血小板生成素受体激动剂(TpoRA)杀死急性人骨髓样白血病细胞
发明背景
2005年在美国诊断出约11,920例急性骨髓性白血病(acute myelogenousleukemia)(AML；也称为急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia)、急性骨髓样白血病(acute myeloid leukemia)、急性原粒细胞性白血病(acutemyeloblastic leukemia)、急性粒细胞性白血病(acute granulocytic leukemia)或急性非淋巴细胞性白血病(acute nonlymphocytic leukemia))新病例(Surveillance，Epidemiology and End Results[SEER]Program，2005)。影响成人的最常见急性白血病，即AML能在任何年龄发生，但是65岁和更老的成人比年轻人更有可能形成疾病。另外，AML占儿童急性白血病病例的约15至20％。
AML中的恶性细胞是原粒细胞。在正常的血细胞生成中，原粒细胞是骨髓样白细胞的未成熟前体。然而，在AML中，单一原粒细胞积累使细胞“冷冻”于其未成熟状态中的遗传变化，并阻止分化。单独的此类突变不引起白血病；然而，在“分化阻滞”与破坏控制增殖的基因的其它突变组合时，结果是细胞(白血病胚细胞)的未成熟克隆的不受控制的生长，所述细胞不能发挥正常血细胞的功能，而且还阻断正常骨髓细胞的生成。这导致血液中的红细胞(贫血)、血小板(血小板减少)、和正常白细胞，特别是嗜中性粒细胞(嗜中性白血球减少症)缺乏，导致AML的临床呈现。
几乎所有患有AML的患者在诊断后都尽可能快地要求治疗。在大多数患者中，需要强势化学疗法(诱导疗法)(这期间施用至少两种不同化疗剂)来实现消退。
当血细胞计数逐渐接近正常且不能在血液或骨髓中鉴定出白血病细胞时实现消退。然而，在消退中，残留的白血病细胞仍然存在但没有活性；它们并不妨碍正常血细胞发育，但是的确具有再次生长并引起白血病复发的潜力。为此，通常建议伴有或没有自体干细胞输注或同种异体干细胞移植的别的化学疗法。
不能在血液中或者通过骨髓检查检测出的残留白血病细胞在消退期间保留在身体中。因此，AML的最佳治疗通常在实现了消退后要求另外的强势疗法(巩固疗法)。甚至在巩固疗法的强势化学疗法后，一些患者在他们的骨髓中具有残留的白血病细胞(顽固性白血病)，而且其他患者在实现消退后还遭受“复发”。
在治疗患有AML的患者时要克服的最大困难之一是有些患者的白血病细胞对化学疗法药物不敏感。这能导致用于诱导或维持消退的治疗失败。
在白血病细胞中有三种已知的药物抗性机制来保护其免受化学疗法的作用。第一种，特定的基因编码进化成保护原始细胞免受毒素作用的蛋白质(例如P-糖蛋白(多药抗性蛋白)、肺抗性蛋白、和乳腺癌抗性蛋白)。这些蛋白质等可降低化学疗法在急性白血病细胞中的效力。第二种，化学疗法通过诱导加强的和加速的程序性细胞死亡来利用凋亡基因途径。然而，在一些白血病中，这些基因受到下调或者甚至阻断，精确阻断由化学疗法引起的细胞死亡。第三种，特定的基因家族在导致患者白血病复发的化学疗法抗性细胞中可以有活性的。至今，还没有找到阻断这些中的一种或另一种途径的新的成功的临床办法。
虽然在过去30年里进入消退、保持消退数年、或者实际治愈的AML患者的比例升高了，但是AML仍然是最难治愈的血癌之一。由于此困难，用于治疗AML的新疗法是必不可少的。因此，本领域中长时间地、迫切地需要治疗此破坏性疾病的新方法。本发明满足此需要。
发明概述
本发明的一个实施方案包括一种治疗诊断为患有急性骨髓性白血病的人的方法，所述方法包括对所述人施用包含血小板生成素受体激动剂(TpoRA)、其衍生物、或变体的组合物，进一步地，其中所述组合物在所述人中抑制白血病细胞生长和增殖。一方面，在施用化疗剂之前、期间或之后对所述人施用所述组合物。另一方面，以包含TroRA、其衍生物或变体和药用载体的药物组合物对所述人施用所述TroRA、其衍生物或变体。又一方面，对所述人胃肠外施用所述药物组合物。再一方面，所述血小板生成素受体激动剂是化合物A。
本发明的另一个实施方案包括一种治疗诊断为患有骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)的人的方法，所述方法包括对所述人施用包含血小板生成素受体激动剂(TpoRA)、其衍生物、或变体的组合物，进一步地，其中所述组合物在所述人中抑制白血病细胞生长和增殖。一方面，在施用化疗剂之前、期间或之后对所述人施用所述组合物。另一方面，以包含TroRA、其衍生物或变体和药用载体的药物组合物对所述人施用所述TroRA、其衍生物或变体。又一方面，对所述人胃肠外施用所述药物组合物。再一方面，所述血小板生成素受体激动剂是化合物A。
附图简述
出于例示本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明并不受限于附图中所描绘的实施方案的精确安排和手段。
图1(包含图1A至图1C)是一系列图，其描绘了巨核细胞集落形成测定法。图1A的图像描绘了在存在血小板生成素(TPO)的情况中在血纤蛋白凝块中培养的人CD34+细胞。图1B的图像描绘了在存在化合物A的情况中在血纤蛋白凝块中培养的人CD34+细胞。图1C的图形描绘了用TPO或化合物A刺激后自CD34+细胞形成的集落数目。
图2(包含图2A至图2C)是一系列图，其描绘了代表暴露于TPO或化合物A的人原代白血病细胞的增殖研究的生长曲线。图2A是一对图，其描绘了TPO、化合物A(SB)、对照和DMSO对自两名急性骨髓样白血病(AML)患者获得的原代细胞的影响。细胞总数显示在Y轴上，而多个时间点(第0天、第3天、和第4天)显示在X轴上。图2B是一对图，其描绘了TPO、化合物A(SB)、对照和DMSO对自两名急性淋巴样白血病(ALL)患者获得的原代细胞的影响。细胞总数显示在Y轴上，而多个时间点(第0天、第1天、第3天、和第5天)显示在X轴上。图2C是一对图，其描绘了TPO、化合物A(SB)、对照和DMSO对自两名慢性骨髓样白血病(CML)患者获得的原代细胞的影响。细胞总数显示在Y轴上，而多个时间点(第0天、第3天、和第6天)显示在X轴上。
图3(包含图3A至图3F)是一系列图，其描绘了对照、DMSO、2.8μM TPO、5μM化合物A(SB)、2.5μM化合物A(SB)、和1μM化合物(SB)对自AML患者获得的原代白血病细胞生长的影响。图3A的图描绘了1、2.5、和5μM化合物A(SB)和2.8μM TPO对自患者AML 857获得的原代白血病细胞的细胞生长的影响。图3B的图描绘了1、2.5、和5μM化合物A(SB)和2.8μM TPO对自患者AML 794获得的原代白血病细胞的细胞生长的影响。图3C的图描绘了1、2.5、和5μM化合物A(SB)和2.8μM TPO对自患者AML 342获得的原代白血病细胞的细胞生长的影响。图3D的图描绘了1、2.5、和5μM化合物A(SB)和2.8μMTPO对自患者AML 332获得的原代白血病细胞的细胞生长的影响。图3E的图描绘了1、2.5、和5μM化合物A(SB)及2.8μM TPO对自患者AML 774获得的原代白血病细胞的细胞生长的影响。图3F的图描绘了1、2.5、和5μM化合物A(SB)和2.8μM TPO对自患者AML 759获得的原代白血病细胞的细胞生长的影响。在所有实验中在第3天、第5天和第8天对细胞计数。
图4(包含图4A和图4B)是一系列图像，其描绘了对TPO信号传导中牵涉的激酶的磷酸化的Western印迹分析。图4A的图像描绘了Western印迹UT&-TPO细胞。图4B的图像描绘了人祖细胞CD34+的Western印迹。化合物A称为SB。
图5(包含图5A至图5F)是一系列图，其描绘了增殖测定法的结果。图5A的图描绘了对自AML患者857获得的原代白血病细胞实施的增殖测定法的结果。图5B的图描绘了对自AML患者794获得的原代白血病细胞实施的增殖测定法的结果。图5C的图描绘了对自AML患者342获得的原代白血病细胞实施的增殖测定法的结果。图5D的图描绘了对自AML患者332获得的原代白血病细胞实施的增殖测定法的结果。图5E的图描绘了对自AML患者774获得的原代白血病细胞实施的增殖测定法的结果。图5F的图描绘了对自AML患者759获得的原代白血病细胞实施的增殖测定法的结果。化合物A称为SB。
图6的图像描绘了对暴露于化合物A和rhTPO两者的N2C-TPO细胞中的ERK1/2、p70S6、S6和STAT5激酶磷酸化的Western印迹分析。化合物A称为SB。
图7的图像描绘了一幅热图(heat map)，其显示了在不同时间点时用TPO对化合物A刺激的N2C-TPO细胞中的所有所测试基因的表达差异。用化合物A刺激的细胞中的基因表达变化用较浅的颜色标示。
图8(包含图8A和图8B)是一系列图像，其描绘的热图描绘了响应TPO对化合物A刺激的基因调节。图8A的图像描绘了一幅热图，其显示了N2C-TPO细胞中的凋亡途径中所牵涉的受用TPO对化合物A刺激上调的基因。图8B的图像描绘了一幅热图，其显示了N2C-TPO细胞中的凋亡途径中所牵涉的受用TPO对化合物A刺激下调的基因。用化合物A刺激的细胞中的基因表达变化用较浅的颜色标示。
图9(包含图9A和图9B)是一系列图像，其描绘的热图显示了用TPO对化合物A刺激的N2C-TPO细胞中的转录因子调节。图9A的图像描绘了一幅热图，其显示了在用TPO对化合物A刺激的N2C-TPO细胞中上调的转录因子。图9B的图像描绘了一幅热图，其显示了在用TPO对化合物A刺激的N2C-TPO细胞中下调的转录因子。用化合物A刺激的细胞中的基因表达变化用较浅的颜色标示。
图10是一系列图像，其描绘了对自诊断为患有AML或ALL的人患者分离的原代细胞实施的凋亡测定法的结果。上组的三幅小图描绘了自AML患者774获得的数据，其中将分离的原代细胞暴露于对照(左侧小图)、rhTpo+DMSO(中间小图)或SB559457(右侧小图)，然后测定凋亡。下组的三幅小图描绘了自ALL患者710获得的数据，其中将原代细胞暴露于对照(左侧小图)、rhTpo+DMSO(中间小图)或SB559457(右侧小图)，然后测定凋亡。轴指示碘化丙啶(PI；y轴)或膜联蛋白V(x轴)染色的细胞数目。
图11是一系列图形，其描绘了在用rhTpo(2.86μM)或SB559457(5μM)刺激6小时的原代AML细胞中对GAPDH(顶部小图)和Redd1(底部小图)mRNA水平的定量RT-PCR分析的比较。
图12是一系列图像，其描绘了在暴露于rhTpo或SB559457达1、3、或5小时后在原代AML细胞的三种不同样品(AML 774、AML 794、和AML 971)中对p70S和S6激酶磷酸化的Western印迹分析的结果。对照＝未刺激的细胞；TPO＝用2.866μM rhTpo+0.05％DMSO刺激的细胞；SB＝用μM SB559457刺激的细胞。
发明详述
本发明提供了通过对患有AML的个体施用血小板生成素受体激动剂(TpoRA)、其衍生物、或变体来抑制人骨髓样白血病细胞生长和增殖的方法。在一个实施方案中，对患有AML的个体施用TpoRA、其衍生物、或变体。在本发明的另一个实施方案中，对患有AML的个体施用TpoRA、其衍生物、或变体作为化学治疗方案的一部分。
定义：
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的一般理解具有相同的含义。虽然可以在测试本发明的实践中使用与本文中所描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是本文中描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，会使用下列术语。
还应当理解的是，本文中所使用的术语仅仅出于描述特定实施方案的目的，而并不意图是限制性的。
冠词“一个/种”在本文中用于指一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)的冠词语法对象。举例而言，“一个/种元件”指一个/种或超过一个/种元件。
如本文中所使用的，“氨基酸”想要包括天然的和合成的氨基酸两者，及D和L氨基酸两者。“标准的氨基酸”指天然存在的肽中通常找到的20种L-氨基酸之任一种。“非标准的氨基酸残基”指标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论它是以合成方式制备还是衍生自天然来源。如本文中所使用的，“合成的氨基酸”还涵盖经过化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)、和取代。可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用能改变肽的循环半衰期而没有不利地影响肽活性的其它化学基团的取代来修饰肽内含有的，和特别是在羧基端或氨基端的氨基酸。另外，肽中可以存在或没有二硫化物连接。
如本文中所使用的，“约”在提及可测量值诸如量、持续时间等时想要涵盖自规定值起±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，且还更优选±0.1％的差异，因为此类差异对于实施所公开的方法是合适。
术语“激动剂”和“激动性”在本文中使用时指或描述能够直接或间接地实质性诱导、促进或增强生物学活性或受体活化的分子。
如本文中所使用的，术语“化学疗法”指如下的治疗过程，其中对诊断为患有癌症的个体施用化疗剂。化疗剂包括能有利地对患有癌症的个体施用以治疗所述癌症的药剂诸如药物。化疗剂常常包含诱导细胞(例如肿瘤细胞)凋亡的凋亡诱导剂。细胞(包括癌细胞)能被诱导来经历程序性细胞死亡(也称为凋亡)。凋亡的特征在于将细胞选择性程序性破坏成相对较小的碎片，其中DNA变得高度片段化(即所得的片段通常具有不超过约200个碱基)。凋亡期间发生细胞皱缩和核小体间DNA切割，这导致DNA的片段化。
术语“衍生物”用于定义自另一种化合物衍生的化合物，具体的是，包含本发明的化合物A的任何修饰且保留如本发明中所描述的化合物A的生物活性的化合物。
如本文中所使用的，术语“DNA”定义为脱氧核糖核酸。
“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，指有效实现特定生物学结果的化合物、配制剂、材料或组合物的量，如本文中所描述的。此类结果可以包括但不限于对病毒感染的抑制，如通过本领域中合适的任何手段所测定的。
“分离的”指自天然状态改变的或取出的。例如，活的动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然的环境诸如例如宿主细胞中。
如本文中所使用的，短语“白血球减少症”指哺乳动物中的血液白细胞(白血球)浓度低于正常水平的减少。
如本文中所使用的，短语“突变”指基因中的变化，其源自于对代表基因的一段DNA的一部分的改变。
“生殖细胞突变”存在于卵或精子中，而且能从亲本传递至后代。
“体细胞突变”在特定的组织细胞中发生，而且能导致特定的组织细胞生长成肿瘤。大多数癌症在体细胞突变后开始。在白血病、淋巴瘤或骨髓瘤中，原始骨髓或淋巴结细胞经历体细胞突变，导致肿瘤形成。在这些病例中，肿瘤在进行检测时通常是广泛分布的；它们通常牵涉多块骨的骨髓或者牵涉数个部位中的淋巴结。
如本文中所使用的，短语“癌基因”指作为癌症原因的突变基因。急性骨髓性白血病的数种亚型、急性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、和几乎所有慢性骨髓性白血病病例具有一致的突变基因(癌基因)。
如本文中所使用的，术语“肽”、“多肽”、和“蛋白质”可互换使用，指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且没有对能构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目设置限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文中所使用的，该术语指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)和较长链(其在本领域中一般称为蛋白质，蛋白质有许多类型)两者。“多肽”包括例如有生物学活性的片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或其组合。
“药学可接受的”指对于患者而言从药理学/毒理学观点看而对于制备药物化学家而言从物理/化学观点看在组成、配方、稳定性、患者接受和生物利用度方面可接受的那些特性和/或物质。“药学可接受载体”指不妨碍活性成分的生物学活性效力而且对其被施用的宿主没有毒性的介质。
如本文中所使用的，短语“聚合酶链式反应(PCR)”指用于扩增痕量的DNA或RNA从而能研究或测定特定类型的DNA或RNA的技术。此技术在检测浓度很低的残留白血病或淋巴瘤细胞(少得使用显微镜看不到)中变得有用。该技术可以在50万至100万非白血病细胞中检测出一个白血病细胞的存在。为了鉴定残留异常细胞的用途，PCR要求白血病或淋巴瘤细胞中有特定的DNA(或RNA)异常或标志物(如癌基因)。
如本文中所使用的，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。如此，如本文中所使用的，核酸和多核苷酸可互换使用。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸(其能被水解成单体“核苷酸”)的一般知识。单体核苷酸能被水解成核苷。如本文中所使用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域中可用的任何手段(包括但不限于重组手段)获得的所有核酸序列。
如本文中所使用的，短语“顽固性/不应性(疾病)”指在用针对疾病的标准疗法进行初始治疗后没有进入消退中或者没有实质性改善的疾病。
如本文中所使用的，短语“复发(再现)”指疾病在进行治疗后已经消退后的恢复。
如本文中所使用的，短语“消退”指通常由于治疗引起的疾病迹象的消失。使用术语“完全”或“部分”来修饰术语“消退”。完全消退意味着疾病的所有迹象都消失了。部分消退意味着治疗显著改善疾病，但是存在疾病的残留迹象。长期益处通常要求完全消退，尤其是在急性白血病或进行性淋巴瘤中。
如本文中所使用的，短语“对治疗有抗性”指细胞尽管其暴露于通常杀死细胞或抑制其生长的化学物，但是仍活着并分裂的能力。顽固性白血病是如下的情况，其中部分恶性细胞对一种或多种药物的损害效果有抗性。细胞具有数种形成药物抗性的方式。
如本文中所使用的，术语“治疗性”指治疗和/或预防。通过抑制、消退、或根除与肝病有关的疾病状态来获得治疗效果。
如本文中所使用的，短语“血小板减少”指哺乳动物中的血液血小板浓度低于正常的减少。
如本发明的语境内所使用的，术语“治疗/处理”想要包括针对疾病或病症的治疗性处理及预防性、或抑制性措施。如此，例如，术语治疗包括在疾病或病症发作之前或之后施用药剂，由此预防或消除疾病或病症的所有体征。又例如，在疾病的临床表现后为了抗击疾病症状而进行的药剂施用构成“治疗”疾病。
“变体”在该术语在本文中使用时指在序列上分别与参照核酸序列或肽序列不同，但是保留参照分子的本质特性的核酸序列或肽序列。核酸变体的序列变化可以不改变由参照核酸编码的肽的氨基酸序列，或者可以导致氨基酸替代、添加、删除、融合和截短。肽变体的序列变化通常是有限的或保守的，从而参照肽和变体的序列总体上极其相似，而且在许多区域中是相同的。变体和参照肽可以在氨基酸序列上相差任意组合的一处或多处替代、添加、删除。核酸或肽的变体可以是天然存在的，诸如等位变体，或者可以是不知道天然存在的变体。可以通过诱变技术或者通过直接合成来生成核酸和肽的非天然存在变体。术语变体还可以指对分子进行的不改变其功能的修饰。
描述：
本发明提供了使用血小板生成素受体激动剂来抑制人骨髓样白血病细胞生长和增殖的方法。本发明的方法可用于治疗细胞增殖性和/或分化性病症，特别是那些涉及急性骨髓样白血病的。
本发明中的血小板生成素受体激动剂
本发明包括血小板生成素受体激动剂(TpoRA)用于抑制AML细胞生长和增殖的用途。术语“血小板生成素受体激动剂”或“TPO受体激动剂”(TpoRA)在本文中可互换使用，包括拥有结合血小板生成素受体即mpl的特性，而且具有mpl激动剂的生物学特性的任何药用化合物、小分子、肽或核酸。在本发明中，TPO受体激动剂的生物学特性是对AML细胞生长和增殖的抑制。
在本发明方法中有用的一种优选TpoRA是3’-{N’-[1-(3，4-二甲基苯基)-3-甲基-5-氧-1，5-二氢吡唑-4-亚基]肼}-5’-氟-2’-羟基联苯-3-羧酸(3’-{N’-[1-(3，4-dimethylphenyl)-3-methyl-5-oxo-1，5-dihydropyrazol-4-ylidene]hydrazine}-5’-fluoro-2’-hydroxybiphenyl-3-carboxylic acid)，下文称为化合物A。化合物A是在国际申请No.PCT/US01/16863(国际公开No.WO 01/89457；美国公开No.US2004/0019190A1)(在此通过提及而收录其公开内容)中公开(如实施例13)和要求保护的，作为TPO受体激动剂有用的(特别在增强血小板生成方面和特别在治疗血小板减少方面)化合物，连同其药学可接受盐、水合物、溶剂化物和酯，且其结构如下：
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治疗方法
在本发明方法的一个实施方案中，对诊断为患有AML的个体施用TpoRA、其衍生物或变体。在本发明的一方面，对患有AML的个体施用TpoRA、其衍生物、或变体作为化学治疗方案的一部分以提升化疗剂的功效。
在本发明方法的另一个实施方案中，对诊断为患有骨髓增生异常综合征的个体施用TpoRA、其衍生物或变体。在本发明的一方面，对患有骨髓增生异常综合征的个体施用TpoRA、其衍生物、或变体作为化学治疗方案的一部分以提升化疗剂的功效。
“提升化疗剂的功效”指施用TpoRA、其衍生物、或变体会引起有益的临床结果，包括但不限于延长个体的存活、减少/减轻个体中AML或骨髓增生异常综合征的临床体征、或者通过容许化疗剂剂量和/或施用化疗剂频率的降低，由此降低与化疗剂毒性有关的不想要的副作用，并使化学治疗方案更可耐受。可以在施用化疗剂之前、施用化疗剂期间或者施用化疗剂之后、或者其一些组合(认为这样对于治疗个体是有效的)，对个体施用TpoRA、其衍生物或变体。建立作为化学治疗方案的一部分施用TpoRA、其衍生物或变体的最佳日程表完全在本领域技术范围内。
在本发明的另一方面，在施用化学疗法前对个体施用TpoRA、其衍生物、或变体。不希望限于任何理论，本领域技术人员应当领会的是，在开始化学疗法前对个体施用TpoRA会靶向对化学疗法有抗性的白血病细胞，而且会提升化疗剂的功效。另外，表达TPO受体的所有白血病细胞都是TpoRA、其衍生物或变体的靶物。对于本领域技术人员会显而易见的是，在开始化学疗法前对个体提供TpoRA、其衍生物或变体会使白血病细胞对化疗剂更易感，由此使治疗更有效。
在本发明的又一方面，在个体已经完成化学疗法疗程后对个体施用TpoRA、其衍生物、或变体。不希望限于任何理论，本领域技术人员应当领会的是，残留的、未检测出的循环白血病细胞增加AML患者在完成化学疗法后的复发风险。对已经完成化学疗法疗程的个体施用TpoRA、其衍生物、或变体靶向残留的白血病细胞(此时它们仍是没有活性的)，并降低疾病复发的风险。
在本发明的又一方面，对个体施用TpoRA、其衍生物、或变体代替化学疗法作为治疗AML的唯一方法。本领域技术人员应当领会的是，在众多诊断为患有AML的个体中，白血病细胞对化学疗法是不应的。用TpoRA、其衍生物、或变体治疗这些个体是绕过容许白血病细胞躲避化疗剂的机制的备选疗法。
在本发明的又一方面，对个体施用TpoRA、其衍生物、或变体代替化学疗法作为治疗AML的唯一方法。
本发明的组合物和方法可以与其它治疗方案联合使用，包括抑制病毒生长剂和病毒毒剂(virostatic and virotoxic agent)、抗生剂、抗真菌剂、抗炎剂、疼痛减轻疗法、以及联合疗法等。
本发明还可以与其它治疗形态(诸如化学疗法、冷冻疗法、高热疗法(hyperthermia)、放射疗法等)联合使用。
疗法和药物制剂
可以使用本领域中已知的任何合适的路径(包括例如静脉内治疗方案)来对个体施用TpoRA、其衍生物、或变体。施用可以是通过快速、直接注射或者在一段时间里如通过缓慢输注。也可以使用缓慢释放配制剂。此外，可以将TpoRA、其衍生物、或变体稳定地连接至聚合物诸如聚乙二醇以赋予TpoRA以想要的特性诸如溶解度、稳定性、延长的半衰期和其它药学有利特性(参见例如Burnham，1994，AM.J.Hosp.Pharm.51：210-8)。
也可以将磷酸酶抑制剂和活化剂，及激酶抑制剂和活化剂与TpoRA连接或偶联以赋予TpoRA以想要的特性诸如溶解度、稳定性、延长的半衰期和其它药学有利特性。
本发明涵盖药物组合物用于实施本发明方法的用途，所述组合物包含合适的治疗性化合物和药学可接受载体。
如本文中所使用的，术语“药学可接受载体”指如下的化学成分，其可以与治疗性化合物组合，而且其在组合后可以用于对哺乳动物施用合适的治疗性化合物。
可以施用对于实施本发明有用的药物组合物来投递1ng/kg/天和100mg/kg/天之间的剂量。所施用的精确剂量会随任何数目的因素而变化，包括但不限于动物类型和所治疗疾病状态类型、动物年龄和施用路径。建立最大限度临床益处所需要的TpoRA、其衍生物或变体的最佳剂量完全在本领域技术范围内。
可以在静脉内配制剂中系统地施用在本发明方法中有用的药物组合物。在合适的治疗性化合物外，此类药物组合物可以含有药学可接受载体和其它已知增强和促进药物施用的成分。
本发明涵盖包含本文中所公开的对于治疗AML有用的化合物(作为活性成分)的药物组合物的制备和用途。此类药物组合物可以由单独的活性成分(处于适合于对受试者施用的形式)组成，或者药物组合物可以包含活性成分和一种或多种药学可接受载体、一种或多种别的成分、或者这些的一些组合。活性成分可以以生理学可接受酯或盐的形式存在于药物组合物中，诸如与生理学可接受阳离子或阴离子组合，正如本领域中公知的。
如本文中所使用的，术语“生理学可接受的”酯或盐指活性成分的如下酯或盐形式，其与药物组合物的任何其它成分相容且对要接受组合物施用的受试者无害。
可以通过药理学领域中已知的或今后开发的任何方法来制备本文中所描述的药物组合物的配制剂。一般而言，此类制备方法包括以下步骤，即使活性成分与载体或者一种或多种其它辅助性成分联合，然后若必要或想要的话，将产品定形或包装成想要的单剂或多剂单元。
可以在适合于胃肠外、静脉内或另一种施用路径的配制剂中制备、包装、或出售在本发明方法中有用的药物组合物。
可以散装地、作为单一单位剂量、或者作为多个单一单位剂量制备、包装、或出售本发明的药物组合物。如本文中所使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于会对受试者施用的活性成分的剂量或者此类剂量的便利分数，诸如例如此类剂量的1/2或1/3。
本发明的药物组合物中的活性成分、药学可接受载体、和任何别的成分的相对量会随所治疗受试者的身份、体型、和状况而且进一步随组合物要施用的路径而变化。举例而言，组合物可以包含0.1％和100％(w/w)之间的活性成分。
在活性成分外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种别的药学活性剂。
可以使用常规技术来生成本发明药物组合物的受控或持续释放配制剂。
如本文中所使用的，药物组合物的“胃肠外施用”包括以物理突破受试者的组织和经由组织中的突破来施用药物组合物为特征的任何施用路径。如此，胃肠外施用包括但不限于通过注射组合物、通过经由手术切口应用组合物、通过经由组织穿透非手术伤口应用组合物等来施用药物组合物。具体地，所涵盖的胃肠外施用包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内注射、和肾透析输注技术。
适合于胃肠外施用的药物组合物的配制剂包含与药学可接受载体诸如无菌水或无菌等张盐水组合的活性成分。可以以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装、或出售此类配制剂。可以以单位剂量形式诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装、或出售可注射配制剂。供胃肠外施用的配制剂包括但不限于悬液、溶液、油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂、和可植入的持续释放或生物可降解的配制剂。此类配制剂还可以包含一种或多种别的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂、或分散剂。在供胃肠外施用的配制剂的一个实施方案中，以干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分，用于用适合的媒介物(例如无菌无热原水)重建，之后胃肠外施用重建的组合物。
可以以无菌的、可注射的、水性或油性悬液或溶液形式制备、包装、或出售药物组合物。可以依照已知技术配制此悬液或溶液，并且在活性成分外可以包含本文中所描述的别的成分诸如分散剂、润湿剂、或悬浮剂。可以使用无毒胃肠外可接受稀释剂或溶剂诸如例如水或1，3-丁二醇制备此类无菌可注射配制剂。其它可接受稀释剂和溶剂包括但不限于Ringer氏溶液、等张氯化钠溶液、和不挥发性油诸如合成的甘油单酯或甘油二酯。其它有用的胃肠外可施用的配制剂包括那些包含处于微晶形式、在脂质体制备物中、或者作为生物可降解聚合物系统成分的活性成分的。供持续释放或植入用的组合物可以包含药学可接受聚合或疏水材料诸如乳剂、离子交换树脂、略溶性聚合物、或略溶性盐。
可以以每天数次的频率对个体施用化合物，或者它可以以更低的频率施用，诸如一天一次、一周一次、每两周一次、每月一次，或者甚至更低的频率，诸如每数月一次或者甚至一年一次或更少。剂量频率对于熟练技术人员会是容易显而易见的，而且会取决于任何数目的因素，诸如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、个体的类型和年龄等。
实验实施例
通过参阅以下实验实施例来详细地进一步描述本发明。这些实施例仅出于例示目的而提供，并不意图是限制性的，除非另有规定。如此，本发明决不应当解释为受限于以下实施例，而是应当解释为涵盖由于本文中所提供的教导而变得明显的任何和所有变型。
现在描述本文中所公开的实验中所采用的材料和方法。
化合物
化合物A获自Glaxo SmithKline Pharmaceuticals(Collegeville，PA)。将化合物溶解于100％DMSO中以制备10mM储液，然后在IMDM(Iscoves改良的Dulbecco氏培养基，Invitrogen；Carlsbad，CA)中稀释以获得1mM工作溶液。全长重组人血小板生成素(rhTPO)获自R&D Systems(Minneapolis，MN)，并溶解于IMDM培养基中至终浓度5ng/ml。
细胞培养
N2C-TPO细胞是通过在rhTpo中培养原巨核细胞系10周衍生的，并由Glaxo SmithKline Pharmaceuticals(Collegeville，PA)提供。将N2C-TPO细胞在补充有10％动物血清复合物-Fetalplex(Gemini Bio-Products，WestSacramento，CA)、0.5％青霉素/链霉素(Invitrogen；Carlsbad，CA)和20ng/mlrhTPO的RPMI(Invitrogen，Carlsbad，CA)培养基中培养。
将Mo7e细胞在补充有10％Fetalplex、0.5％青霉素/链霉素、和GM-CSF10ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN)的DMEM(Dulbecco氏改良的Eagle培养基；Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养。在每项实验前使来自这两种细胞系的细胞饥饿24小时。
人原代白血病细胞获自宾夕法尼亚大学干细胞和白血病中心。将细胞在EGM-2(内皮细胞培养基-2，Cambrex；East Rutherford，NJ)中培养。将所有细胞在增湿的培养箱中于37℃和5％CO2培养。
巨核细胞集落形成测定法
以每ml 5000个CD34+细胞的密度将正常的人祖细胞在血纤蛋白原凝块中铺板。如下制备血纤蛋白原凝块：将细胞在补充有碳酸氢钠(3mg/ml)；3-巯基-1-2丙二醇(0.002％)；运铁蛋白(300μg/ml)；CaCl2(37μg/ml)；无脂肪酸的、去离子BSA(10％)；胰岛素(20μg/ml)；胆固醇(5.6μg/ml)、细胞因子：IL-3(10ng/ml)、SCF(10ng/ml)和rhTPO(100ng/ml，等于2.8μM)或化合物A(5μM)的IMDM培养基中重悬。然后凝结混合物含有血纤蛋白原(0.2％)和凝血酶(0.2u/ml)。将细胞在35mm培养皿上铺板，并在增湿的培养箱中于37℃和5％CO2培养。10天后，固定集落，并用经荧光标记的抗体对巨核细胞标志物CD41a染色。使用倒置荧光显微镜对巨核细胞集落计数。
对激酶磷酸化的Western印迹分析
在PBS中清洗对照和用rhTPO或化合物A刺激的细胞两次，然后沉淀。将沉淀物溶解于由50mM TRIS、150mM NaCl、0.02％叠氮化钠、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)和1％Igepal(Sigma，St.Louis，MO)构成的三重溶胞缓冲液中，然后在冰上温育30分钟，期间每10分钟进行涡旋振荡。然后以最大速度在微量离心机中于4℃将溶胞物旋转10分钟。使用所提取的细胞上清液进行Western印迹分析。
通过Bradford蛋白质测定法(Bio-Rad，Hercules，CA)测定蛋白质浓度。将总共150μg蛋白质提取物在10％聚丙烯酰胺凝胶上解析(150V，60分钟)，然后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(25V，60分钟)。使用炼乳(5％)作为封闭溶液。将膜于4℃与1∶1000稀释的一抗一起温育过夜。温育后，在TBS-T缓冲液中清洗膜三次，并用1∶1000稀释的偶联有HRP的二抗(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)于室温探查2小时。所有抗体均购自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。
微阵列分析
用2.8uM TPO或5uM化合物A刺激N2C-TPO细胞(每1ml补充有10％FBS的RPMI培养基1x106个细胞)30分钟、1小时和3小时。然后在PBS中清洗细胞两次，并用于使用Qiagen的RNaesy试剂盒(Valencia，CA)分离RNA。一式三份完成每种条件。将RNA提交给Penn微阵列室(宾夕法尼亚大学；Philadelphia，PA)。使用Affymetrix基因芯片U133A第2版来实施分析。在Penn生物信息学中心(宾夕法尼亚大学；Philadelphia，PA)使用GCRMA算法和Array Assistlite3.4程序来实施统计学数据分析。使用Spotfire软件来完成基因序型的显现。
实验实施例1：与重组人TPO比较的化合物A分子的细胞培养评估
为了确定化合物A是否具有发挥血小板生成素受体(TpoR)激动剂的功能及刺激人巨核细胞增殖和分化的能力，使用Tpo依赖性细胞系(N2C-TPO)及正常的人CD34+细胞来实施许多细胞培养实验。发现化合物A刺激TPO依赖性细胞系N2C-TPO增殖的能力展现出在1和10uM之间的剂量依赖性细胞增殖提升，其中最大效果在5-10μM。因此，在直接比较rhTPO对化合物A的特性的进一步实验中使用5μM剂量。
使用正常的人祖细胞(CD34+)来评估化合物A刺激巨核细胞增殖和分化的能力。将CD34+细胞在血纤蛋白凝块中铺板，并培养10天，此时间后固定集落，并用对巨核细胞标志物CD41特异性的抗体染色。自用化合物A刺激的细胞获得的巨核细胞集落的数目在与来自用rhTPO刺激的细胞的巨核细胞集落的数目相比时略微较低，然而集落的大小或形状没有差异(图1)。这些结果还得到人祖细胞液体培养确认。将CD34+细胞在细胞因子及rhTPO或化合物A中温育7-10天的一段时间，此时间后对培养中的细胞检查多倍体化程度和巨核细胞谱系标志物CD41和CD61的表达。与rhTPO中的8％相比，在化合物A中培养的细胞中14％显示大于4N的DNA含量。这些相同细胞在35％的细胞上表达巨核细胞标志物CD41和CD61，这与rhTPO的结果相当。
实验实施例2：化合物A对原代白血病细胞的差别影响
样品获自18名患有急性骨髓性白血病(AML)的患者、7名患有急性淋巴细胞性白血病(ALL)的患者和3名患有慢性骨髓性白血病(CML)的患者。在18份所测试AML样品的17份中，化合物A在与未处理对照或与rhTPO一起培养的细胞相比时抑制细胞增殖70-90％(图2A)。在来自ALL和CML患者样品的原代细胞中没有观察到化合物A的显著影响(图2B和图2C)。
进一步检查化合物A的多种剂量(1μM、2.5μM和5μM)对AML样品的影响。对6份不同样品实施此实验。在3份样品中，1和2.5μM剂量的化合物A对细胞增殖具有影响。在样品857和332中，1和2.5μM剂量的化合物A对细胞增殖的抑制与用5μM剂量实现的抑制类似(图3)。在剩余的3份样品中，1μM和2.5μM剂量的化合物A对细胞增殖和存活没有影响。在这些情况中，仅5μM化合物A抑制白血病细胞生长和增殖。在ALL或CML患者样品中没有观察到对细胞生长或存活的显著影响。
实验实施例3：由rhTPO和化合物A刺激的信号传导途径的比较
为了了解化合物A触发AML细胞的细胞死亡的机制，比较由rhTPO和化合物A刺激的细胞内信号传导途径。对造血祖细胞(CD34+)及工程化改造成表达TpoR且其中细胞增殖受Tpo刺激控制的原巨核细胞细胞系，即N2C-TPO实施这些研究。
检查化合物A对已知在Tpo信号传导途径中重要的激酶的磷酸化的影响。所评估的激酶包括STAT5、ERK、p70S6、和核糖体激酶S6。用rhTPO刺激10或30分钟的N2C-TPO细胞显示上文所列所有激酶的高磷酸化水平。然而，在将细胞暴露于化合物A达10或30分钟时，那些激酶均没有受到活化(图4A)。对人祖细胞CD34+(其受化合物A刺激而分化成巨核细胞)实施相同的实验。与N2C-TPO细胞不同，CD34+细胞在暴露于rhTPO(2.8μM)或化合物A(5μM)后显示对ERK、p70S6和S6核糖体蛋白质磷酸化的活化。然而，只有暴露于rhTPO的细胞刺激STAT5(即一种在AML细胞中过磷酸化的激酶)的磷酸化(图4B)。
实验实施例4：rhTPO刺激能否阻断化合物A对AML细胞的影响
对自6名AML患者获得的细胞实施增殖测定法。在一些实验中，首先将细胞暴露于化合物A，然后在5分钟后用rhTPO刺激。为了避免所有受体均被化合物A占据，且因此阻止rhTPO结合的可能性，还如下实施其它实验，即首先用rhTPO刺激细胞，接着在5分钟后暴露于化合物A。在6份样品的4份(857，774，759，342)中，通过在用化合物A刺激后添加rhTPO或者通过首先用rhTPO刺激细胞，之后暴露于化合物A没有挽救AML细胞存活。然而，在样品794和332中，添加rhTPO确实削弱化合物A的效果(图5)。这些结果提示多种可能性：第一，化合物A可以比rhTPO具有强得多的对TpoR的亲和力；第二，KD rhTPO低得多，因此化合物A能自受体置换rhTPO；或者，第三，化合物A刺激触发AML细胞的细胞死亡的其它途径。
为了解决这些可能性，在评估TPO途径中牵涉的激酶的磷酸化时对N2C-TPO细胞实施类似的挽救实验。在两组实验(首先添加rhTPO，然后是化合物A，或者首先添加化合物A，然后是rhTPO)中，观察到对STAT5、ERKp70S6激酶和S6核糖体蛋白质(它们在用单独的化合物A刺激后没有被磷酸化)的磷酸化的挽救(图6)。这些数据提示，化合物A活化导致AML细胞死亡的另一条途径。
实验实施例5：对用TPO对化合物A刺激的细胞中基因表达差异的微阵列分析
为了进一步了解化合物A信号传导中牵涉的机制，使用Affymetrix基因芯片对用Tpo或化合物A刺激的细胞实施微阵列分析。在第一组实验中，探查N2C-TPO细胞系来为使用原代AML细胞进行的进一步分析建立最佳时间点。
用TPO(2.8μM)或化合物A(5μM)刺激细胞30分钟、1小时或3小时。然后自细胞分离RNA，并用于阵列实验。用Tpo对化合物A刺激后基因表达有显著性差异。如与由TPO刺激的样品相比化合物A样品中在刺激30分钟后，200种基因得到差别地表达，刺激1小时后，约400种基因得到差别地表达，而3小时后超过2000种基因得到上调或下调(图7)。
这些基因中，观察到凋亡途径中牵涉的多种基因(图8)及转录因子(图9)的表达差异。下调最大的基因(50-200倍倍数改变)包括早期生长因子应答基因1-4(其编码充当细胞外信号的细胞核效应物的蛋白质)家族、细胞因子信号传导阻抑物3、和大多数细胞的信号传导途径中牵涉的细胞因子诱导型含有SH2的蛋白质。
实验实施例6：来自人癌症患者的分离的原代细胞的凋亡测定法
膜联蛋白-V是对磷脂酰丝氨酸(PS)具有高亲和力的磷脂结合蛋白。膜联蛋白V不会结合正常的完整细胞，但是坏死细胞泄漏得足以容许膜联蛋白V接近内膜PS。碘化丙啶使DNA染色。因此该测定法鉴定正在经历凋亡的细胞。
自AML(患者774；顶排)或ALL(患者710；底排)患者分离原代细胞。然后将细胞暴露于对照溶液(左侧的一对小图)、rhTpo+DMSO(中间的一对小图)、或SB559457(右侧的一对小图)72小时。图10描绘了与对照细胞(顶部，左侧小图)和用Tpo+DMSO刺激的细胞(顶部，中间小图)相比暴露于SB55945达72小时的AML样品(顶部，右侧小图)中的膜联蛋白V和PI阳性细胞增加。在自ALL患者分离的原代细胞中观察不到细胞凋亡的显著增加。这提示SB559457在AML细胞中诱导凋亡。
实验实施例7：AML细胞中的差别信号传导的分子后果
对5份不同原代AML细胞样品(AML患者332、342、774、和794)实施Affymetrix基因芯片分析。用Tpo或SB559457刺激原代细胞6小时。在芯片(指明假发现率(false discovery rate)小于36％)上所代表的22,000种基因中的仅2种中找到表达的统计学显著性差异：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和DNA损害诱导型转录物4(也称为Redd1)。使用定量实时PCR(QRT-PCR)来确认这些结果。在原代AML样品中，用SB559457处理的细胞中的GAPDH表达比在用rhTpo处理相同时间(6小时)的细胞中的GAPDH表达高至少两倍。类似地，Redd1基因的表达在与SB559457一起温育的细胞中比在与rhTpo一起温育的对照细胞中高约3至4倍(图11)。
为了建立细胞信号传导与阵列数据之间的关联，检查原代白血病细胞中的Tpo信号传导途径中牵涉的激酶的磷酸化。在3份原代AML样品中在用SB559457(5μM)和Tpo(2,86μM)刺激1、3和5小时的细胞中比较核糖体S6和p70S6激酶的磷酸化。在这两种AML样品中，用SB559457刺激3小时的细胞显示p70S6激酶在Thr421/Ser424处和核糖体激酶S6的高度磷酸化，而在未刺激的对照细胞和用Tpo刺激的细胞中，没有检测出那些激酶的磷酸化或者检测出那些激酶的很少的磷酸化(图12)。
在此通过提及而将本文中所引用的每篇专利、专利申请、和出版物的公开内容完整收入本文。虽然已经关于具体的实施方案公开了本发明，但是显而易见的是，本领域其它技术人员能在不背离本发明的真实精神和范围的前提下设计本发明的其它实施方案和变型。所附权利要求书意图解释为包括所有此类实施方案和等同变型。