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1、10申请公布号CN104055796A43申请公布日20140924CN104055796A21申请号201410193518122申请日20140509A61K35/56200601A61P35/00200601A61P35/0220060171申请人大连海洋大学地址116000辽宁省大连市西岗区黄河路219号申请人金桥72发明人金桥李伟佟长青曲敏朱春芃74专利代理机构大连非凡专利事务所21220代理人闪红霞54发明名称紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用57摘要本发明公开一种紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用，提取物依次按照如下步骤提取以紫海胆动物壳棘为原料，。
2、经粉碎烘干后用乙醇提取，将提取液减压浓缩后得浸膏；取浸膏溶于水，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并水相部分；再用正丁醇萃取，合并正丁醇层；将经减压浓缩的正丁醇层经正相硅胶柱层析，收集乙酸乙酯甲醇梯度为10051006的洗脱液，为一次洗脱液；浓缩所收集的一次洗脱液并再次进行正相硅胶柱层析，收集乙酸乙酯甲醇梯度为10031004的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶，得到紫海胆壳棘提取物。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图12页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图12页10申请公布号CN104055796ACN104055796A1/1页。
3、21一种紫海胆壳棘提取物，其特征是依次按照如下步骤提取A以紫海胆ANTHOCIDARISCRASSIPINA动物壳棘为原料，经粉碎烘干后用乙醇提取，将提取液减压浓缩后得浸膏；B取浸膏溶于水，用石油醚萃取，合并水相部分；再用乙酸乙酯萃取，合并水相部分；再用正丁醇萃取，合并正丁醇层，减压浓缩；C将经减压浓缩的正丁醇层经正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯甲醇进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯甲醇梯度为10051006的洗脱液，为一次洗脱液；浓缩所收集的一次洗脱液并再次进行正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯甲醇进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯甲醇梯度为10031004的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶，得到紫海胆。
4、壳棘提取物。2根据权利要求1所述紫海胆壳棘提取物，其特征在于所述A步骤是以质量浓度75的乙醇在2328的温度条件下提取4小时，料液比为120。3一种如权利要求1或2所述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。4一种如权利要求3所述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应用，其特征在于在制备抑制血癌、乳腺癌或直肠癌细胞生长药物中的应用。权利要求书CN104055796A1/4页3紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用技术领域0001本发明涉及一种紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。背景技术0002海胆始载于本草原始，别名海胆虎（动物图谱棘皮），属于棘皮。
5、动物门（ECHINODERMATA）、海胆纲（ECHINOIDEA），紫海胆ANTHOCIDARISCRASSISPINAAAGASSIZ是其中一种。0003海胆由壳（骨壳）、棘（棘刺）和内脏组成，是营养丰富的海珍品。尽管现代医学证明海胆壳、棘及生殖腺等部位有良好的药用价值，但所报道的主要功效如下海胆性“咸”，“平”（中药志），“有小毒”（山东中草药手册），“主治心疼”（本草原始），有“软坚化痰，散结消肿，消瘰疬痰核、制酸止痛，清热解毒”的功用。迄今为止，未见有关于紫海胆壳棘提取物有抑制癌细胞生长作用的相关报道，以至于海胆壳棘多被作为废弃物而丢弃，浪费了潜在的药用资源。发明内容0004本发明是。
6、为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。0005本发明的技术解决方案是一种紫海胆壳棘提取物，其特征是依次按照如下步骤提取A以紫海胆ANTHOCIDARISCRASSIPINA动物壳棘为原料，经粉碎烘干后用乙醇提取，将提取液减压浓缩后得浸膏；B取浸膏溶于水，用石油醚萃取，合并水相部分；再用乙酸乙酯萃取，合并水相部分；再用正丁醇萃取，合并正丁醇层，减压浓缩；C将经减压浓缩的正丁醇层经正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯甲醇进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯甲醇梯度为10051006的洗脱液，为一次洗脱液；浓缩所收集的一次洗脱液并再次进行正相硅胶柱层析，用乙酸。
7、乙酯甲醇进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯甲醇梯度为10031004的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶，得到紫海胆壳棘提取物。0006所述A步骤是以质量浓度75的乙醇在2328的温度条件下提取4小时，料液比为120。0007一种上述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。0008所述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应用，是在制备抑制血癌、乳腺癌或直肠癌细胞生长药物中的应用。0009本发明是以来源广泛、价格低廉的海胆加工废弃物海胆壳、棘为原料，利用溶剂提取法对其进行提取，并经有机溶剂萃取、硅胶柱层析而获得的提取物。所得到的提取物经抗肿瘤实验证明，对人慢性髓性白血病。
8、细胞K562、人早幼粒极性白血病细胞HL60、人乳说明书CN104055796A2/4页4腺癌细胞SKBR3、人乳腺癌细胞MCF7、人结直肠腺癌细胞SW620有显著的细胞毒性作用，其IC50值均在3090GML1之间，并具有剂量依赖性。细胞凋亡实验表明该提取物有显著诱导HL60急髓白血病M3细胞株、SKBR3人乳腺癌细胞和SW620结肠癌细胞凋亡的作用，其诱导凋亡作用有剂量依赖性，因此本发明提取物有显著的细胞毒性和诱导细胞凋亡的作用。本发明操作简单，所用溶剂均为普通化学试剂，易重复，适于大规模生产。附图说明0010图1本发明提取物对人慢性髓性白血病细胞K562体外实验抑制率示意图。0011图2。
9、本发明提取物对人早幼粒极性白血病细胞HL60体外实验抑制率示意图。0012图3是本发明提取物对人乳腺癌细胞SKBR3体外实验抑制率示意图。0013图4是本发明提取物对人乳腺癌细胞MCF7体外实验抑制率示意图。0014图5是本发明取物对人结直肠腺癌细胞SW620体外实验抑制率示意图。0015图6图10本发明提取物对人早幼粒极性白血病细胞HL60的诱导凋亡作用示意图。0016图11图15本发明提取物对人乳腺癌细胞SKBR3的诱导凋亡作用示意图。0017图16图20本发明提取物对人结直肠腺癌细胞SW620的诱导凋亡作用示意图。0018图21本发明提取物对人早幼粒极性白血病细胞HL60的流式细胞术实验。
10、抑制率示意图。0019图22本发明提取物对人乳腺癌细胞SKBR3的流式细胞术实验抑制率示意图。0020图23本发明提取物对人结直肠腺癌细胞SW620的流式细胞术实验抑制率示意图。具体实施方式0021依次按照如下步骤提取A以4公斤紫海胆ANTHOCIDARISCRASSIPINA动物壳棘为原料，经粉碎烘干后用闪式提取器以质量浓度75的乙醇在2328的温度条件下提取二次，每次4小时，料液比为120；将提取液合并用多级闪蒸器、旋转蒸发器减压浓缩后得浸膏736G；所得浸膏经乙酸酐浓硫酸反应呈阳性，表明其中含有甾体皂苷类物质；B将浸膏均匀分散于05L水中，用15L石油醚分三次萃取，合并水相部分；再用15。
11、L乙酸乙酯分三次萃取，合并水相部分；再用15L正丁醇分三次萃取，合并得到正丁醇层提取液，减压浓缩得到1539G正丁醇层浓缩液；C将所得到的正丁醇层浓缩液经正相硅胶柱层析（300G300400目硅胶湿法装柱，柱高70CM，柱径25CM，流速10ML/MIN），用乙酸乙酯甲醇（1001100100）的洗脱液进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯甲醇的梯度为10051006的洗脱液，为一次洗脱液，浓缩一次洗脱液得到132G；再次进行正相硅胶柱层析（20G300400目硅胶湿法装柱，柱高120CM，柱径1CM，流速3ML/MIN），乙酸乙酯甲醇（1001100100）的洗脱液梯度洗脱，收集乙酸乙酯甲醇的梯度为10。
12、031004的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶，得到白色固体21MG，即紫海胆壳棘提取物。0022实验一以本发明实施例得到的紫海胆壳棘提取物进行体外抗肿瘤实验说明书CN104055796A3/4页5采用人慢性髓性白血病细胞K562、人早幼粒极性白血病细胞HL60、人乳腺癌细胞SKBR3、人乳腺癌细胞MCF7、人结直肠腺癌细胞SW620五种肿瘤细胞系，进行MTTSRB实验。00231K562和HL60细胞种板收集细胞，并在1000转/分的条件下离心，用PBS缓冲液将细胞清洗一次，再离心，用新鲜培养基重悬后，按照8000CELL/WELL，180UL种板后加药；2SKBR3、MC。
13、F7和SW620细胞种板提前一天处理细胞，将细胞消化离心后，重悬，按照8000CELLS/WELL，180L种板，次日加药；3加药将本发明所得紫海胆壳棘提取物按照100、50、25、125、625、32G/ML浓度梯度加入上述细胞中，并在37恒温箱培育48H。00244K562和HL60的IC50测定48H后每孔加入20LMTT，37恒温孵育4H后，离心，去除上清液，加入150LDMSO/孔，用酶标仪测定OD570NM值。00255SKBR3、MCF7和SW620的IC50测定48H后，加入预冷的10TCA溶液100L/WELL，4冰箱固定1H，之后用H2O洗涤4次，室温下晾干；加入04SRB。
14、染色液100L/WELL，30MIN后，用1乙酸洗涤4次，室温下晾干；最后，加入TRISBASE碱液（10MM，PH105）150L/WELL，混匀后，用酶标仪测定OD510NM。0026作用48小时后，不同浓度的本发明实施例提取物对人慢性髓性白血病细胞K562、人早幼粒极性白血病细胞HL60、人乳腺癌细胞SKBR3、人乳腺癌细胞MCF7、人结直肠腺癌细胞SW620的抑制率示意图分别如图1、图2、图3、图4、图5所示。0027体外实验表明，本发明实施例提取物对5株癌细胞（K562、HL60、SKBR3、MCF7和SW620）的抑制作用均随着样品浓度的升高而升高，有细胞毒性作用，并且具有剂量依赖。
15、性。其中浓度100GML1作用的人结直肠腺癌细胞SW620的细胞活性最低，说明浓度100GML1的提取物对SW620的抑制作用最显著。0028表1本发明实施例提取物对五株癌细胞的IC50值注半数抑制浓度，即IC50值，表示对癌细胞抑制率达到50时的样品浓度。0029通过SPSS170软件分析可知作用48H后，本发明提取物在不同程度上抑制了5种癌细胞的生长，均有细胞毒性作用，且对不同的癌细胞株敏感性不同。从表中可以看出本发明提取物对人结直肠腺癌细胞SW620的IC50值最小，仅为3423071GML1，说明提取物对人结直肠腺癌细胞SW620的抑制效果显著，表现出明显的细胞毒性作用。0030二以本。
16、发明实施例得到的紫海胆壳棘提取物进行体外诱导细胞凋亡实验基于凋亡早期细胞的磷脂酰丝氨酸（PHOSPHATIDYLSERINE，PS）由脂膜内侧翻向外侧这一特征，ANNEXINV可用来检测早期凋亡细胞；碘化丙啶（PROPIDIUMIODIDE，PI）能透过细胞膜严重受损的细胞，使细胞核红染，故可用来检测凋亡中晚期及坏死细胞。两种染料结合即可同时区分正常细胞AV/PI、早期凋亡细胞AV/PI、凋亡晚期或坏死细胞AV/PI。说明书CN104055796A4/4页60031测试不同浓度（CTL、25GML1、50GML1、100GML1、150GML1）的本发明提取物分别处理HL60、SKBR3和SW。
17、620细胞24H后的凋亡情况，采用流式细胞术检测细胞状态。以ANNEXINV为横轴，PI为纵轴，左上象限为机械性损伤细胞，左下象限为阴性正常细胞，右上象限为晚期凋亡细胞或者坏死细胞，右下象限为早期凋亡细胞，结果如图620所示。不同浓度（CTL、25GML1、50GML1、100GML1、150GML1）的本发明提取物处理HL60的结果依次如图6图10所示；不同浓度（CTL、25GML1、50GML1、100GML1、150GML1）的本发明提取物处理SKBR3的结果依次如图11图15所示；不同浓度（CTL、25GML1、50GML1、100GML1、150GML1）的本发明提取物处理SW620。
18、的结果依次如图16图20所示。0032结果表明早期凋亡与晚期凋亡的比例均随药物浓度的增大而增加，这说明供试样品对HL60、SKBR3和SW620细胞的诱导凋亡作用具浓度依赖性。0033三采用流式细胞术观察不同浓度提取物对HL60、SKBR3和SW620三种癌细胞的周期作用实验不同浓度（0GML1、50GML1、100GML1、150GML1）的提取物对HL60、SKBR3和SW620细胞的抑制率分别如图21、图22、图23所示。0034图2123反映了本发明提取物对3种癌细胞的抑制活性，随着提取物浓度的升高，HL60细胞、SKBR3细胞和SW620细胞的抑制率均增高，当提取物浓度为150G/M。
19、L时，细胞凋亡率最高，分别为241、176、273，说明提取物有显著诱导三种癌细胞株凋亡的作用，其诱导凋亡作用有剂量依赖性，能够作为潜在的抗肿瘤药物成分。本实验结果提示本发明提取物对癌细胞的作用是多方面的，一方面可诱导细胞阻滞于G0/G1期，另一方又可阻滞细胞进入有丝分裂期（S期）。0035实验表明，本发明的紫海胆壳棘提取物可在制备抑制癌细胞生长药物中应用，尤其可在制备抑制血癌、乳腺癌或直肠癌细胞生长药物中应用。说明书CN104055796A1/12页7图1图2说明书附图CN104055796A2/12页8图3图4说明书附图CN104055796A3/12页9图5图6说明书附图CN104055796A4/12页10图7图8说明书附图CN104055796A105/12页11图9图10说明书附图CN104055796A116/12页12图11图12说明书附图CN104055796A127/12页13图13图14说明书附图CN104055796A138/12页14图15图16说明书附图CN104055796A149/12页15图17图18说明书附图CN104055796A1510/12页16图19图20说明书附图CN104055796A1611/12页17图21图22说明书附图CN104055796A1712/12页18图23说明书附图CN104055796A18。