一种用于弓形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用.pdf

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1、10申请公布号CN104152466A43申请公布日20141119CN104152466A21申请号201410136321422申请日20140404C12N15/30200601C07K14/45200601C12N15/85200601A61K48/00200601A61K39/002200601A61P33/02200601C12R1/9020060171申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730000甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号72发明人徐民俊周洋袁子国宋慧群黄思扬周东辉陈佳74专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司11249代理人高松54发明名称一种用于弓形虫感染预。

2、防的疫苗和制备方法及其应用57摘要本发明首先提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列1）序列表中SEQIDNO1中所示的核苷酸序列；2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感染预防功能的核苷酸序列。本发明还提供一种疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。本发明的质粒DNA疫苗PVAXROP7可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，即可有效的延长小鼠的存活时间，减少脑包囊的荷虫量。因此，质粒PVAXROP7能作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫的感染。51IN。

3、TCL权利要求书1页说明书15页序列表6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书15页序列表6页附图2页10申请公布号CN104152466ACN104152466A1/1页21一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列1）序列表中SEQIDNO1中所示的核苷酸序列；2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感染预防功能的核苷酸序列。2一种重组蛋白，其氨基酸序列由权利要求1所述的核苷酸序列编码。3根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于所述重组蛋。

4、白的氨基酸序列参见序列表中SEQIDNO2。4一种重组载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。5一种重组质粒，其核苷酸序列为序列表中SEQIDNO3所示的核苷酸序列。6一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。7权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2或3所述的重组蛋白、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组质粒、权利要求6所述的疫苗在弓形虫感染预防中的应用。8一种权利要求6所述的疫苗的制备方法，步骤如下（1）提取弓形虫RH株总RNA；（2）RTPCR扩增RH株总RNA；（3）将步骤2中的扩增产物与载体连接；（4）PVAXI质粒的小量提取；（5）回收PVAXI载。

5、体及目的片段ROP7；（6）连接PVAXI载体与目的片段ROP7；（7）将连接产物转化至宿主菌中。9根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述RTPCR扩增RH株总RNA时所用引物为上游引物5CGGGGTACCCCGATGGGGCACCCTACCTCTTTC3；下游引物5TGCTCTAGAGCATCACGTTTCCGGTGGTGGC3。10根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述RTPCR扩增RH株总RNA时PCR反应条件为94预变性4MIN，94变性1MIN，62复性1MIN；72延伸2MIN；32个循环，最后，72延伸7MIN。权利要求书CN104152466A1/15页3一种用于弓。

6、形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用技术领域0001本发明属于免疫学和分子生物学领域，具体地，涉及一种用于弓形虫感染预防的疫苗。背景技术0002刚地弓形虫（TOXOPLASMAGONDII）是寄生于人和多种动物的专性细胞内原虫，宿主种类十分广泛，包括哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类及人类，能引起人兽共患的弓形虫病。弓形虫感染能导致孕妇流产，畸胎或死产等严重后果；对于免疫抑制或免疫缺陷病人的危害更为严重，弓形虫病是其常见的致死病因之一。弓形虫作为一种机会感染因子，可在免疫抑制或免疫缺陷患者中（如艾滋病患者、器官移植及恶性肿瘤患者等）引起严重的器官损害。除此之外，由弓形虫引起的畜禽疾病给畜牧业也造成了巨。

7、大的经济损失。0003长期以来人们一直在寻求治疗弓形虫病的理想药物，但结果未能如愿，因此研制有效的弓形虫疫苗来预防人和动物的弓形虫病是最理想的选择之一。对弓形虫疫苗的研究经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗。DNA疫苗又以其独特的优势成为当今研究的热点，如安全，无感染病原的危险；表达的蛋白抗原以天然构型出现，能刺激机体产生全身性免疫应答，尤其是特异性的细胞免疫反应；易与其它疫苗联合使用，以增强免疫效果；可产生持久免疫力，减少免疫次数；无需重组抗原的表达和纯化，制备简单，成本较低，易于大规模生产，具有较好的开发应用前景。虽然目前已有众多的疫苗候选分子本揭示，但是均没有达到。

8、完全的免疫保护效果，因此找到更多更好的来源于不同弓形虫阶段的DNA疫苗候选抗原，尤其是与弓形虫毒力相关的抗原基因是研究抗弓形虫疫苗的一个重要途径。发明内容0004本发明要解决的技术问题是提供一种用于弓形虫感染预防的疫苗，为此，本发明还提供所述疫苗的制备方法及其应用。0005弓形虫棒状体蛋白（RHOPTRYPROTEINS，ROPS）是棒状体分泌的对弓形虫侵入宿主细胞起重要作用的蛋白质，在虫体入侵、PV的形成和修饰过程中起着重要作用，棒状体蛋白是重要的入侵和毒力作用因子。在棒状体蛋白中，ROP2是一个很大的蛋白家族（REESEETAL,2009），按ROP2命名，包括ROP2、ROP3、ROP4。

9、、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16和ROP18等。ROP2在弓形虫的速殖子期、缓殖子期、包囊期都能表达并显示出一定的免疫保护性，同时ROP2还是一种保守蛋白，含有能被多数免疫个体所识别的T细胞表位，作为检测用的抗原和疫苗候选分子具有巨大潜力。棒状体蛋白7（ROP7）是ROP2家族的成员，ROP7的核酸序列与ROP4有71的相似性，其前体蛋白为65KU，成熟蛋白为57KU。弓形虫侵入宿主细胞后就能立即在纳虫空泡膜（PARASITOPHOROUSVACUOLEMEMBRANE，PVM）中找到ROP7，其与ROP1所处的位置相同，并且在弓形虫速殖子和缓殖子阶段均有表达。因此，弓形虫ROP7有。

10、望成为理想的疫苗候选抗原。说明书CN104152466A2/15页40006本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列00071）序列表中SEQIDNO1中所示的核苷酸序列；00082）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；00093）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰，并具有弓形虫感染预防功能的核苷酸序列。0010本发明的第二个目的是提供一种重组蛋白，其氨基酸序列由上述的核苷酸序列编码。0011优选地，所述重组蛋白的氨基酸序列参见序列表中SEQIDNO2。0012本发明的第三个目的是提供一种重组载体，其包括上述的核苷酸序列。

11、。0013本发明的第四个目的是提供一种重组质粒，其核苷酸序列为序列表中SEQIDNO3所示的核苷酸序列。0014本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。0015本发明的第六个目的是提供上述的核苷酸序列、重组蛋白、重组载体、重组质粒、疫苗在弓形虫感染预防中的应用。0016本发明的第七个目的是提供一种上述的疫苗的制备方法，步骤如下0017（1）提取弓形虫RH株总RNA；0018（2）RTPCR扩增RH株总RNA；0019（3）将步骤2中的扩增产物与载体连接；0020（4）PVAXI质粒的小量提取；0021（5）回收PVAXI载体及目的片段ROP7。

12、；0022（6）连接PVAXI载体与目的片段ROP7；0023（7）将连接产物转化至宿主菌中。0024优选地，所述RTPCR扩增RH株总RNA时所用引物为0025上游引物5CGGGGTACCCCGATGGGGCACCCTACCTCTTTC3；0026下游引物5TGCTCTAGAGCATCACGTTTCCGGTGGTGGC3。0027优选地，所述RTPCR扩增RH株总RNA时PCR反应条件为94预变性4MIN，94变性1MIN，62复性1MIN；72延伸2MIN；32个循环，最后，72延伸7MIN。0028本发明的质粒DNA疫苗PVAXROP7可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，即。

13、可有效的延长小鼠的存活时间，减少脑包囊的荷虫量。因此，质粒PVAXROP7能作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫的感染。附图说明0029附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中0030图1是PVAXROP7构建路线；0031图2是弓形虫RH株死亡情况；0032图3是PVAXI质粒。说明书CN104152466A3/15页5具体实施方式0033以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

14、的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。0034本发明中实验材料购自0035雌性KM鼠，6W龄左右，体重202G，购自兰州大学医学实验中心。0036宿主菌，弓形虫RH、PRU株，PVAXI真核表达载体等材料，均为中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保存并提供。0037PRIMESCRIPTTMONESTEPRTPCRKITVER2（货号RR055B）、10PCRBUFFER（MG2FREE）、MGCL2（25MMOL/L）、DNTPMIXTURE（25MMOL/LEACH）、EXTAQ（5U/L）（货号DDR100D）、PGEMTEASYVECTOR（货号。

15、A1360）、BAMHI（货号D1010A）、XHOI（货号D1094A）、KPNI（货号D1068A）、PSTI（货号D1073A）、XBAI（货号D1093A）、10MBUFFER、10KBUFFER、10和6LOADINGBUFFER购自TAKARA公司；0038SVGENOMICDNAPURICATIONSYSTEM（货号A2360）、TRISCL、EDTA、IPTG、XGAL、T4DNA连接酶购自PROMEGA公司；0039RNAPREPPURETISSUEKIT（货号DP431）、TIANPREPMINIPLASMIDKIT（货号DP10302）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（货。

16、号货号DP20902）、普通DNA产物纯化试剂盒（货号DP20402）购自天根生化科技（北京）有限公司；0040氨苄青霉素（AMP）、卡那霉素（KAN）、琼脂糖购自SIGMA公司；0041其他化学试剂如NACL、无水乙醇等均为国产分析纯级产品。0042一、弓形虫RH株PVAXROP7疫苗的制备方法如下00431弓形虫RH株总RNA的提取将弓形虫RH株腹腔接种KM鼠，96H后，经颈椎脱臼致死，无菌收集小鼠腹水10ML，在10000转/分钟转速下离心35MIN，弃上清，备用。用天根生化科技（北京）有限公司的试剂盒RNAPREPPURETISSUEKIT提取弓形虫RH株总RNA，提取的具体方法和步骤。

17、参见说明书。00442RTPCR扩增以所提取的弓形虫RH株总RNA为模板，用大连宝生物工程公司PRIMESCRIPTTMONESTEPRTPCRKITVER2试剂盒进行ROP7基因的RTPCR扩增，使用方法参见说明书。其中，0045上游引物FROP75CGGGGTACCCCGATGGGGCACCCTACCTCTTTC3；0046下游引物RROP75TGCTCTAGAGCATCACGTTTCCGGTGGTGGC3；0047PCR反应条件为94预变性4MIN，94变性1MIN，62复性1MIN；72延伸2MIN；32个循环，最后，72延伸7MIN。00483PCR纯化产物的连接将步骤2中的扩增产物。

18、与PGEMT连接，连接反应使用TAKARA公司PGEMTEASYVECTOR，使用方法参见说明书，连接条件为16反应24H或4连接过夜，连接产物标记为PGEMROP7。00494ROP7的序列测定将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。测序结果参见序列表中SEQIDNO1中所示的核苷酸序列，其编码说明书CN104152466A4/15页6的蛋白序列参见序列表中SEQIDNO2。00505PVAXI质粒的小量提取用天根生化科技（北京）有限公司TIANPREPMINIPLASMIDKIT进行PVAXI质粒提取，使用方法参照说明书。00516PVAXI载体（图1所示。

19、）及目的片段ROP7的回收用KPNI和XBA分别双酶切PVAXI质粒及PGEMROP7重组质粒，并用天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体及目的片段，使用方法参照说明书。00527PVAXI载体与目的片段ROP7的连接将经切胶回收纯化得到的ROP7基因片段定向亚克隆至PVAXI载体中。16反应46H或4连接过夜，产物标记为PVAXROP7。其核苷酸序列见SEQIDNO3，其中，横线部分为ROP7的核苷酸序列。00538连接产物的转化与鉴定将连接产物10L转化大肠杆菌DH5中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。产物标记为PVAXROP7。PVAXROP7构建路线见图1。。

20、0054二、培养基和溶液的配制0055A、溶液的配制0056（1）LB液体培养基0057称取LB粉末50G，加适量的去离子水溶解，并定容至200ML，121高压灭菌20MIN，4保存备用。0058（2）LB固体培养基0059于LB液体培养基中加入20（M/V）琼脂粉，121高压灭菌20MIN，待其冷却到5565时倾注平板，待凝固后4保存备用。0060（3）KANLB选择液体培养基0061待（1）中制备的LB液体培养基高压灭菌后冷却至5055时，加入KAN（卡那霉素）（终浓度为1000IU/ML），摇晃混匀后4保存。0062（4）KANLB固体选择培养基0063待（2）中制备的LB固体培养基灭菌。

21、后冷却至5055时，加入KAN（终浓度为1000IU/ML）并轻轻摇动，混匀后迅速倾注平板，室温凝固并于4保存备用。0064B、质粒大量提取时溶液的配制0065（1）025MOL/LTRISCL溶液（PH80）0066称取TRISCL粉末6055G，并将其溶解到100MLDDH2O中，调节PH值为80，定容到200ML，高压灭菌后4保存备用。0067（2）05MOL/LEDTA溶液（PH80）0068称取NA2EDTA3722G，溶于200MLDDH2O中，振荡混匀，调节PH值为80，高压灭菌后4保存备用。0069（3）TE溶液（PH80）0070先将（1）中制备的025MOL/LTRISCL。

22、溶液和（2）中制备的05MOL/LEDTA溶液（PH80）稀释，并分别吸取10MMOL/LTRISCLL0ML与1MMOL/LEDTA02ML，加入无菌DDH2O后定容到100ML，4保存备用。0071（4）10SDS溶液（PH72）0072称取SDS（十二烷基磺酸钠）粉末10G，加入去离子水90ML后60水浴溶解，用浓HCL将其PH值调为72，并定容到100ML，现配现用，不宜长期保存。说明书CN104152466A5/15页70073（5）2MOL/LNAOH溶液0074先于烧杯中加入去离子水160ML，称取NAOH粉末160G并缓缓加入到去离子水中，边加边混匀，定容到200ML后于塑料瓶。

23、中4保存。0075（6）SOLUTIONI0076取（1）中制备的025MOL/LTRISC110ML，（2）中制备的05MOL/LEDTA2ML，加去离子水定容到100ML，高压蒸汽灭菌后4保存。0077（7）SOLUTIONII0078取2MOL/LNAOH10ML，10SDS10ML，加去离子水定容到100ML，现配现用，常温保存，不宜长时间存放。0079（8）SOLUTIONIII0080称取KAC粉末58884G，与冰乙酸23ML混合，加入适量去离子水溶解后定容到200ML，4保存。0081（9）3MOL/LNAAC溶液（PH52）0082称取无水NAAC4922G，加去离子水定容到。

24、200ML，高压蒸汽灭菌后4保存。0083（10）5MOL/LLICL溶液0084称取无水LICL424G，加去离子水定容到200ML，高压蒸汽灭菌后4保存。0085（11）10MG/ML溶菌酶0086使用前，称取10MG的溶菌酶，加10MMOL/L的TRISCL（PH80）即刻溶解定容至1ML，20保存。0087三、大量制备质粒00881挑取步骤（一）和（二）中制备的已保存于20的含有目的质粒（PVAXI，PVAXROP7）的阳性菌液于KANLB固体选择培养基上划线，37培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于12MLKANLB液体选择培养基中，摇床37，以180220转/分钟的转速培养1216H。

25、。将上述培养菌液以体积比1100的比例接种到装有400MLKANLB液体选择培养基的1000ML锥形瓶中，摇床37，在180220转/分钟转速下培养过夜。00892将步骤1得到的细菌培养物置于冰中或4冰箱数分钟，4，以9000转/分钟转速离心5MIN，收集细菌培养物沉淀，弃上清（利用移液器小心吸出上清），倒置离心管使上清尽量流出。用10ML4预冷的SOLUTIONI重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在SOLUTIONI中完全分散。（由于旋涡振荡和SOLUTIONI的加入已足够是菌液裂解分散，为了简化操作，此处省去现有技术中进一步裂解分散的步骤加入1ML新配制的10MG/ML溶菌酶溶液（PH80），震荡。

26、混匀）。00903在步骤2得到的菌液中加入20ML新配制的SOLUTIONII，轻摇并上下颠倒混匀24次。再加入15ML4预冷的SOLUTIONIII，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或20冰箱放置10MIN。加SOLUTIONII和SOLUTIONIII的时间间隔控制在5MIN以内，以免过分裂解。4或室温，在11000转/分钟下离心10MIN，利用4层纱布将上清过滤，转移到两个新50ML离心管中。00914将步骤3得到的上清与1416ML异丙醇（现有技术中此处需加入06倍体积的异丙醇的方法，本申请人通过实验发现，异丙醇的加入量在06倍体积上下各1ML的范围内，是不影响产物的提取质量和产量。

27、的）混匀，室温放置10MIN。室温下，在11000转/分钟说明书CN104152466A6/15页8下离心10MIN，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟，除去残余。加入3MLDDH2O充分溶解，再加入3ML预冷的5MOL/LLICL溶液（此时需先加DDH2O，后加LICL，才能使沉淀充分溶解，颠倒步骤易造成沉淀溶解不充分或不溶解），充分混匀，此处不可用吹打的方式混匀。吹打混匀易使提取的质粒发生断裂，两只离心管合并为一管，冰中或20冰箱放置10MIN。4或室温，在11000转/分钟下离心10MIN，将上清分别转移到一新50ML离心管中，加入等体积（12ML）预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10MI。

28、N。4或室温，在11000转/分钟下离心10MIN，小心弃上清，倒置控干管内液体，一般倒置1015MIN即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。00925在步骤4制备的白色沉淀物中加入3MLDDH2O或TE溶液（PH80）溶解沉淀，并加入30L10MG/MLRNASEA（TAKARA公司产品），37水浴1H除去RNA。加入2倍体积（8ML）无水乙醇和1/10体积（400L）。用3MOL/LNAAC溶液，充分混匀，冰中或20冰箱放置20MIN。4，在11000转/分钟下离心10MIN，小心将上清吸出（勿用倾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出），并将离心管倒置于滤纸上控干。

29、（主要控干残余的试剂如乙醇和NAAC，减少杂质，提高质粒的纯度）。加入100LDDH2O或TE溶液（PH80），充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，测出的浓度为10000MG/ML。因此，我们将以保存浓度为1000MG/ML（十倍稀释）的量分装于15ML离心管中，即每管保存有1000MG质粒，体积为1ML，分装封口后于20保存备用。0093四、质粒DNA的纯度检测0094以DDH2O或TE（PH80）为空白对照，用分光光度计测定波长260NM和280NM下的核酸溶液光密度（OD）值。双链DNA纯品的OD260/OD280值为18，若样品OD260/OD280值低于18，说。

30、明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。0095五、重组质粒的免疫效果评价00961KM鼠免疫与分组为了降低应激反应，KM鼠买回后需饲养1周，然后将其随机分为4个组，每组23只，具体分组见表1。0097表1免疫实验分组情况0098组别加入的免疫试剂第I组CONTROL不做任何处理第II组PBS第III组PVAXI第IV组PVAXROP70099以左后腿胫后肌注射途径进行免疫，首先将空载体PVAXI和提取纯化的重组质粒PVAXROP7用PBS（PH74）溶液稀释至100G/100L，分别给第3、4组中每只小鼠各注射100L。初次免疫后，按照同样的剂量，于第2周和第4周对第组至第组加强免疫一次。01。

31、002腹腔注射感染弓形虫RH株弓形虫RH株的复苏需在攻虫前2周进行。从液氮罐中取出保存有弓形虫RH株虫体的冻存管，并立即将其放入37温水中进行解冻。将冻存说明书CN104152466A7/15页9管中的液体混匀，每只小鼠腹腔注射200L，进行第一次传代。待感染小鼠发病（46D），颈椎脱臼处死后无菌采集小鼠腹水12ML。混匀后，吸取10L腹水进行镜检。按照上述方式进行第二和第三次传代。将经第三次传代纯化后所得虫体按1103个速殖子/只的剂量，腹腔接种各组小鼠各10只，观察并记录其存活时间。见表2。01013灌胃感染弓形虫PRU株弓形虫PRU株的准备需在攻虫前30天进行。颈椎脱臼处死被弓形虫PRU。

32、株感染的小鼠，75酒精浸泡23MIN。取出并于超净工作台中，无菌采集脑组织并将其置于研钵中，加入1ML生理盐水进行研磨。待研磨完全后，吸取10L进行镜检，并观察计数。按10个包囊/只的剂量，以灌胃的方式感染各组小鼠各10只，攻虫后30天进行脑包囊计数。见表3。0102本发明的有益效果将通过以下数据说明0103表2弓形虫RH株死亡情况0104组N15；每组15只用于攻虫存活天数均值SDCONTROL500APBS500APVAXI500APVAXROP713569B0105表3PRU脑包囊计数和减虫率0106分组N4；每组4只用于包囊计数包囊计数均值SD减虫率CONTROL21002925APB。

33、S18002758A1488PVAXI17001874A1764PVAXROP79003213B55640107如表2所示，与对照组（CONTROL，PBS和PVAXI）相比，实验组（PVAXROP7）小鼠存活时间均显著性增加，PVAXROP7的存活时间分别为13569D，能显著性增加实验鼠感染TGONDIIRH株后的存活天数；5D内对照组小鼠无存活。0108从上述表格可以看出，无论是减少PRU脑包囊数目，还是延缓RH的死亡时间，都说明重组质粒PVAXROP7可有效地起到良好的免疫效果，可以作为弓形虫感染预防的疫苗使用。0109最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发。

34、明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可说明书CN104152466A8/15页10以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。0110说明书CN104152466A109/15页110111说明书CN104152466A1110/15页120112说明书CN104152466A1211/15页130113说明书CN104152466A1312/15页140114说明书CN104152466A1413/15页150115说明书。

35、CN104152466A1514/15页160116说明书CN104152466A1615/15页17说明书CN104152466A171/6页18序列表中国农业科学院兰州兽医研究所一种用于弓形虫感染预防的疫苗和制备方法及其应用PATENTINVERSION3511728DNA弓形虫ROP71ATGGGGCACCCTACCTCTTTCGGACAGCCGTCGTGTCTTGTCTGGCTAGCTGCGGCATTC60CTTGTTCTGGGGCTTTGCCTCGTCCAGCAAGGCGCTGGCATACAGCGGCCTCACCAGTGG120AAGAGCTCGGAAGCCGCTTTGAGTGTCA。

36、GTCCGGCGGGAGACATCGTGGACAAGTATTCT180CATGATTCCACTGAAGGAGAGAACACTGTCTCAGAGGGGGAAGCTGAGGGCAGTCGGGGG240GGTTCATGGCTGGAGCAGGAGGGGGTTGAATTAAGGCCGCCTTTACTGGACAGCCAGACA300GGAACCTCGACCGCGTCCCCCACAGGCTTCAGAAGGTTCCTCAGGCGTTTGCGTTTTTGG360CGTCGTGGGAGTACACGCGGATCCGATGATGCAGCAGAAGTTTCCAGGAGGACTCGGGTT420CCTCTGCATACCC。

37、GTCTGCTTCAGCATTTGCGGCGGGTTGGAAGATTTTTCCGACATGGC480ATTCCAGCGGCAGCTGGCAGATTTTTCAGGCGAGTTTGGCCGGAGCGTCCACAACCCGTT540TTCACTGAAGGTGATCCTCCGGATCTCGAGACGAATTCCTTGTATTATCGTGACAAGGTT600CCAGGAGAGGTGATAATCCGGGAGGTTCTTGGCAAGGTGGCGGGGTTCGGACCAACGTCC660GGGCATGGTGTGTTTGCCGCATATGAAAACGCATTCTCGGAAATGCTGTGGGCGGAAGGT7。

38、20GGGGCTGTCACAGTGATTTCTGAATTGGGCCGGCCCGGGAGACAGCTCGTCAGGGGTAAC780CTAATCAACATTGTTGATGGAGGATTGCTGTTTCAAGCGACAGACCAAGCGACAGGAGAA840CCGATGACTGTACTGGTTGGCAGTACTTGGAACAAACCGTCTGGGAAGGACTTAGATAAG900CTGCGGCACCAAGCACTAGCTATTGGGTTGTTTCAAAAGGTGAAGAACCCATATCTAGCT960AACAGGTATCTAAGATTTCTGGCCCCGTTCGATTTGGTGACGATCC。

39、CGGGGAAGCCATTA1020GTTCAGAAAGCTAAGTCACATAATGAGGTTGGCTGGGTCATAAATCTGTTGTTACTGCTT1080CCTGCAATTGAGATCGATATGGGAAGGTTTGTCGAGGAGCTGTACGAGCTTCCAACAGAG1140GACCGCCCCCTAGCTGATGCCGCTCGATTGTATCTTACTGTTCAGGCGGTGAGGCTGGTA1200GCTCACCTCCAAGACGAAGGAGTGGTGCACGGGAAGATATTGCCTGATTCGTTTTGTTTG1260AAGCGTGAGGGGGGCCTGTACTTGCG。

40、TGACTTTGGCTCTCTGGTGAGAGCGGGCACAAAA1320GTGGTGGCTGAAAATGCTCAAGGCTTTTCGCCGCCGGAAGTTCGTGGATCCCGCGGAGGA1380CTTCTTTTTGGTCCACGCAAGACCCAGATGACACACGGAATGGATGCGTGGGGGTTGGGA1440GCGACTATATTTTTTATTTGGTGCTTTAAAGCTCCAACTACAGGACCTGAAGAGGAATAC1500TCCATCGAATTCTTGTTCTCATTGTGCCGGCGGGCACCAGAGAACGTGAAACTCCTGGTT1560序列表CN1。

41、04152466A182/6页19TACAAGTTGATTAACCCTTCTGTCGAGGCCCGCCTGCTCGCCTTGCAAGCGACGGAGACT1620CCGGAATACAGGGAGATGGAAGAACAGCTGTCCGCTGCTTCGCGCCTGTACTCAGGTGAT1680GGGACGTTGACAGGGGGAGACGATGACATGCCACCACCGGAAACGTGA17282575PRT人工蛋白2METGLYHISPROTHRSERPHEGLYGLNPROSERCYSLEUVALTRPLEU151015ALAALAALAPHELEUVALLEUGLYLEUCYSLEUVALG。

42、LNGLNGLYALA202530GLYILEGLNARGPROHISGLNTRPLYSSERSERGLUALAALALEUSER354045VALSERPROALAGLYASPILEVALASPLYSTYRSERHISASPSERTHR505560GLUGLYGLUASNTHRVALSERGLUGLYGLUALAGLUGLYSERARGGLY65707580GLYSERTRPLEUGLUGLNGLUGLYVALGLULEUARGPROPROLEULEU859095ASPSERGLNTHRGLYTHRSERTHRALASERPROTHRGLYPHEARGARG100105110PHELEUAR。

43、GARGLEUARGPHETRPARGARGGLYSERTHRARGGLYSER115120125ASPASPALAALAGLUVALSERARGARGTHRARGVALPROLEUHISTHR130135140ARGLEULEUGLNHISLEUARGARGVALGLYARGPHEPHEARGHISGLY145150155160ILEPROALAALAALAGLYARGPHEPHEARGARGVALTRPPROGLUARG165170175PROGLNPROVALPHETHRGLUGLYASPPROPROASPLEUGLUTHRASN180185190SERLEUTYRTYRARGASPLY。

44、SVALPROGLYGLUVALILEILEARGGLU195200205VALLEUGLYLYSVALALAGLYPHEGLYPROTHRSERGLYHISGLYVAL210215220PHEALAALATYRGLUASNALAPHESERGLUMETLEUTRPALAGLUGLY225230235240序列表CN104152466A193/6页20GLYALAVALTHRVALILESERGLULEUGLYARGPROGLYARGGLNLEU245250255VALARGGLYASNLEUILEASNILEVALASPGLYGLYLEULEUPHEGLN260265270ALATHRASP。

45、GLNALATHRGLYGLUPROMETTHRVALLEUVALGLYSER275280285THRTRPASNLYSPROSERGLYLYSASPLEUASPLYSLEUARGHISGLN290295300ALALEUALAILEGLYLEUPHEGLNLYSVALLYSASNPROTYRLEUALA305310315320ASNARGTYRLEUARGPHELEUALAPROPHEASPLEUVALTHRILEPRO325330335GLYLYSPROLEUVALGLNLYSALALYSSERHISASNGLUVALGLYTRP340345350VALILEASNLEULEULEULEU。

46、LEUPROALAILEGLUILEASPMETGLY355360365ARGPHEVALGLUGLULEUTYRGLULEUPROTHRGLUASPARGPROLEU370375380ALAASPALAALAARGLEUTYRLEUTHRVALGLNALAVALARGLEUVAL385390395400ALAHISLEUGLNASPGLUGLYVALVALHISGLYLYSILELEUPROASP405410415SERPHECYSLEULYSARGGLUGLYGLYLEUTYRLEUARGASPPHEGLY420425430SERLEUVALARGALAGLYTHRLYSVALVALALA。

47、GLUASNALAGLNGLY435440445PHESERPROPROGLUVALARGGLYSERARGGLYGLYLEULEUPHEGLY450455460PROARGLYSTHRGLNMETTHRHISGLYMETASPALATRPGLYLEUGLY465470475480ALATHRILEPHEPHEILETRPCYSPHELYSALAPROTHRTHRGLYPRO485490495GLUGLUGLUTYRSERILEGLUPHELEUPHESERLEUCYSARGARGALA500505510PROGLUASNVALLYSLEULEUVALTYRLYSLEUILEASNPROSER。

48、VAL515520525GLUALAARGLEULEUALALEUGLNALATHRGLUTHRPROGLUTYRARG530535540GLUMETGLUGLUGLNLEUSERALAALASERARGLEUTYRSERGLYASP序列表CN104152466A204/6页21545550555560GLYTHRLEUTHRGLYGLYASPASPASPMETPROPROPROGLUTHR56557057534671DNA人工序列3GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTA60ATAGTAATCAATTACGGGG。

49、TCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATA120ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAAT180AATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGA240CTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC300CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTT360ATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGAT420GCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAG480TCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCC54。