件，得到响应面优化纤维素酶法提取白花蛇舌草多糖试验结果和回归方程见表6。0033表6响应面优化纤维素酶提取白花蛇舌草多糖试验结果003400354纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖模型显著性分析0036纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖模型。
19、显著性分析结果见表7。0037表7纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖模型显著性分析0038来源平方和自由度均方F值P值模型1330291478497200001A提取温度021102107204245BPH9711971326600007C酶用量234512345788900001AB111111137400945说明书CN104059159A5/7页8AC097109732701136BC028102809403656A2296112961996100001B27711771259500014C2124112441700804残差2087030失拟2043068602100009误差004。
20、540011总异变135101600390040由响应面分析结果得知，白花蛇舌草多糖提取率预试验结果表明提取PH值、提取温度和纤维素酶用量对多糖提取率都有显著影响，其中纤维素酶用量与PH的影响最突出，提取温度影响相对次之。由响应面三维图得白花蛇舌草多糖提取的最佳工艺条件为PH7左右、提取温度55、纤维素酶用量2，在此条件下白花蛇舌草多糖提取率为983。0041本发明的有益效果是酶法是一种温和的方法，不会破坏多糖的结构，可提高多糖的得率，并且可以大规模用于工业化生产，是获得生物活性多糖的高效方法。采用响应面分析法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有指导规模生产价值，应用与生产具有一定的市场前景和。
21、相应的社会效益、经济效益。具体实施方式0042实施例11热水浸提取白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，称取白花蛇舌草粉末，按812的比例与水混合均匀；用磷酸缓冲液调节PH为7左右，在料液中添加1525的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸提60分钟；00432灭活酶对提取后的溶液在90灭活酶10分钟，抽滤得滤液；00443对滤渣再添加纤维素酶热水进行第二次浸提将第一次提取所得的滤渣，按重量比1812的比例与水混合均匀；用磷酸缓冲液调节PH为7左右，添加1525的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸提60分钟；00454灭活酶对第二次的滤液进行90灭活酶10分钟，抽滤得滤液；合并两次滤液。00465浓缩将滤液真。
22、空旋转减压浓缩至相当于生药051克/毫升，放至室温；00476第一次醇沉以上制备的浓缩液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，真空干燥，得白花蛇舌草粗多糖；00487第一次脱蛋白将以上所制得的白花蛇舌草粗多糖加适量超纯水溶解，WV为说明书CN104059159A6/7页91115KG/L，加等体积5的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上清液；00498第二次脱蛋白将上清液再加等体积5的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上清液，得脱蛋白多糖溶液；00509第二次醇沉以上脱蛋白多糖溶液中加入95乙醇至醇浓。
23、度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得脱蛋白多糖；005110第一次脱色素将以上制得的脱蛋白多糖加适量超纯水溶解，WV为1115KG/L，加入1活性炭，搅匀，加热至80搅拌30分钟，过滤，取滤液；005211第二次脱色素将以上所得滤液再加入1活性炭搅匀，加热至80搅拌30分钟，过滤，取滤液；005312第三次醇沉将以上制得的脱色素多糖液加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得白花蛇舌草精制多糖。005413多糖含量测定采用苯酚硫酸法测定多糖含量，并计算多糖得率。0055本发明按照响应。
24、面图像分析所得的最佳提取条件提取温度55、提取PH7、料液中加入纤维素酶用量为2，进行3次提取，结果见表8，白花蛇舌草多糖提取率分别为881、892和894，与模型预测差异较小，说明该模型能够很好地反映出白花蛇舌草多糖提取的优化条件。0056表8纤维素酶响应面优化提取白花蛇舌草多糖具体实施结果0057具体测定次数第一次第二次第三次多糖含量G176178179多糖提取率8818928950058实施例21热水浸提取白花蛇舌草进行粉碎，过40目筛，称取白花蛇舌草粉末20克，加水至200毫升，混合均匀；用磷酸缓冲液调节PH为7左右，在料液中添加2的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸提60分钟；对滤渣进行。
25、第二次浸提，加水至200毫升，混合均匀，用磷酸缓冲液调节PH为7左右，添加2的纤维素酶，混匀，55水浴搅拌浸提60分钟，抽滤得滤液，合并两次滤液，灭活酶，对滤液进行90灭活酶10分钟。00592浓缩将滤液真空旋转减压浓缩至3040毫升，放至室温；00603第一次醇沉以上制备的浓缩液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，真空干燥，得白花蛇舌草粗多糖；00614第一次脱蛋白将以上所制得的白花蛇舌草粗多糖加2030毫升超纯水溶解，加等体积5的三氯乙酸，边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上清液；00625第二次脱蛋白将上清液再加等体积5的三氯乙酸，。
26、边加边搅拌，静置60分钟，3000RMP离心5分钟，取上清液，得脱蛋白多糖溶液；00636第二次醇沉以上脱蛋白多糖溶液中加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时，抽滤，用无水乙醇820毫升洗涤23次，脱蛋白多糖与说明书CN104059159A7/7页10无水乙醇WV为135KG/L，真空干燥，得脱蛋白多糖；00647第一次脱色素将以上制得的脱蛋白多糖加2030毫升超纯水溶解，加入重量1活性炭，搅匀，加热至80搅拌30分钟，过滤，取滤液；00658第二次脱色素将以上所得滤液再加入重量1活性炭搅匀，加热至80搅拌30分钟，过滤，取滤液；00669第三次醇沉将以上制得的脱色素多糖液加入95乙醇至醇浓度为80，边加边搅拌，密封盖严，静置24小时；抽滤，用无水乙醇洗涤23次，真空干燥，得白花蛇舌草精制多糖176179克。说明书CN104059159A10。