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1、10申请公布号CN104127869A43申请公布日20141105CN104127869A21申请号201410342886822申请日20140718CGMCCNO898120140401CGMCCNO898220140401A61K39/116200601A61K39/095200601A61P31/04200601C07K1/36200601C07K1/30200601C07K1/34200601C07K1/16200601C07K1/20200601C07K14/22200601C12N1/2020060171申请人北京祥瑞生物制品有限公司地址101407北京市怀柔区雁栖经济开发区雁。
2、栖北三街17号72发明人王建华74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗及其制备方法57摘要本发明提供一种多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗，所述疫苗是由来自于B群脑膜炎球菌CMCC29356株、CMCC29361株、保藏编号为CGMCCNO8982的XRSW341215株和保藏编号为CGMCCNO8981的XRSW210902株的菌体外膜囊OMV蛋白组成的多价联合疫苗，任选含有药用赋形剂和/或佐剂。本发明疫苗针对世界各地B群流脑预防具有较广泛的交叉保护抗体效价，并对A、C群流脑也具有良好的交叉保护性。同时提供了完整的多价B群脑膜炎球菌蛋白。
3、疫苗生产工艺，适合规模化生产。研究表明，本疫苗具有良好的免疫原性及可靠的安全性及稳定的免疫持久性。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书18页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书18页10申请公布号CN104127869ACN104127869A1/1页21多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗，其特征在于，所述疫苗是由来自于B群脑膜炎球菌CMCC29356株、CMCC29361株、保藏编号为CGMCCNO8982的XRSW341215株和保藏编号为CGMCCNO8981的XRSW210902株的菌体OMV蛋白组成的多价联合疫苗，任选含有药用赋形剂和/或佐剂。2。
4、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是由来自于4株B群脑膜炎球菌的OMV蛋白按等重量份混合组成。3根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为液体剂型或冻干剂型。4根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为液体剂型，任选含有铝佐剂；所述铝佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。5根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为冻干剂型，任选含有赋形剂，所述赋形剂包括但不限于乳糖、蔗糖、明胶、山梨醇或人血白蛋白；用于稀释疫苗的稀释液是磷酸盐缓冲生理盐水、生理盐水，或含有铝佐剂的缓冲液或生理盐水，其中，每毫升稀释液中铝含量为00502MG。6权利要求15任一项所述疫苗的制备方。
5、法，其特征在于，包括以下步骤1分别对各B群脑膜炎球菌菌株进行种子培养，并连续传代至第4或5代进行发酵罐培养，待细菌生长至对数生长期后期或静止期前期，终止培养，离心收集菌体；2OMV蛋白溶出用生理盐水或PH688的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤并离心收获菌体，向菌体中加入提取液溶出OMV蛋白，离心收集上清液；3OMV蛋白纯化将步骤2的上清液用冷乙醇分步沉淀，离心收集沉淀，用注射用水复溶后加硫酸铵分步沉淀，再用注射用水溶解后加入脱氧胆酸钠解聚，然后进行超滤，收集浓缩液，用三氯醋酸沉淀，离心收集沉淀，用水溶解后超滤浓缩；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、G25凝胶层析和分子筛层析，收集样品，除菌过滤后即得。
6、OMV蛋白原液；4测定各菌株OMV蛋白原液中的蛋白含量，按比例混合后即得；其中，步骤2中使用的提取液为0515M的NACL溶液，或0108M的氯化锂醋酸钠溶液。7根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3具体为向步骤2的上清液中加入冷乙醇至终浓度5575，离心收集沉淀，用注射用水复溶，加1565硫酸铵分步沉淀，分别收获上清或沉淀物，经注射用水复溶，用注射用水溶解后加入脱氧胆酸钠至终浓度0210，振荡后进行超滤，收集浓缩液，加入三氯醋酸至终浓度0230，离心收集沉淀，用水溶解后超滤浓缩；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、G25凝胶层析和分子筛层析，收集样品，除菌过滤后即得OMV蛋白原液。8根。
7、据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析包括阳离子交换层析和阴离子交换层析。9脑膜炎奈瑟氏菌NEISSERIAMENINGOCOCCUSXRSW341215株，其保藏编号为CGMCCNO8982。10脑膜炎奈瑟氏菌NEISSERIAMENINGOCOCCUSXRSW210902株，其保藏编号为CGMCCNO8981。权利要求书CN104127869A1/18页3多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗及其制备方法0001技术领域0002本发明涉及脑膜炎球菌疫苗及其制备方法，具体地说，涉及多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗及其制备方法。背景技术0003脑膜炎奈瑟氏菌NEISSERIAMENINGOCOCC。
8、US，NM感染所致的流行性脑脊髓膜炎流脑，是一种世界范围内致病的急性呼吸道传染病，至今仍严重危害着人类健康，尤其是儿童。NM根据其荚膜多糖结构的差异可分成13个血清群，且所有血清群均可致病。其中A、B、C、Y、W135群NM所致疾病约占NM疾病的95以上。0004基于A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖和多糖蛋白结合的各种单价A或C、双价A、C和四价ACYW135疫苗，在预防侵袭性疾病、控制疾病流行和爆发中起到了十分关键的作用和理想效果，有效地控制了疫苗型疾病的发生。0005而B群脑膜炎球菌荚膜多糖，由于其包含了与人类抗原潜在交叉免疫的表位，致使其免疫原性很弱，且能诱发自身免疫病，因此，以。
9、B群NM荚膜多糖为免疫原的疫苗研究遇到了严重挑战。0006目前国际上针对B群NM疫苗的研究主要采用二种策略，一种是基于外膜蛋白的外膜囊泡OUTERMENBRANEVESICLEOMV疫苗，即针对某些特定流行菌株的克隆群；另一种是基于反向疫苗学技术的重组蛋白疫苗。0007上世纪70年代，美国ZOLLINGER、FRASCH等首先报道了B群脑膜炎球菌外膜囊泡OMV疫苗的研究。随后分别有三种代表性OMV疫苗问世。00081986年，巴西、古巴等南美国家B群流脑开始流行，基于古巴流行B群脑膜炎球菌CU385/83菌株B4P119,15，古巴FINLAY研究所研制出VAMENGOCBC疫苗，含B群OMV。
10、、C群CPS荚膜多糖、ALOH3佐剂。1989年获得生产许可，1991年纳入免疫规划，已累计接种5500万剂次。00091991年，挪威公共卫生研究所NORWEGIANINSTITUTEOFPUBLICHEALTH，NIPH采用流行的B群脑膜炎球菌44/76SLB15P17,16为疫苗株，研制出MENBVACTMB群OMV疫苗，后转让给凯龙CHIRON公司，并开始研制及规模化生产。00101991年，新西兰出现B群流脑流行，并基于20042008年间爆发疾病分离株NZ98/254CC41/44,B4P1724研制出B群脑膜炎球菌疫苗MENZB。0011反向疫苗学技术主要通过基因重组表达技术，分。
11、别克隆表达出FHBP、NADA和NHBA三种蛋白作为B群NM蛋白疫苗的候选成分。目前国际上已有两种通过反向疫苗学技术研发的B群流脑蛋白疫苗，分别是诺华公司的4CMENBBEXSERO和辉瑞公司的BIVALENTFHBPRFHBP。00124CMENBBEXSERO含有FHBP1型蛋白、NADA蛋白和NHBA蛋白，之后又加入新西兰说明书CN104127869A2/18页4B群OMV疫苗MENZB。0013BIVALENTFHBPRFHBP是含有FHBP1型和3型的双价蛋白疫苗。0014另外，惠氏公司的RLP2086疫苗，含有单一脂蛋白RLP2086的两种重组的脂蛋白LP2086，即两种FHBP重。
12、组脂蛋白SUBFAMILYA，VARIANTA05和SUBFAMILYBVARIANT01，也是4CMENB的一个组分，试验结果同样显示能诱导出杀菌抗体。0015其他的报道，例如BRUGE等曾将纯化B群NM荚膜多糖中的乙酰基团用丙酰基团取代，再与载体蛋白结合而制备多糖蛋白结合疫苗，尽管试验证明该疫苗安全性良好，但诱导的抗体无功能活性。0016由于不同国家、地区B群流脑流行血清型别、亚型具有明显的地域特征，至今为止开发的OMV疫苗不具有通用性。因而，对于B群流脑OMV疫苗的研发，选择适合本地区疾病发病特征的菌株尤为重要。0017欧洲地区B群NM以ST41/44CLONALCOMPLEXCC克隆群。
13、血清型15型为主，美洲和大洋洲B群NM以ST8CC、ST11CC和ST32CC血清型4型为主。我国流脑监测和NM分子流行病学研究发现，我国B群流行菌型与国外B群流行型别不同，主要以ST4821CC血清型3型为主，并在健康人群中大量定植。0018古巴、挪威、新西兰等国根据本国主要流行的B群流脑优势致病株作为疫苗株“定制”的B群NMOMV疫苗，所用菌株如下0019古巴疫苗株CU385/83PORAP119,15，PORB血清型4型；0020挪威MENBVACTM疫苗株44/76SLPORAP117,16，PORB血清型15型；0021新西兰MENZB疫苗株NZ98/254PORAP1724，POR。
14、B血清型4型。0022GSK受让古巴疫苗技术，并将该疫苗推广至其他国家，在不同地区的临床研究保护率各有不同。在19871989年，SIERRA报道在古巴对106000名1014岁学生接种2针间隔68周其保护率为83；在19891990年，MORAES报道在圣保罗进行的于2447月龄儿童中保护率为47；在47月龄以上儿童中的保护率为74；19901991年，MORONHA报道在里约热内卢进行的多个在47月龄以上儿童中的临床研究显示其保护率为5874。00231992年在巴西进行的流行病学效果观察，其对4岁以上人群的保护率为74，而对2岁以下人群无保护性，由此有学者提出该疫苗对4岁以下儿童缺乏保护。
15、作用。0024该疫苗自1989年被批准使用以来，在古巴、巴西、哥伦比亚、乌拉圭等美洲国家的使用，成功控制了流脑流行，尤其重要的是其中的一些流脑爆发是由不同的B群菌株引起的。由CASSIODEMORAES开展的实验得出的结论是“这一发现提示，该疫苗能够提供针对一部分B群脑膜炎球菌感染的保护作用，而不仅仅是疫苗型菌株”。自1991年起，被列入部分古巴婴幼儿疫苗接种规划中。争论的焦点对4岁以下人群保护作用低的假说，包括伦敦皇家医学院的许多学者、专家论证认为，即使用于婴幼儿接种也能引起适当的免疫应答。0025是多年来唯一获得批准的B群脑膜炎球菌OMV疫苗，并在主要为拉丁美洲和加勒比海地区的15个国家共。
16、接种了约5500万剂，被证明是全球第一个说明书CN104127869A3/18页5安全、有效的商业化疫苗。随后各国研究的各自“定制”的OMV疫苗，也从中获得了重要经验。但至今仍没有一个国际通用的B群脑膜炎球菌OMV疫苗。00262、OMV疫苗的保护覆盖范围的局限性0027B群脑膜炎球菌根据其PORA和PORB的蛋白分型相当复杂，血清型、亚型间彼此交叉保护性低，因此，有限价数的“定制”疫苗的保护覆盖范围有限。0028B群脑膜炎球菌OMV中的PORA被确定是一个主要的免疫应答诱导物，并且是血清杀菌抗体的靶点，许多脑膜炎球菌都表达这一蛋白。然而，不同的PORA蛋白具有不同的抗原特异性，因此，一种PO。
17、RA引起的免疫应答不能对异源PORA抗原的菌株起到防御作用。在美国进行的B群NM菌株流行情况调查时发现，将20种不同的PORA蛋白组合起来将会覆盖80流行菌株。MENBOMV疫苗已成功用于控制疾病的流行、爆发，但其有效性仅局限于控制疫苗型、亚型MENB疾病爆发，对于不同型、亚型MENB引起的疾病，其有效性受限。00293、MENBOMV生产工艺影响其抗原性0030至今为止，各国MENBOMV疫苗生产工艺各不相同，导致疫苗成分、含量、纯度及抗原天然构象完整性，均有不同程度的差异和受损。0031由于MENB的结构、成分比较复杂，其OMV抗原成分是从菌体细胞膜溶出、纯化而获得的。OMV是一种源自细菌。
18、细胞膜的，具有复杂立体构象的多种蛋白成分、LPS等组成的囊泡状结构的多位点抗原复合体，各抗原位点的协同作用而取得更好的免疫效果。0032早期的研究过分强调蛋白纯度，而采用了比较复杂的物理、化学相结合的重复工艺，破坏了OMV的天然构象和减弱了丰富的抗原位点，因而影响了疫苗的免疫原性及抗体特异性，致使保护率和免疫持久性不佳。0033回顾数十年来各国对B群NMOMV蛋白疫苗的研发，临床应用效果显示，在不同地区差异较大，分析原因可能存在以下因素0034B群NM型别、亚型较多，彼此间交叉保护性弱；0035各地区流行菌株的抗原性具有地域特征差异及目前尚未被揭示的诸多因素影响；0036国外疫苗制备工艺的复杂。
19、性和过度纯化，改变了菌体抗原的立体天然构象蛋白二、三、四级空间构象，所诱导的抗体针对自然界流行菌株侵袭缺乏特异性；0037过度纯化工艺也导致了丰富抗原位点的丢失、损伤、单一，影响其抗原性。00384、诺华4CMENBBEXSERO疫苗0039由于OMV疫苗具有所选流行菌株的地域特异性及以上因素的影响，因而难以具有广泛的通用性和有效性，因此，诺华和辉瑞公司基于反向疫苗学技术分别研发了包含多种蛋白成分的B群脑膜炎球菌疫苗4CMENBBEXSERO，以期达到更广泛的针对B群菌株的覆盖率。00404CMENBBEXSERO含5种经反向疫苗学技术筛选的经大肠杆菌表达的蛋白抗原，分别为FHBPH因子结合蛋。
20、白，最初命名为LP2086、NHBA奈瑟菌肝素结合抗原、NADA脑膜炎球菌粘附素A，另外两种蛋白为GNA2091和GNA1030，分别与FHBP和NHBA结合形成融合抗原GNA2091FHBP和GNA1030NHBA，后又增加了一株新西兰流行菌株NZ98/254；P1724,ST41/44的B群OMV组成。0041作为一种广谱的B群脑膜炎球菌疫苗，4CMENB疫苗对不同B群NM的广泛保护性说明书CN104127869A4/18页6一直备受争议。不同国家流行的代表性B群菌株不同，该疫苗中仅含有一种PORA蛋白的OMV，也只是针对P1724型的B群菌株能产生保护力。不同国家流行的B群NMPORA型。
21、别不同，4CMENB疫苗PORA菌株覆盖率受不同流行B群菌株PORA型别的影响，具有局限性。00424CMENB疫苗中的FHBP为VARIANT1型，免疫血清对于FHBPVARIANT1型菌株的有效性可达95，但是对VARIANT2型或3型菌株的保护性仅为56。美国B群致病菌株中35为VARIANT2型或3型。我国B群脑膜炎球菌中约90的菌株为VARIANT2型。0043此外，4CMENB疫苗中的NADA为主要的抗原成分，但是不同地区流行的B群脑膜炎球菌中大部分并不表达NEDA，如美国36的B群菌株不含NADA基因，我国超过90流行的B群脑膜炎球菌菌株不含NADA基因。因此，4CMENB疫苗并。
22、不适合我国疾病的预防。0044基于以上因素分析，4CMENB疫苗难以达到预期的广泛覆盖率，且不适合我国B群流脑疾病的预防。发明内容0045本发明的目的是提供一种较好地规避了B群NM流行地域特征的，具有广泛交叉保护作用的，能适用于国际、国内不同地区B群流脑预防需求和有效的、广谱的多价B群NMOMV蛋白疫苗。0046为了实现本发明目的，本发明提供一种多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗，所述疫苗是由来自于B群脑膜炎球菌CMCC29356株、CMCC29361株、保藏编号为CGMCCNO8982的XRSW341215株和保藏编号为CGMCCNO8981的XRSW210902株的菌体外膜囊OMV蛋白组成的多价联。
23、合疫苗，任选含有药用赋形剂和/或佐剂。0047依据我国B群NM流行特点，筛选出二株国内B群NM优势致病的血清型别B3疫苗株XRSW341215和XRSW210902，并且兼顾国际、国内B群流脑疾病预防需求，增加二株国际OMV疫苗优选的血清型别B4、B15生产株CMCC29356和CMCC29361，组成4价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗株，以扩大B群脑膜炎球菌疫苗的保护范围。0048四株B群脑膜炎球菌菌株的血清型、亚型和来源如下0049CMCC29356株，血清型4型，亚型P119,15B4,P119,15，来源于中国医学细菌保藏管理中心CMCC；由荷兰国立公共卫生和环境保护研究所提供。0050CMC。
24、C29361株，血清型15型，亚型P17,16B15,P17,16，来源于中国医学细菌保藏管理中心CMCC；由荷兰国立公共卫生和环境保护研究所提供。0051XRSW341215株，血清型3型，亚型P172，14,ST4821B3,P1724,ST4821，分离于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者血液标本。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNO8982，保藏日期2014年4月1日。0052XRSW210902株，血清型3型，亚型P122，26,ST8919B3,P122，26,ST891。
25、9，分离于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者脑脊液标本。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNO8981，保藏日期2014年4月1日。0053所述多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗是由来自于4株B群脑膜炎球菌的OMV蛋白按等重量份混合组成。说明书CN104127869A5/18页70054优选地，所述多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗为液体剂型或冻干剂型。作为液体剂型，任选含有铝佐剂；所述铝佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝等。作为冻干剂型，任选含有赋形剂，所述赋形剂包括但不限于乳糖、蔗糖、明胶、。
26、山梨醇或人血白蛋白；用于稀释疫苗的稀释液是磷酸盐缓冲生理盐水、生理盐水，或含有铝佐剂的缓冲液或生理盐水，其中，每毫升稀释液中铝含量为00502MG。0055本发明还提供所述多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗的制备方法，包括以下步骤00561分别对各B群脑膜炎球菌菌株进行种子培养，连续传代至第4或5代进行发酵罐培养，待细菌生长至对数生长期后期或静止期前期，离心收集菌体；00572OMV蛋白溶出用生理盐水或PH688的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤并离心收获菌体，向菌体中加入提取液溶出OMV蛋白，离心收集上清液；00583OMV蛋白纯化将步骤2的上清液用冷乙醇分步沉淀，硫酸铵分步沉淀，离心收集沉淀，用注射用水溶解。
27、后加入脱氧胆酸钠解聚，然后进行超滤，收集浓缩液，用三氯醋酸沉淀，离心收集沉淀，用水溶解后超滤浓缩；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、G25凝胶层析和分子筛层析，收集样品，除菌过滤后即得OMV蛋白原液；00594测定各菌株OMV蛋白原液中OMV的含量，按比例混合后即得。0060其中，步骤2中使用的提取液为0515M的NACL溶液，或0108M的氯化锂醋酸钠溶液。0061步骤3具体为向步骤2的上清液中加入冷乙醇至终浓度5575，离心收集沉淀，用1565硫酸铵分步沉淀，分别收集上清或离心沉淀物，再用注射用水溶解后加入脱氧胆酸钠至终浓度0210，振荡后进行超滤，收集浓缩液，加入三氯醋酸至终浓度023。
28、0，离心收集沉淀，用水溶解后超滤浓缩；然后依次进行离子交换层析包括阳离子交换层析和阴离子交换层析、疏水层析、G25凝胶层析和分子筛层析，收集样品，除菌过滤后即得OMV蛋白原液。0062本发明还提供脑膜炎奈瑟氏菌NEISSERIAMENINGOCOCCUSXRSW341215株，其保藏编号为CGMCCNO8982。0063本发明还提供脑膜炎奈瑟氏菌NEISSERIAMENINGOCOCCUSXRSW210902株，其保藏编号为CGMCCNO8981。0064本发明涉及由4株不同血清型、亚型及基因型B群菌株来源的纯化蛋白抗原所组成的4价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗的研究，质量标准建立和产业化研究，用于适。
29、龄人群接种，预防以疫苗型为主的并对较广泛的B群脑膜炎球菌感染所致的侵袭性疾病有效的多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗。该疫苗并提供了较好的免疫持久性，有效保障了接种人群预防流脑疾病的侵袭。0065本发明具有以下优点0066一依据我国B群流脑流行特点，以侵袭性B群流脑病例的菌株为基础，筛选出符合我国B群流脑预防需求的优势致病疫苗株血清型3型的CGMCCNO8982ST4821克隆群株和CGMCCNO8981ST8919克隆群株，并兼顾国际B群流脑各区域性疾病特点，增加二株国际B群流脑优势致病的古巴、挪威疫苗生产株血清型4型的B4P119,15和血清型15型的B15P17,16菌株，组成4价流脑疫苗生产株。
30、，使之更能适应国内、国际B群流脑疾病预防的广泛需求。说明书CN104127869A6/18页80067二针对C群流脑菌株亦具有较好的交叉保护抗体效价。B群流脑CGMCCNO8982株与我国2003年C群流脑爆发的安微分离株同属ST4821克隆群，因此所产生的抗体针对C群有效好的交叉保护抗体效价。CGMCCNO8982株抗体，针对有代表性的14株国内、外优势致病株，均具有较高的交叉保护性抗体滴度，有效保障了疫苗保护覆盖率。我国独有的NMST4821克隆群，2003年首次发现于我国C群流脑爆发和流行优势致病株。目前，我国主要流行的B群NM菌株与C群同属于相同ST4821克隆群，说明我国流脑流行有C。
31、向B转化的趋势。其OMV抗原所产生的抗体针对B、C群流脑预防均有较好效果。0068三针对A群流脑菌株亦具有较好的交叉保护抗体效价。B群流脑CMCC29356株属血清型4型，而A群流脑的蛋白分型均为唯一的血清型4型，因而测得的B群血清型4型抗体，针对A群流脑菌均具有较好的交叉保护性。0069四独有的OMV溶出技术，较好地溶出有效抗原成分，保留了细菌细胞壁的完整性，减少了菌体杂质成分溶出，减轻了纯化负荷。0070五适度的纯化工艺，有效地保持了蛋白抗原的立体天然构象，所产生的抗体特异性强，针对自然界致病菌侵袭，具有更好的保护作用及免疫持久性。0071六OMV蛋白抗原的制备工艺具有独创性，适合规模化生。
32、产。0072七经动物安全性试验，包括急性毒性、异常毒性、过敏原性试验、热原检测、无菌试验等，证实本发明的多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗具有可靠的安全性及稳定的免疫持久性。具体实施方式0073以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。0074实施例1多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗的制备方法0075四株B群脑膜炎球菌菌株的血清型、亚型和来源如下0076CMCC29356株，血清型4型，亚型P119,15B4,P119,15，来源于中国医学细菌保藏管理中心CMCC；由荷兰国立公共卫生和环境保护研究所提供。0。
33、077CMCC29361株，血清型15型，亚型P17,16B15,P17,16，来源于中国医学细菌保藏管理中心CMCC；由荷兰国立公共卫生和环境保护研究所提供。0078XRSW341215株，血清型3型，亚型P172，14,ST4821B3,P1724,ST4821，分离于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者血液标本，保藏编号CGMCCNO8982。0079XRSW210902株，血清型3型，亚型P122，26,ST8919B3,P122，26,ST8919，分离于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者脑脊液标本，保藏编号CGMCCNO8981。00801B群脑膜炎球菌OMV原液制备008111B群脑膜炎球菌疫。
34、苗株增菌繁殖，大罐液体培养0082经研究确定的优化工艺、疫苗生产用工作种子批菌种启开后，经连续传至第5代，进行大罐液体培养，培养时间为8小时以内为佳，以减少菌体自溶后杂质成分的溶出，及维持细菌细胞壁完整性和稳定性。经连续流离心，收集细菌菌体。0083111B群脑膜炎球菌培养基配制00841培养基配方1L说明书CN104127869A7/18页90085甲液00860087乙液0088硫酸镁MGSO47H2O06G0089葡萄糖C6H12O6H2O5G00902培养基配制0091甲液配制0092将50盐酸酪蛋白水解液用20NAOH溶液调至PH7076，加入适量注射用水及磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯。
35、化铵，搅拌溶解，调至PH7678，煮沸10分钟，再加入谷氨酸钠、氨基乙酸、酵母透析液，搅拌均匀，补水至配制总量。复测PH为7476，澄清过滤备用。0093乙液配制0094将硫酸镁、葡萄糖盛于适当容器内，加入注射用水加温溶解，补液至50ML，澄清过滤备用。0095以上甲液和乙液可分别经116，20分钟高压灭菌备用，或经02M膜除菌过滤备用。0096112B群脑膜炎球菌罐液体培养0097菌种CMCC29356、CMCC29361、CGMCC8981和CGMCC89820098每株菌分别经罐液体培养，收获菌体。0099菌种扩增01001121启开工作种子批菌种，用10肉汤溶液解冻干菌种，接种于10羊。
36、血斜面或3氯化血红素斜面，置8CO2环境，3537培养不超过36小时。01011122第23代菌种可根据罐液体培养量，分别进行固体培养或液体培养，温度3537。固体培养不超过24小时，液体培养不超过8小时。01021123第4代菌种小罐液体培养0103菌种小罐在位蒸汽灭菌后，培养基甲液、乙液分别经除菌滤器过滤后输入罐内，调PH7478，搅拌降温至3537，无菌操作接种入第3代液体菌种，使菌种小罐内的菌种浓度为24亿菌/ML培养基，控制培养温度3537。搅拌转速120180转/分，表面通气、深说明书CN104127869A8/18页10层通气二种方法结合，培养35小时，其间测定菌种浓度达到305。
37、0亿菌/ML，终止培养，无菌操作，将菌种转输入大罐液体培养。0104113大罐液体培养0105大罐在位蒸汽灭菌后，培养基甲液、乙液分别经除菌滤器过滤后输入罐内，调PH7478，搅拌降温至37以下，无菌操作接种入第4代菌种，设定控制参数，温度35365，表面通气、深层通气二种方法结合使用，随着细菌生长浓度的增加，调节通气量525M3/小时，搅拌转速120200转/分，维持PH7274，维持罐内压力005015MPA，培养时间不超过8小时，终止培养参数，细菌对数生长期后期或静止期前期。终止培养后，经连续流管式离心机离心，收获菌体。置于28保存，供纯化OMV使用。010612B群脑膜炎球菌OMV溶出。
38、0107溶解菌体，以菌体重量10倍内的PH688的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤菌体，离心收集菌体后，再重复洗涤1次，以去除培养过程的残留杂质。0108将洗涤后菌体置于15倍体积的溶解提取液中，置摇床振荡，以溶出菌体OMV蛋白。菌体溶解提取液可以是0515M的NACL溶液，也可以是0108M的氯化锂醋酸钠溶液，摇床振荡的提取温度及时间分别为设定温度为28，提取时间不超过36小时；设定温度为3555，提取时间不超过5小时。离心收集上清液，经30KD或100KD膜包超滤，并用不超过原体积5倍量的注射用水或生理盐水洗涤，超滤至不超过原体积。010913B群脑膜炎球菌OMV初步纯化0110超滤OMV溶液加入冷。
39、乙醇至终浓度5575，分步收集离心沉淀，用注射用水复溶后，用1565硫酸铵分步沉淀，分别收集上清或离心沉淀物，用注射用水复溶，加入脱氧胆酸钠溶液至终浓度为0210，28振荡不超过48小时或2025振荡不超过36小时。经30或100KD膜包超滤，并用不超过原体积10倍量的注射用水或生理盐水洗涤，超滤至不超过原体积。再加入三氯乙酸至终浓度0230，离心收集沉淀，用注射用水溶解，经30KD或100KD超滤膜包洗涤，超滤至不超过原体积。011114B群脑膜炎球菌OMV凝胶层析纯化0112141离子交换凝胶层析0113选择的离子交换凝胶包括但不限于GE通用电气、MERCKMILLIPORE默克密理博、T。
40、OSOH东曹等公司的相同分离原理的凝胶。0114离子交换的分离是基于带电荷的分子与带相反电荷的固化离子交换基因之间选择性地、可逆性结合的原理，在待分离样品经离子交换凝胶层析过程中，样品中电荷相反的物质结合于凝胶中，未结合的物质则被流穿液体“洗脱”，而达到分离的目的。根据凝胶介质所带阴、阳离子基因不同而分为阴离子交换介质和阳离子交换介质。这种离子交换介质，又根据其对PH的适应性而分为强、弱离子交换介质，其在不同PH条件下电荷量可能变化很大。01151411阳离子交换凝胶层析0116分离样品经阳离子交换凝胶层析，用01512MNACL溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，再经G25凝胶层析脱盐，收集脱盐溶。
41、液。01171412阴离子交换凝胶层析0118将以上溶液经阴离子交换凝胶层析，收集流穿液，30KD膜包超滤，用5倍量注射用说明书CN104127869A109/18页11水稀释样品，超滤至原体积，收集，28保存。0119142疏水层析0120基于蛋白质和多肽在其疏水性方面存在差异，这种差异就构成了疏水层析分离的基础。盐溶液用于调节样品分子结合在亲水基质上的疏水配体之间的吸附。在高浓度盐溶液中，蛋白质会产生局部可逆变性，并被迫与疏水固定相结合，然后，降低流动相离子强度，根据各种蛋白的结合能力的强弱，依次被解吸附而洗脱。0121疏水层析凝胶介质的选择包括但不限于GE通用电气、MERCKMILLIP。
42、ORE默克密理博、TOSOH东曹、CELLUNE等公司的相同分离原理的凝胶。0122用510倍体积起始缓冲液平衡柱床后，并用起始缓冲液稀释样品，加盐至样品离子强度达到1M，上样层析，经510倍体积缓冲液平衡柱床，再用洗脱缓冲液进行梯度洗脱，分步收集不同梯度洗脱液，经G25凝胶层析脱盐，收集样品，经除菌过滤后，即为OMV蛋白原液，存28无菌保存。012324价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗半成品配制0124各菌株OMV原液随机取样，测定蛋白浓度、分子量、主要蛋白纯度、鉴别试验、热原、异常毒性、无菌试验、杂质残余量包括核酸、磷、唾液酸、中性糖、免疫原性。0125经检定，符合质量标准。检定合格后，按疫苗相融。
43、性研究确定的各菌株免疫剂量，配制4价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗半成品，每ML疫苗半成品含有各菌OMV蛋白含量1050G，液体剂型含铝佐剂005070MG，冻干剂型含乳糖1018MG。01263疫苗分装0127疫苗剂型分为液体和冻干剂型。0128液体剂型疫苗含两种内包材容器，包括西林瓶和预充注射器，各含05ML液体疫苗。0129冻干剂型疫苗含05ML液体疫苗，内包材为西林瓶。01304疫苗检定、保藏0131疫苗分装、冻干后按要求取样，全部项目检定合格后为合格品。保存条件28避光保存。0132实施例2B群脑膜炎球菌疫苗株对国内外优势致病株的交叉抗体效价测定01331菌株来源013411国内B群菌株从1。
44、67株国内收集的B群流脑患者、携带者中筛选，确定的患者分离优势致病株，共8株表1。0135表1国内B群脑膜炎患者优势致病株0136说明书CN104127869A1110/18页120137013812国外B群菌株，分别来自于美国FDA、荷兰国立公共卫生和环境保护研究所、中国食品药品检定研究院，共7株表2。0139表2国外B群疫苗生产株和优势致病株0140014113A群脑膜炎球菌菌株表3。0142表3国内、外来源的三株A群脑膜炎球菌菌株0143说明书CN104127869A1211/18页13014414C群脑膜炎球菌菌株表4。0145表4国内、外来源的三株C群脑膜炎球菌菌株014601470。
45、1482疫苗株4株菌株免疫血清制备01491免疫菌株CMCC29356、CMCC29361、CGMCC8981、CGMCC8982。01502免疫血清制备0151动物SPF级N1H小鼠，1214克/只，10只/组。0152免疫原液制备启开工作种子批菌种1支，接种于流脑半综合固体羊血培养基，置于37，8CO2培养，传至第3代，收集菌体，1甲醛灭活30分钟，用生理盐水洗涤去甲醛，比浊测定细菌浓度。0153小鼠免疫血清制备用生理盐水稀释菌液浓度至3亿菌/ML，皮下免疫05ML/次，间隔二周，连续免疫3针，第三针免疫后二周采血，分离血清，置28保存备用。01543各检测菌株菌液的制备0155启开各菌的。
46、工作种子批菌种1支，接种于流脑半综合固体羊血培养基，置于7，8CO2培养，传至第2代，收集菌体于1甲醛灭活30分钟，用生理盐水洗涤去除甲醛，比浊测定细菌浓度，稀释至3亿菌/ML，置28保存备用。01564ELISA测定各疫苗株免疫小鼠血清抗体效价和各自对国内外来源各14株菌的交叉抗体效价0157各菌株包被浓度3亿菌/ML，每孔50L，分别测定每组10只小鼠免疫血清各自说明书CN104127869A1312/18页14对本菌的抗体效价和对每株菌的交叉抗体效价，计算GMT。测定结果见表5表7。0158表5B群疫苗株抗体效价和交叉抗体ELISA效价GMT01590160表6CGMCC8982株B群S。
47、T4821、XRSW341215、脑脊液抗体对安徽分离的C群ST4821株菌和C群多糖疫苗生产株CMCC29205的交叉抗体ELISA效价01610162表7CMCC29356株B4P172,4抗体对A群多糖疫苗生产株CMCC29201及其他A群菌株的交叉抗体ELISA效价0163说明书CN104127869A1413/18页1501645、结果分析0165表4结果显示，4株B群疫苗株抗体分别针对国内、外来源的共14株优势致病株均具有不同程度的交叉抗体效价。尤其是国内分离的CGMCC8982XRSW341215,ST4821株，不仅该菌效价最高GMT47771，而且对其他14株菌株的交叉抗体效。
48、价均较高，达到了该菌效价的1/32/3GMT1575936204，尤其是针对2株国际疫苗生产株，甚至超过了其本菌效价CMCC29356该菌抗体效价GMT15759，交叉抗体效价GMT29407。CMCC29361该菌抗体效价GMT14703，交叉抗体效价GMT15759。0166表5结果显示，CGMCC8982XRSW341215，ST4821株抗体针对相同基因型的C群ST4821株，也具有较高的交叉抗体效价GMT29406，并对目前国际、国内所采用的C群流脑多糖疫苗生产株CMCC29205C11株等，也具有较好的交叉抗体效价。0167表6结果显示，CMCC29356B4P172,4株抗体针对。
49、相同蛋白型的A群B4菌株，包括目前国际、国内所采用的A群流脑多糖疫苗生产株CMCC29201A4，均具有较好的交叉抗体效价。0168实施例3急性毒性和异常毒性试验0169本试验利用不同剂量的药物急性毒性反应，将一定剂量的供试品溶液实施例1中制备的多价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗注入受试动物小鼠、豚鼠体内，在规定时间内观察动物出现的毒性反应症状和死亡情况，判定供试品是否符合规定的质量要求及其安全性程度。01701实验方法017111实验动物0172小鼠NIH小鼠，体重1822克/只，每组5只；0173豚鼠体重250350克/只，每组2只；017412注射剂量及分组0175121异常毒性试验按2010版中国药典三部附录XIIF项异常毒性检查法规定的接种剂量小鼠，腹腔注射05ML1个人用剂量，豚鼠，腹腔注射5ML10个人用剂量。0176122重复给药试验按21项试验给药后，观察受试动物三天内未出现异常症状，继续饲养至第七天，受试动物健存、正常，且体重增加，再次重复给予21项剂量接种给药，再连续观察7天，判定结果。0177123急性毒性试验按2010版中国药典三部附录XIIF项异常毒性检查法规说明书CN104127869A1514/18页16定接种剂量的5倍量给药，用各价。