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1、10申请公布号CN104159606A43申请公布日20141119CN104159606A21申请号201380012267622申请日2013011061/585,83920120112USA61K39/12200601C12N7/01200601A61P31/2020060171申请人STCUNM公司地址美国新墨西哥州72发明人B查克利安D皮博迪E图姆班74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉54发明名称含有HPVL2的免疫原性VLP及相关组合物和方法57摘要在一个方面，本发明提供免疫原性的含HPVL2病毒样颗粒VLP。还提供相关的组合物例如疫苗、核酸构建体和治疗方法。。
2、在某些方面，所述VLP由噬菌体PP7或MS2的外壳多肽构成，其中所述外壳蛋白通过插入源自HPVL2的肽抗原修饰，且其中所述HPVL2肽在VLP上展现且包裹PP7或MS2MRNA。具体地，本发明的VLP在噬菌体外壳蛋白的N端展现L2肽。令人惊讶地，这些展现L2的VLP比在AB环中展现同样的肽时诱导更广泛的中和抗体应答，从而该免疫原性应答增强了至少10倍因子。本发明的免疫原性VLP和相关组合物诱导针对HPVL2的高滴度抗体应答并在体内针对HPV激发保护。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014090286PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0209602013011087P。
3、CT国际申请的公布数据WO2013/106525EN2013071851INTCL权利要求书1页说明书12页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页附图7页10申请公布号CN104159606ACN104159606A1/1页21一种组合物，其包含A病毒样颗粒；和B至少一种抗原或抗原决定簇；其中所述抗原或抗原决定簇展示在所述病毒样颗粒上，且其中所述抗原包含源自人乳头状瘤病毒HPVL2蛋白的肽。2权利要求1的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇展示在噬菌体外壳蛋白的N端。3权利要求2的组合物，其中所述噬菌体外壳蛋白是源自MS2噬菌体的单链二聚体外壳蛋白。4权。
4、利要求2的组合物，其中所述噬菌体外壳蛋白是源自PP7噬菌体的单链二聚体外壳蛋白。5权利要求2的组合物，其中所述噬菌体外壳蛋白是源自单链RNA噬菌体家族的单链二聚体外壳蛋白，所述单链RNA噬菌体家族包括但不限于QB、R17、SP、PP7、GA、M11、MX1、F4、CB5、CB12R、CB23R、7S和F2。6权利要求2的组合物，其中所述HPVL2肽源自HPV16型。7权利要求2的组合物，其中所述HPVL2肽源自HPV1、5、6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58或59型。8权利要求2的组合物，其中展示的肽与HPVL2序列具有70、75、80、85、90。
5、或95同源性。9权利要求6或7的组合物，其中所述HPVL2肽源自HPV16型L2的氨基酸1120。10权利要求6的组合物，其中所述HPVL2肽源自HPV16型L2的氨基酸1440、1731或2029。11权利要求6的组合物，其中展示的肽与HPV16型L2的氨基酸1440、1731或2029具有70、75、80、85、90或95同源性。12权利要求2的组合物，其中展示的HPVL2肽源自超过一种HPV类型。13权利要求2的病毒样颗粒的群体。14一种用于在动物中增强针对抗原的免疫应答的方法，包括将权利要求1或2的组合物引入所述动物中，其中在所述动物中产生增强的针对所述抗原的免疫应答。15权利要求14。
6、的方法，其中所述组合物对于HPV诱导的病症是预防性的。16权利要求14的方法，其中所述免疫应答是增强的B细胞应答和/或增强的T细胞应答。17权利要求14的方法，其中所述动物是哺乳动物。18权利要求14的方法，其中将所述组合物皮下、肌内、静脉内、鼻内、阴道内引入所述动物中或直接引入淋巴结中。19一种疫苗，其包含免疫有效量的权利要求1或2的组合物以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。20一种免疫或治疗动物的方法，包括对所述动物施用免疫有效量的权利要求18的疫苗。21权利要求19的方法，其中所述动物是哺乳动物。22权利要求14的疫苗，其中所述疫苗还包含佐剂。权利要求书CN104159606A1/12。
7、页3含有HPVL2的免疫原性VLP及相关组合物和方法0001相关申请和政府权益0002本申请要求2012年1月12日提交的、名称为“IMMUNOGENICHPVL2CONTAININGVLPSANDRELATEDCOMPOSITIONS,CONSTRUCTSANDTHERAPEUTICMETHODS”的美国临时申请流水号US61/585,839的优先权权益，其完整内容通过提述并入本文。0003本专利申请由NIAIDGRANTNOU19AI084081支持。政府对本发明有一定权利。发明领域0004在一个方面，本发明提供免疫原性的含HPVL2病毒样颗粒VLP。还提供相关的组合物例如疫苗、核酸构建体。
8、和治疗方法。0005在某些方面，所述VLP由噬菌体PP7或MS2的外壳多肽构成，其中所述外壳蛋白通过插入源自HPVL2的肽抗原修饰，且其中所述HPVL2肽在VLP上展示。具体地，本发明的VLP在噬菌体外壳蛋白的N端展示L2肽。令人惊讶地，这些展示L2的VLP比在AB环中展示同样的肽时诱导更广泛的中和抗体应答。0006本发明的免疫原性VLP和相关组合物诱导针对HPVL2的高滴度抗体应答并在体内针对HPV假病毒激发进行保护。0007发明背景0008近年来的重组DNA技术的发展已导致疫苗的引入，其中已鉴定、克隆和在适宜的宿主中表达免疫原性蛋白以获得足量蛋白，从而允许在动物和人两者中的有效保护性免疫。。
9、在最有效的疫苗中有许多是基于病毒粒子表面引发中和抗体的有力能力。这些包括得到许可的被杀死或减弱的病毒疫苗，如脊髓灰质炎、流感和狂犬病，其有效地诱导保护性抗体应答。更近期地，基于人乳头状瘤病毒HPV和乙肝病毒HBV的结构蛋白的自身装配的亚基疫苗已被食品和药物管理局批准。这些基于病毒样颗粒VLP的疫苗引发强烈的抗体应答且在针对HPV和HBV感染的保护中高度有效。0009VLP不仅可用作单独的疫苗，而且还可以用作多价和免疫原性展示异源抗原的平台。单链RNA噬菌体家族是一种用于展示这些异源表位的多功能平台。MS2和PP7外壳蛋白单链二聚体高度容忍肽插入并产生正确装配的VLP，其以高致密性、重复阵列在V。
10、LP的表面上展示肽插入。这些VLP是高度免疫原性的且将此免疫原性赋予在其表面上展示的异源肽。0010目前的HPV疫苗基于由病毒大外壳蛋白MAJORCAPSIDPROTEINL1构成的VLP。尽管L1VLP疫苗高度有效，但它们是类型特异性的，意味着目前的HPV疫苗仅提供针对感染人的超过100种类型HPV包括致癌性的1518种HPV类型的一个小子集的保护。相比之下，HPV小外壳蛋白MINORCAPSIDPROTEINL2含有广泛交叉中和表位。特异于L2内这些高度保守表位的抗体能中和广泛范围的HPV类型的感染。因此，靶向L2的疫苗可能提供针对由多种HPV类型的感染的更全面的保护。然而，不同于L1，L。
11、2蛋白自身不装配成VLP，因此不是非常免疫原性的，意味着难以诱导针对其的高滴度抗体。0011我们先前描述了两种RNA噬菌体MS2和PP7的病毒样颗粒VLP用于肽展示的用说明书CN104159606A2/12页4途参见10。如上文描述的，MS2和PP7外壳蛋白单链二聚体高度容忍肽插入且产生正确装配的VLP，其以高致密性、重复阵列在VLP的表面上展示肽插入。这些VLP是高度免疫原性的且将此免疫原性赋予在其表面上展示的异源肽。肽可以展示在噬菌体外壳蛋白上的两个位点，即在所谓的AB环中和在N端中的任一处。0012我们先前描述了在AB环中展示源自人乳头状瘤病毒HPV小外壳蛋白L2的肽抗原的VLP。这类重。
12、组VLP能充当预防性疫苗以预防多种HPV株系的感染，且在预防动物模型中的用HPV假病毒体的感染中有效。参见例如2011年2月8日提交的、名称为“IMMUNOGENICHPVL2CONTAININGVLPSANDRELATEDCOMPOSITIONS,CONSTRUCTSANDTHERAPEUTICMETHODS”的PCT/US2011/024030，在2011年8月18日公开为WO2011/100234，其完整内容通过提述并入本文。0013我们在本文中描述了在噬菌体外壳蛋白N端展示L2肽的VLP的构建。令人惊讶地，这些展示L2的VLP比在AB环中展示同样的肽时诱导更广泛的中和抗体应答。如此，展。
13、示L2肽的单重组VLP能提供针对HPV感染的广泛保护。0014发明概述0015本发明提供免疫治疗和预防性噬菌体病毒样颗粒VLP，其可用于预防人乳头状瘤病毒HPV感染和相关病症，包括宫颈癌和与HPV有关的持续感染。还提供相关的组合物例如疫苗、核酸构建体和治疗方法。本发明的VLP和相关组合物诱导针对HPVL2的高滴度抗体应答并在体内针对HPV假病毒激发进行保护。本发明的VLP、含VLP组合物和治疗方法诱导针对HPV感染的免疫原性应答，赋予针对HPV感染的免疫性，针对HPV感染保护，并降低被HPV感染而感染的可能性。0016由于特异于L2内的高度保守表位的抗体能中和广泛范围的HPV类型的感染，因此本。
14、发明的靶向HPVL2的VLP和相关组合物例如疫苗提供针对多种HPV类型的感染的更全面的保护。0017在一个方面，本发明提供一种包含噬菌体单链外壳多肽二聚体和HPVL2肽的VLP，其中HPVL2肽展示在VLP上，且其中使用VLP的疫苗接种预防HPV诱导的病症。0018在另一个方面，本发明提供一种包含VLP的组合物，所述VLP包含噬菌体单链外壳多肽二聚体和HPVL2肽，其中HPVL2肽展示在VLP上，且其中所述组合物预防HPV诱导的病症。0019更具体地，本发明提供VLP、或包含VLP的组合物，其中通过用包含以下任一项的核酸构建体转化原核生物来制备VLP00201A细菌或噬菌体启动子，其与噬菌体P。
15、P7单链外壳多肽二聚体的编码序列可操作地关联，其中所述外壳多肽二聚体编码序列修饰为I限定第一限制位点，其位于外壳多肽二聚体编码序列的下游部分中，且位于限定外壳多肽二聚体N端的序列的5或内部，和II含有编码HPVL2肽的核苷酸序列；B位于外壳多肽二聚体编码序列3的第二限制位点；C与启动子可操作关联的抗生素抗性基因；和D用于在原核细胞中复制的复制起点；或00212A细菌或噬菌体启动子，其与噬菌体MS2单链外壳多肽二聚体的编码序列可操作地关联，其中所述外壳多肽二聚体编码序列修饰为I限定位于以下序列部分的5的密码子序列，该序列部分限定外壳多肽二聚体N端，和II含有编码HPVL2肽的核苷酸说明书CN10。
16、4159606A3/12页5序列；B位于外壳多肽二聚体编码序列3的限制位点；C位于第二限制位点3的PCR引物；D对第一抗生素抗性的阻遏物，其中所述阻遏物可操作地关联于启动子；E修饰为含有赋予对第二抗生素抗性的基因的辅助噬菌体基因；和F用于在原核细胞中复制的复制起点。0022在某些方面，本发明提供通过用如本文中描述的含HPVL2肽序列的构建体转化原核生物制备的VLP。在其他方面，本发明的VLP和含VLP组合物例如疫苗由包含源自不同HPV类型的HPVL2肽的VLP构成。在其他方面，本发明的VLP和含VLP组合物包含展示多种HPVL2序列的杂合VLP。0023在某些方面，本发明提供一种接种有形成HP。
17、V相关病症风险的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用一剂或多剂包含如本文中描述的含HPVL2的VLP的组合物。0024本发明的这些和其他方面进一步在发明详述中描述。0025附图简述0026图1列出了用于将所列序列克隆到MS2外壳的正向引物显示为5至3，以及由这些引物编码的氨基酸序列。NCOI限制位点显示为划线斜体，肽插入显示为粗体，而接头序列斜体显示。MS2外壳蛋白序列加下划线。0027图2描绘了野生型和重组MS2VLP的透射电子显微图。0028图3图3显示了在用野生型MS2VLP对照或展示L2肽2029、1731或1440的MS2VLP免疫的小鼠组中的IGG抗体应答。对缀合链霉亲合素的。
18、代表来自HPV16L2的氨基酸1440的肽计算滴度。结果来自在初始疫苗接种后一周红色或追加后一周黑色获得的血清。每个数据点代表来自个体小鼠的抗体滴度。线代表每个组的几何均值滴度。如指示的，将小鼠用没有外源佐剂的5GVLP免疫。显示在一次或两次免疫后对HPV16L21440肽的终点稀释ELISA滴度。0029图4图4显示用在MS2外壳蛋白N端或PP7的AB环中展示的16L21731免疫时引发的血清的交叉反应性。将ELISA板用代表HPV1,5,6,16,18的缀合链霉亲合素的L2肽包被，并与来自小鼠的血清的12560稀释反应。显示来自每组中3只个体小鼠血清的光密度OD405值的平均。误差棒代表S。
19、EM。如显示的，在N端展示HPV16L2序列的VLP诱导更广泛的交叉反应抗体应答。0030图5该图显示用在MS2外壳蛋白N端展示的16L21731免疫的小鼠相比于用16L21731AB环PP7VLP免疫的那些小鼠显示更广泛的对多种HPVPSV类型的感染的保护。将BALB/C小鼠用5G的16L21731NTERMMS2VLP或16L21731AB环PP7VLP或HPV16L1L2VLP或MS2/PP7VLP的混合物以两周时间间隔免疫肌内。在最后一次免疫后3至5周，将小鼠用APSV16和BPSV5,6,31,33,35,39,45,51,53和PSV58激发。所有激发均阴道内完成，除了PSV5是在。
20、皮内完成的以外。激发后48小时时，将04MG的萤光素经由用于PSV激发的同一途径施用，并使用LIVINGIMAGE32软件测定每只小鼠的平均辐射P/S/CM2/SR值。填充白色的黑圈代表用MS2/PP7VLP免疫的小鼠，填充黑色圈代表用HPV16L1L2VLP免疫的小鼠，填充蓝色的圈代表用16L21731AB环PP7VLP免疫的小鼠，而填充红色的圈代表用16L21731NTERMMS2VLP免疫的小鼠。黑色实线代表平均辐射的几何均值。0031图6描绘PDSP62质粒。说明书CN104159606A4/12页60032图7描绘质粒PDSP1。0033图8显示在针对异源HPVPSV激发的保护的急剧。
21、差异。用L2PP7VLP免疫导致对异源PSV的适度或无保护。相比之下，用依照本发明的N端展示的L2MS2VLP免疫导致对用9种异源类型的阴道激发和用HPV5PSV的一种皮内激发的显著保护。我们观察到对用测试的10种异源PSV类型中的9种感染的非常强信号中80至7,190倍降低的保护，这是一项未预期到的结果。该保护实质性强于在用AB环展示的L2免疫的小鼠中观察到的。使用依照本发明的VLP对异源激发的保护一般比其中在AB环中展示抗原L2肽的VLP高至少约510倍。对异源激发的保护比使用N端VLP构建体好1025倍HPV5,3139、40100倍HPV45,51,53,58或1401000倍HPV6。
22、,33,35。0034发明详述0035依照本发明，可以采用本领域技术中常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中有完全解释。参见例如SAMBROOK等,2001,“MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL“；AUSUBEL编,1994,“CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY“VOLUMESIIII；CELIS编,1994,“CELLBIOLOGYALABORATORYHANDBOOK“VOLUMESIIII；COLIGAN编,1994,“CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY“VOLUMESIIII；G。
23、AITED,1984,“OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS“；HAMESHIGGINSEDS,1985,“NUCLEICACIDHYBRIDIZATION“；HAMESHIGGINS,EDS,1984,“TRANSCRIPTIONANDTRANSLATION“；FRESHNEY编,1986,“ANIMALCELLCULTURE“；IRLPRESS,1986,“IMMOBILIZEDCELLSANDENZYMES“；PERBAL,1984,“APRACTICALGUIDETOMOLECULARCLONING“。0036在提供值的范围时，应理解除非上下文清楚地另外指示，该范围上限和下。
24、限之间的每个中间值到下限的1/10单位，和在该指定范围中的任何其他指定值或中间值均涵盖在本发明中。那些更小范围的上限和下限可以独立地包含在该更小范围中且亦涵盖在本发明中，隶属于指定范围内的任何具体排除的限SUBJECTTOANYSPECICALLYEXCLUDEDLIMITINTHESTATEDRANGE。当指定的范围包含一个或两个限时，排除任一或两个那些所包括的限的范围也包括在本发明中。0037除非另外指定，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员普遍理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中还可以使用与本文所述那些相似或等同的任意方法和材料，但现在描述优选的方法。
25、和材料。0038必须注意，如本文中和所附权利要求中使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文清楚地另外指示。0039此外，下列属于应具有下文列出的定义。0040如本文中使用的，术语“多核苷酸”指具有任意长度的核苷酸核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合形式，且包括双链和单链DNA和RNA。多核苷酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列例如启动子或转录终止子。多核苷酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。多核苷酸在拓扑学上可以是线性或环状的。多核苷酸可以是例如载体如表达或克隆载体的一部分，或一个片段。0041如本文中使用的，术语。
26、“多肽”广泛地指通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的聚合物。术语“多肽”还包括含有超过一种由肽键连接的多肽的分子，或共价或非共价说明书CN104159606A5/12页7连接在一起作为多聚体例如二聚体、四聚体的多肽复合物。如此，术语肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义中，且这些术语可交换使用。应当理解，这些术语既不意味着特定长度的氨基酸聚合物，也不意图暗示或区分所述多肽是使用重组技术、化学或酶法合成产生的，还是天然存在的。0042本文中描述的氨基酸残疾优选处于“L”异构体形式。然而，可用“D”异构体形式的残基取代任何L氨基酸残基，只要多肽保留了期望的功能。NH2指在多肽氨基末端存在的游离氨基。
27、基团。COOH指在多肽羧基末端存在的游离羧基基团。0043术语“编码序列”在本文中定义为直接指明其蛋白质产物的氨基酸序列的核酸序列的一部分。编码序列的边界一般由恰在开放阅读框上游在MRNA5端的核糖体结合位点原核生物或ATG起始密码子真核生物和恰在开放阅读框下游在MRNA3端的转录终止子序列确定。编码序列可包括但不限于，DNA、CDNA和重组核酸序列。0044重组细胞的“异源”区是在更大的核酸分子内的可鉴定的核酸区段，其未见于与该更大的分子天然关联。0045“复制起点”指参与DNA合成的那些DNA序列。0046“启动子序列”是能在细胞中结合RNA聚合酶并启动下游3方向编码序列转录的DNA调控区。
28、。出于定义本发明的目的，启动子序列在其3端被转录起始位点结合，并向上游延伸5方向以包含以在背景之上的可检测水平启动转录所需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录启动以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域通用序列。真核启动子将经常但不总是地含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了10和35通用序列外还含有SHINEDALGARNO序列。0047“表达调控序列”是控制和调节另一DNA序列的转录和翻译的DNA序列。编码序列在细胞中“处于”转录和翻译调控序列的“控制下”，当RNA聚合酶将编码序列转录成MRNA时，然后MRNA被翻译成由该编码序列编码的蛋白质。转录和翻译调控序列是DNA。
29、调控序列如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等，其提供编码序列在宿主细胞中的表达。0048当已将外源或异源DNA引入细胞内部时，该细胞是已被这类DNA“转化的”。转化DNA可能或可能不整合共价连接到构成细胞基因组的染色体DNA中。在原核生物、酵母和例如哺乳动物细胞中，转化DNA可保持在附加体元件上如质粒。0049应领会还在本发明范围内的是编码本发明多肽的核酸序列，其编码具有与本文中所述序列相同的氨基酸序列的多肽，但其与本文中公开的核酸是简并的。“与简并”意指使用不同的三字密码子来指定特定的氨基酸。0050如本文中使用的，“表位”指多肽的抗原决定簇。表位可以包含处于对表位独特的空间构象的3个。
30、氨基酸。一般地，表位由至少5个这类氨基酸组成，更通常地，由至少810个这类氨基酸组成。测定氨基酸的空间构象的方法是本领域中已知的，且包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。0051如本文中使用的，术语“外壳蛋白”指能掺入噬菌体或RNA噬菌体的壳体装配中的噬菌体或RNA噬菌体蛋白。0052如本文中使用的，“外壳多肽”在本文中定义为外壳蛋白的多肽片段，其拥有外壳蛋白功能且另外还涵盖全长外壳蛋白或其单链变体。0053如本文中使用的，术语“免疫应答”指体液免疫应答和/或细胞免疫应答，其导致说明书CN104159606A6/12页8B和/或T淋巴细胞和/或抗原提呈细胞的活化或增殖。然而，在一些情况中，免疫应。
31、答可以是低强度的，且仅在使用至少一种依照本发明的物质时变为可检测的。“免疫原性”指用于刺激活生物体免疫系统的试剂，从而免疫系统的一种或多种功能增加并针对该免疫原性剂。“免疫原性多肽”是引发如上文描述的细胞和/或体液免疫应答的多肽，其在存在或缺乏佐剂的情况下为单独的或与载体连接的。优选地，抗原提呈细胞可以是活化的。0054如本文中使用的，术语“疫苗”指含有本发明的组合物的制剂，且其处于能对动物施用的形式。0055如本文中使用的，术语“噬菌体的病毒样颗粒”指一种类似于噬菌体结构的病毒样颗粒VLP，其为非复制性和非感染性的，而且至少缺少编码噬菌体复制体系的基因，典型地还缺少编码负责病毒附接或进入宿主。
32、的蛋白质的基因。0056然而，该定义还应该涵盖其中前述基因仍存在但失活的噬菌体的病毒样颗粒，因此其还导致噬菌体的非复制性和非感染性病毒样颗粒。0057RNA噬菌体外壳蛋白的VLP从RNA噬菌体外壳蛋白一个或多个亚基的自身装配形成，并任选地含有宿主RNA的的壳体结构被称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。在一个具体的实施方案中，所述壳体结构式从90个外壳蛋白单链二聚体或180个外壳蛋白单体的自身装配形成的。0058核酸分子是“可操作地连接于”或“可操作地关联于”表达调控序列的，当该表达调控序列控制并调节核酸序列的转录和翻译时。术语“可操作地连接”包括在要表达的核酸序列前面具有适宜的起始信号例如A。
33、TG，并维持正确的阅读框以允许该核酸序列在表达调控序列控制下的表达和产生由该核酸序列编码的期望的产物。如果期望插入重组DNA分子的基因不含有适宜的起始信号，那么可将这类起始信号插入基因的前面。0059HPV诱导的病症、免疫原性和预防功效0060“HPV诱导的病症”或“HPV相关病症”包括但不限于，在本节中鉴定的病症。免疫原性和预防功效例如组合物对于HPV诱导的病症是否是预防性的可通过本节中提及的技术和标准，或本领域普通技术人员公知的其他方法学来评估。0061已鉴定出超过100种不同的HPV类型并通过数字指代。类型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58和59是“高风险”。
34、性传播的HPV的子集且可能导致宫颈上皮内瘤样病变CERVICALINTRAEPITHELIALNEOPLASIACIN、外阴上皮内瘤样病变VULVARINTRAEPITHELIALNEOPLASIAVIN、阴道癌、阴茎上皮内瘤样病变PENILEINTRAEPITHELIALNEOPLASIAPIN、和/或肛门上皮内瘤样病变ANALINTRAEPITHELIALNEOPLASIAAIN的形成。已发现几种类型的HPV，特别是类型16，与口咽鳞状细胞癌头和颈癌的一种形式有关。HPV例如HPV6和11导致生殖器疣，而HPV6和11能导致复发性呼吸道乳头状瘤。HPV能导致免疫受损个体中的疣状表皮发育不良。
35、EPIDERMODYSPLASIAVERRUCIFORMIS。0062如此，高风险的人宫颈上皮的HPV感染与宫颈癌的生成有因果联系。参见DURST等,PNAS8038123815,1983；GISSMANN等,JINVESTDERMATOL83265285,1984HPV16与泌尿生殖道的恶性前和恶性疾病有关，且具体地与宫颈癌有关。乳头状瘤病毒预防性疫苗靶向系统性免疫系统以诱导中和抗体，其保护基底细胞免于感染。0063为了评估免疫原性例如组合物是否诱导针对HPVL2的高滴度抗体应答，可通说明书CN104159606A7/12页9过ELISA测量抗HPV16L2几何均值滴度GMT，例如在治疗后几。
36、周例如3或4周或在几次剂量例如3或4的施用后。还可以测定在几周治疗例如3或4周或几次剂量例如3或4后对HPV16血清转化的受试者的百分数以评估免疫原性。0064为了测定预防功效，可以在激发后的各个终点处在保持对HPV感染HPV16血清反应阴性和PCR阴性拭样和活组织检查的受试者上进行免疫原性分析。0065HPVL20066如本文中使用的，“HPVL2”包括所有人乳头状瘤病毒的L2壳体蛋白。0067病毒样颗粒的产生0068本发明针对病毒样噬菌体颗粒以及用于体内及体外生成这些颗粒的方法。如本文中使用的，“体外”产生病毒体指在细胞外产生病毒体，例如在无细胞系统中，而“体内”产生病毒体指在细胞内部产生。
37、病毒体，例如在大肠杆菌ESCHERICHIACOLI或铜绿假单胞菌PSEUDOMONASAERUGINOSA细胞中。0069噬菌体0070本文中描述的VLP由单链RNA噬菌体的外壳蛋白的装配组成RNABACTERIOPHAGES,INTHEBACTERIOPHAGESCALENDAR,RL编OXFORDUNIVERSITYPRESS2005。该组的已知病毒攻击多种细菌，如大肠杆菌、假单胞菌和不动杆菌ACINETOBACTER。每种拥有高度类似的基因组组织、复制策略和病毒体结构。具体地，噬菌体含有单链有义RNA基因组，含有成熟酶、外壳和复制酶基因，且具有小的104IGG应答，而在对照小鼠中没有检。
38、测到抗体。如此，在MS2单链二聚体VLP表面展示的L2肽出高免疫原性，这是其他展示VLP的抗原特征性的。0103展示HPV16L2肽的PP7VLP能诱导中和抗体，其保护小鼠免于同源和异源生殖性HPV假病毒激发0104我们设计的16L2VLP疫苗含有来自HPV16L2的氨基酸1731，该区域显示为含有一个或多个高度交叉反应性中和表位1,5，表明16L2VLP能引发与来自其他HPV株系的L2序列广泛交叉反应的抗体而且能潜在地保护免于HPV激发。首先，我们评估来自用在N端展示HPV16L21731的重组MS2VLP免疫的小鼠的血清是否能与来自5种HPV株系HPV1,5,6,16,18的代表L2氨基酸。
39、1440的肽交叉反应。如图4中显示的，该血清是广泛交叉反应性的，与所有5种肽均反应。没有预料到的是，来自用在AB环中展示相同HPV16L2肽的PP7VLP免疫的小鼠的血清则远没有那么广泛地交叉反应。0105为了确定在MS2外壳蛋白N端插入表位1731所观察到的更广泛的交叉反应性与保护相关，将小鼠用在MS2外壳蛋白N端16L21731NTERMMS2VLP或在PP7外壳蛋白AB环16L21731AB环PP7VLP展示HPV16L2表位的VLP或对照VLP免疫，然后在第二次免疫后3至5周用一组HPV假病毒PSVPSV5,6,16,31,33,35,39,45,51,53和58激发。如预期的，用16。
40、L21731NTERMMS2VLP或16L21731AB环PP7VLP免疫的小鼠显示对使用同源HPV16PSV的高剂量阴道激发的几乎完全保护图5A。保护类似于用HPV16L1L2VLP免疫的小鼠。然而，在对异源HPVPSV激发的保护中有急剧差异图5B。用L2PP7VLP免疫导致针对异源PSV的适度保护或无保护。相比之下，用L2MS2VLP免疫导说明书CN104159606A1211/12页13致对使用9种异源类型的阴道激发和一种使用HPV5PSV的皮内激发的显著保护。在测试的10种异源PSV类型中，我们观察到针对其中9种的感染的非常强信号中80至7,190倍降低的保护。针对HPV31PSV的保。
41、护稍微低一些17倍，但仍是统计学显著的P001，单侧T检验。如此，使用展示单HPV16L2肽的MS2VLP免疫提供针对多种HPV假病毒类型的保护。0106我们的实验显示在对异源HPVPSV激发的保护中有急剧差异。见图8。使用L2PP7VLP免疫导致针对异源PSV的适度或无保护。相对地，使用依照本发明的N端展示的L2MS2VLP免疫导致针对用9种异源类型的阴道激发和一种用HPV5PSV的皮内激发的显著保护。在测试的10种异源PSV类型中，我们观察到针对其中9种的感染的非常强信号中约80至7,190倍降低的保护，这是一项未预料到的结果。令人惊讶地，该保护实质性强于在用AB环展示的L2免疫的小鼠中所。
42、观察到的。因此，我们的实验结果证明针对使用依照本发明的VLP的同源激发的保护一般比其中将抗原性L2肽插入AB环的VLP至少高约510倍。具体地，针对异源激发的保护显示为比使用N端VLP构建体好1025倍HPV5,3139、40100倍HPV45,51,53,58或1401000倍HPV6,33,35。0107总结0108在PP7VLP上的肽的遗传展示很适用于已知为中和抗体靶物的特定B细胞表位的准确靶向。对于包括流感4,12、丙肝病毒8和HIV2在内的许多病原体，广泛中和性抗体的靶表位是免疫原性较差的，意味着全长蛋白质不适宜诱导通过疫苗接种的抗体应答。另一方面，使用肽表位作为疫苗由于其较差的免疫。
43、原性而受限，除非偶联于载体蛋白。我们描述过的PP7和MS2VLP平台允许在高度免疫原性背景中靶向引入特定的肽表位。在该例子中，我们将广泛中和性表位靶向到HPV16L2蛋白的N端。该表位是HPV中和性单克隆抗体的靶物5，而且已知相应的合成肽在连接于载体蛋白时能引发针对HPV的交叉中和性抗体1。我们显示在噬菌体外壳蛋白N端展示L2表位的MS2VLP诱导高滴度的肽特异性抗体，且该抗体具有足够高的滴度以对小鼠提供几乎完全的保护免于同源HPV16以及异源HPV5,6,31,33,35,39,45,51,53,和58假病毒的生殖激发。如此，MS2VLP显示对靶向诱导针对特定表位的抗体的效用。0109参考文。
44、献01101ALPHS,HH,RGAMBHIRA,BKARANAM,JNROBERTS,SJAGU,JTSCHILLER,WZENG,DCJACKSON,ANDRBRODEN2008PROTECTIONAGAINSTHETEROLOGOUSHUMANPAPILLOMAVIRUSCHALLENGEBYASYNTHETICLIPOPEPTIDEVACCINECONTAININGABROADLYCROSSNEUTRALIZINGEPITOPEOFL2PROCNATLACADSCIUSA1055850501112BURTON,DR,RLSTANFIELD,ANDIAWILSON2005ANTIBODY。
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46、ON2009ANTIBODYRECOGNITIONOFAHIGHLYCONSERVEDINFLUENZAVIRUSEPITOPESCIENCE32424651说明书CN104159606A1312/12页1401145GAMBHIRA,R,BKARANAM,SJAGU,JNROBERTS,CBBUCK,IBOSSIS,HALPHS,TCULP,NDCHRISTENSEN,ANDRBRODEN2007APROTECTIVEANDBROADLYCROSSNEUTRALIZINGEPITOPEOFHUMANPAPILLOMAVIRUSL2JVIROL81139273101156JOHNSON,KM,。
47、RCKINES,JNROBERTS,DRLOWY,JTSCHILLER,ANDPMDAY2009ROLEOFHEPARANSULFATEINATTACHMENTTOANDINFECTIONOFTHEMURINEFEMALEGENITALTRACTBYHUMANPAPILLOMAVIRUSJVIROL8320677401167KARANAM,B,SJAGU,WKHUH,ANDRBRODEN2009DEVELOPINGVACCINESAGAINSTMINORCAPSIDANTIGENL2TOPREVENTPAPILLOMAVIRUSINFECTIONIMMUNOLCELLBIOL872879901。
48、178LAW,M,TMARUYAMA,JLEWIS,EGIANG,AWTARR,ZSTAMATAKI,PGASTAMINZA,FVCHISARI,IMJONES,RIFOX,JKBALL,JAMCKEATING,0118NMKNETEMAN,ANDDRBURTON2008BROADLYNEUTRALIZINGANTIBODIESPROTECTAGAINSTHEPATITISCVIRUSQUASISPECIESCHALLENGENATMED1425701199LIM,F,TPDOWNEY,ANDDSPEABODY2001TRANSLATIONALREPRESSIONANDSPECICRNABIN。
49、DINGBYTHECOATPROTEINOFTHEPSEUDOMONASPHAGEPP7JBIOLCHEM2762250713012010PEABODY,DS,BMANIFOLDWHEELER,AMEDFORD,SKJORDAN,JDOCARMOCALDEIRA,ANDBCHACKERIAN2008IMMUNOGENICDISPLAYOFDIVERSEPEPTIDESONVIRUSLIKEPARTICLESOFRNAPHAGEMS2JOURNALOFMOLECULARBIOLOGYDOI101016/JJMB/200804049012111ROBERTS,JN,CBBUCK,CDTHOMPSON,RKINES,MBERNARDO,PLCHOYKE,DRLOWY,ANDJTSCHILLER2007GENITALTRANSMISSIONOFHPVINAMOUSEMODELISPOTENTIATEDBYNONOXYNOL9ANDINHIBITEDBYCARRAGEENANNATMED1385761012212SUI,J,WCHWANG,SPEREZ,GWEI,DAIRD,LMCHEN,ESANTELLI,BSTEC,GCADWELL,MALI,HWAN,AMURAKAMI,AYAMMANURU,THAN,NJCOX,LABANKSTON,RO。