用于结合磷脂酰丝氨酸的环多胺 本发明涉及用于体外和体内显像细胞死亡的化合物， 以及在患者中检测肿瘤的发 展或消退的方法。 此外， 本发明还涉及包含这样的化合物的药物组合物、 适于获得所述化合 物的前体、 获得所述化合物的方法以及用于显像细胞死亡的药盒。
在本申请全文中引用了多种出版物和参考书。 这些出版物和参考书的公开内容整 体援引加入本申请中， 以更全面地描述本发明所属技术领域的现状。
引言
肿瘤的治疗控制是癌症患者随访中所关注的主要方面之一。 这一信息目前是通过 包括形态学变化、 症状反应 (symptomatic response) 和临床化学在内的一系列常规研究来 获得的。放射技术例如 X 射线、 计算机断层摄影 (CT)、 超声检查 (US) 以及磁共振 (MR) 是显 像肿块 (tumor mass) 的大小和形态并在某些程度上显像肿瘤灌注的变化的显像技术。
同时， 核医学具有一系列可任意使用的成功用于评价治疗反应的放射性药物。在 18 这些药物中， [ F]FDG 代表了充当用于显示例如细胞稳定药对肿瘤中的葡萄糖转运和己糖 激酶活性的影响的替代标记的主要药物。 预计示踪剂积累的减少表示治疗反应和更好的存 活。然而， 例如在放射疗法后早期的炎症反应可能使对该信号的解释复杂化。而且， 肿瘤反 应是通过负信号 ( 即示踪剂摄入的减少 ) 来显示的。这可能在示踪剂在治疗前适度积累的 情况下是有问题的。在这一方面， 提供正信号的示踪剂是更加令人期望的。 99m
几年前， 提出 Tc 标记的膜联蛋白 V 作为能够体内显像细胞死亡的新药物。已在 包括心肌梗塞、 Fas 抗体治疗的肝脏和施用细胞稳定药物后的肿瘤在内的数种模型系统中 显像凋亡 (1， 2)。基于用膜联蛋白 V- 荧光染料结合物得到的结果的 99mTc 标记的膜联蛋白 V 作为凋亡的体内显像指示剂的用途用于在显微镜下显示凋亡细胞 (3)。
膜联蛋白 V 最初分离自人类胎盘 (4)， 其通过抑制 ( 除其它因素外 ) 凝血酶原酶的 活性表现出抗凝效应。这一效应归因于来自磷脂膜的凝血因子的置换 (5)。
膜联蛋白为在钙的存在下与磷脂结合的普遍存在的同源蛋白。膜联蛋白 V 以前 也被称作胎盘抗凝蛋白 (PAP) 或血管抗凝蛋白 (VAC-α)(5)， 其在细胞凋亡发生后的早期 2+ 与 Ca 在存在于细胞膜上的外翻 (externalized) 的磷脂酰丝氨酸 (PS) 上结合在一起。在 正常条件下， 磷脂酰丝氨酸约 100％存在于双分子层细胞膜的内小叶， 在那里充当例如参 与跨膜信号转导和内摄过程的膜联蛋白 I 的锚 (anchor)(6)。由于在内源性或外源性刺激 后诱导的效应半胱天冬酶 3、 6 和 7 的活化， 发生了蛋白质的蛋白水解失活， 其在正常条件 下维持脂类在细胞膜中的不对称分布。几种类型的转位酶属于这些蛋白质， 包括广泛存在 2+ 的选择性催化磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺向内运输的 Mg -ATP 依赖性氨基磷脂翻转酶 (flippase)、 几乎不具有首基 (headgroup) 特异性的将磷脂向外运输的 ATP 依赖性翻转酶 (floppase) 以及破坏双分子层不对称性的 Ca2+ 依赖性拼接酶 (scramblase)(7)。由需要能 量的凋亡过程引起的 ATP 消耗也可能阻碍不对称脂分布的维持。
膜联蛋白 V 对暴露磷脂酰丝氨酸的细胞的高亲和性 ( 表现出 Kd ＜ 10-10mol/l)(8) 是体内检测凋亡的基础。膜联蛋白 V- 磷脂酰丝氨酸的这一强烈相互作用的结构基础正被 逐渐阐明。
从 X- 射线结构分析已知此类结合通过在被称作 AB、 AB′和 DE 的 Ca2+- 结合位点 的协作下的 Ca2+ 与羧基 - 磷脂首基的共络合 (co-complexation) 发挥作用。这些结合位点 位于膜联蛋白 V 的四个连续重复区段的每一个中。
图 1 显示了这些区段之一 ( 结构域 III) 与甘油磷酸丝氨酸 ( 截短的磷脂酰丝氨 酸 ) 在 Ca2+- 膜联蛋白 V 结合位点上的相互作用 (9)。一级 AB 和次级 AB′ Ca2+ 位点位于各 结构域的 A 螺旋和 B 螺旋之间的环内。它们也被分别称作 II 型和 III 型 Ca2+ 结合位点。
应当注意， 这三个络合位点 AB、 AB′和 DE 表示具有不同稳定性 ( 即 AB ＞ AB’ ＞ DE) 的差异配位 (differently coordinated) 的钙阳离子。第二个络合物实体磷脂酰丝氨 酸在 AB′位点通过丝氨酸的羧基功能以及在 AB 位点通过带负电荷的磷酸氧 (phosphate oxygen) 与 Ca2+ 配位。此外， 丝氨酸的 α- 氨基在这一结构域中与苏氨酸 (THr)187 相互作 用。
然而， 膜联蛋白 V 与磷脂酰丝氨酸通过共同使用的 Ca2+ 的相互作用不仅引起这 一强结合亲和性。必须考虑多价结合， 因为 Ca2+ 形成稳定常数 logK1 仅在 4-5 范围内的 肽络合物。与磷脂酰丝氨酸结合， 这一数值可能由于磷脂酰丝氨酸对 Ca2+ 的双齿合度 (bidenticity) 而在某种程度上得以增加。然而， 为了满足上文提及的小解离常数， 必须有 2+ 两个或更多个结构域参与到膜联蛋白 V/Ca / 磷脂酰丝氨酸首基的相互作用中。这些考虑 假设存在足够浓度的 Ca2+。 通过在以低膜占用 (membrane occupancy) 结合的膜联蛋白 V 的 2+ 存在下进行滴定验证了 Ca 依赖性， 显示这一相互作用就 Ca2+ 而言的强协同性 (10)。理论 上至多 12 个 Ca2+ 离子可通过各结构域中的三个结合位点 (AB、 AB′和 DE) 络合。已在大鼠 2+ 膜联蛋白 V 晶体结构中定位了多达 10 个 Ca 离子， 所述膜联蛋白 V 晶体结构均结合在蛋白 质的向膜 (membrane-facing) 表面 (9)。
除了膜联蛋白 V/ 磷脂酰丝氨酸系统， 已检测了用于显像由凋亡而非坏死引起的 细胞死亡的其它方法。 有可能用于体内凋亡检测的凋亡途径中的替代靶点为活化的半胱天 冬酶 (11-13)。本文中检测的两个系统是基于不可逆抑制剂或底物与活化的执行半胱天冬 酶 (executioner caspase) 的结合。最近总结了迄今为止所获得的结果 (14， 15)。
如前文所提及的， 通常用荧光染料标记膜联蛋白 V 用于体外测定 (3)。 尽管标记蛋 白被广泛地用于分子生物学， 但是它昂贵且不太稳定。 因此， 它不方便用于药物研发中的高 通量筛选测定。
此外， 完全结合需要约 2.5mmol/l 的胞外 Ca2+。这可以导致假阳性结果， 因为大多 2+ 数动物细胞具有可将磷脂酰丝氨酸转移到细胞表面的 Ca 依赖性拼接酶 (16)。此外， 完全 的膜联蛋白结合需要多达 1 个小时的孵育， 这对于动力学测定是有问题的 (17， 18)。
简言之， 染料标记的膜联蛋白 V 是有用的凋亡传感器 (apoptosis sensor)， 但是 2+ 其具有许多局限性， 所以需要廉价、 稳定、 低分子量、 快速结合、 膜渗透的以及 Ca 依赖性的 替代试剂。因此， 本发明的根本问题是提供作为磷脂酰丝氨酸结合剂的具有改进特性的分 子， 特别是提供作为凋亡传感器与膜联蛋白 V 相比显示改进特性的分子。
更概括而言， 本发明的目的是提供能够体内和体外检测细胞死亡的改进的分子。 所述改进的分子是与由凋亡或坏死引起的濒死细胞或死亡细胞特异性结合的标记。
最 近 的 开 发 之 一 引 入 图 2 所 示 的 锌 双 -(2， 2- 二 吡 啶 甲 基 胺 )(zincbis-(2， 2+ 2-dipicolylamine))(Zn 双 -DPA) 配位络合物， 其被设计用来模拟膜联蛋白 V 的凋亡传感功能 (19， 20)。根据图 1， 一个磷脂酰丝氨酸首基与两个桥联 Ca2+ 离子配位， 所述桥联 Ca2+ 离子又与蛋白质表面的四个标准 (canonical) 结合位点之一配位 (9)。 发明内容 同为了提供可置换的磷脂酰丝氨酸结合位点， 与 Zn 配位的杂原子之一必须是水 的预期相反， 发明人使用具有至少一个用于二价或三价金属离子的络合的环多胺 (cyclic polyamine) 单元的化合物， 特别是四氮杂环十二烷 (cyclen)(12[ 烷 ]N4) 或四氮杂环十四 烷 (cyclam)(14[ 烷 ]N4) 来代替 DPA。优选地， 所述四氮杂环十二烷为环状亚乙基桥联的四 胺， 而所述四氮杂环十四烷为混合的亚乙基 - 亚丙基桥联的四胺， 二者均具有用于 Zn2+ 络合 的四个氮原子。 相对于 DPA 的稳定常数 105(mol/l)-1， 此类化合物的稳定常数为约 1015(mol/ l)-1( 四氮杂环十四烷 )。
因此， 在本发明的第一方面， 通过包含或含有至少一个环多胺单元 (C) 的化合物 或络合物解决所述根本问题。这一环多胺单元 (C) 使得作为络合物的中心离子的多价 ( 特 别是二价和 / 或三价 ) 金属离子的结合或络合成为可能。
在 本 发 明 的 一 方 面， 本 发 明 的 范 围 不 包 括 AMD3100(1， 1 ′ -[1， 4- 亚 苯 基 双 ( 亚 甲 基 )] 双 [1， 4， 8， 11- 四 氮 杂 环 十 四 烷 ]- 八 氢 溴 化 物 - 二 水 合 物 ((1， 1 ′ -[1， 4-Phenylenebis(methylen)]bis[1， 4， 8， 11-tetraazacyclotetradecan]-octohydrobr omid-dihy-drate))) 及其衍生物 ( 即取代的 AMD3100)， 其为具有环多胺单元的化合物。 AMD3100 被设计为通过抑制病毒经 CD4/CXCR4 受体组装 (receptor assembly) 进入以治疗 HIV 感染。然而， AMD3100 用于结合磷脂酰丝氨酸和用于凋亡显像的用途属于本发明的范
围。本发明不包括 1， 1’ -[1， 3- 亚苯基双 -( 亚甲基 )]- 双 - 三 ( 对甲苯磺酰基 )-1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷， 因为它涉及抗 HIV 的活性成分， 即下文公开的化合物。
第一种实施方案的第一方面涉及化合物或络合物及其药用盐、 非对映异构体和对 映异构体， 其特征在于所述化合物或络合物包含 ：
至少一个用于二价或三价金属离子的络合或用于络合二价或三价金属离子的环 多胺单元 (C)。
任选地， 本发明的化合物或络合物还包含 ：
至少一个标记 (Tag)(T) 或连接基 (L)- 标记 (T)， 和/或
至少一个桥联单元 (B) 或键。
优选地， 所述化合物或络合物包含 ：
至少一个用于二价或三价金属离子的络合或用于络合二价或三价金属离子的环 多胺单元 (C)，
至少一个标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)， 以及
至少一个桥联单元 (B) 或键。
优选地， 所述二价或三价金属离子为非放射性二价或三价金属离子。
优选地， 所述化合物或络合物包含 ：
至少一个用于二价或三价金属离子的络合或用于络合二价或三价金属离子的环 多胺单元 (C)， 以及
至少一个标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)。
当所述多价金属离子为二价金属离子时， 该二价金属离子选自 Zn2+、 Ca2+、 Cu2+、 Be2+、 Mg2+、 Sr2+、 Ba2+、 Cd2+、 Cr2+、 Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+、 Pb2+ 和 Hg2+。
优选地， 所述二价金属离子选自 Zn2+、 Ca2+ 和 Cu2+。更优选地， 所述二价金属离子为 2+ Zn 。
当所述多价金属离子为三价金属离子时， 该三价金属离子选自 Al3+、 Ga3+、 In3+、 Cr3+、 Mn3+、 Fe3+、 Co3+、 Ni3+。 优选地， 所述三价金属离子选自 Ga3+、 Mn3+、 Fe3+、 Ni3+。更优选地， 所述三价金属离 3+ 子为 Ga 。
在本发明的化合物或络合物包含多于一个环多胺单元 (C) 的实施方案中， 不同的 金属离子可被所述化合物或络合物络合。
为了例如在向患者给药后或当用于濒死细胞 (dying cell) 的体外检测方法中时 有助于容易地检测所述化合物或络合物， 所述化合物或络合物还包含至少一个用于例如在 患者中检测所述化合物或络合物的可检测标记 (T)( 例如标记或信号基团 )。 该可检测标记 (T) 优选地与所述化合物或络合物共价结合。
这样的标记 (T) 可选自荧光染料、 酶 ( 特别是用于 ELISA 检测 )、 蛋白质、 磁性颗 粒、 纳米颗粒、 脂质体、 用于 CT 的 X- 射线吸收元素 ( 例如碘、 镧系元素等 )、 用于 MRT 的改变 组织的弛豫时间的元素 ( 例如钆、 超顺磁性氧化铁 (SPIO)) 以及放射性标记。
具体而言， 所述荧光染料选自异硫氰酸荧光素 (FITC)、 罗丹明及衍生物、 BODIPY 荧 光 团 (4， 4- 二 氟 -4- 硼 -3a， 4a- 二 氮 杂 - 对 称 引 达 省 (4， 4-difluoro-4-bora-3a， 4a-diaza-s-indacene)，分 子 探 针， Invitrogen)、 Alexa Fluor 染 料 ( 分 子 探 针， Invitrogen)、 酞菁和部花青、 Atto(Sigma)、 萘 (naphtalene) 衍生物 ( 丹磺酰基 (dansyl) 和氟硅酸钠 (prodan) 衍生物 )、 吡啶基噁唑、 硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑衍生物、 香 豆素衍生物、 芘衍生物、 俄勒冈绿 (Oregon green)、 曙红、 德克萨斯红、 瀑布蓝 (cascade blue)、 尼 罗 红、 Cy-3、 Cy-5 及 它 们 的 衍 生 物， 以 及 Handbook of Fluorescent Probes R.P.Hangland， ISBN0-9652240-1-5 ； 1996， 第 8-39 页中所列的任何其它荧光化合物。优选 地， 所述荧光染料为异硫氰酸荧光素 (FITC)。
所述蛋白质选自过氧化物酶、 荧光素酶 (luziferase)、 生物素、 抗生物素蛋白、 抗 体和 / 或抗体的一部分 ( 例如 Fc- 片段、 双特异抗体、 scFv、 F(ab′ )2 片段、 Fab....)、 毒 素、 诸如 scFv’ s 的重组蛋白质、 双特异抗体、 微抗体以及技术人员已知的合适的蛋白质。
所述 CT 标记可选自适用于计算机断层摄影 (CT) 的包含碘或镧系元素的络合物。
所述 MRT 标记可选自适用于磁共振计算机断层摄影 (MRT) 显像的包含钆或超顺磁性氧化铁 (SPIO) 的络合物。合适的 CT 或 MRT 元素是本领域公知的。所述 CT/MRT 标记为包含碘或镧 系元素或钆的络合物和 / 或为与所述化合物或络合物共价结合的基团或原子。
所述放射性标记可选自适用于正电子发射断层摄影 (PET) 或单光子发射计算机 断层摄影 (SPECT) 显像的已知放射性同位素或它们的衍生物或包含放射性同位素的络合 物。合适的 PET 放射性同位素 (29) 是本领域公知的 (Handbook of Nuclear Chemistry， 第 4 卷 (Vol.Ed.F. Ed.Vértes， A.， Nagy， S.， Klencsár， Z.， )Kluver Academic Publishers， 2003 ； 第 119-202 页 )。用于 SPECT 显像的合适的包含放射性同位素的络合 物 (30) 是本领域公知的 ((Handbook of Nuclear Chemistry， 第 4 卷 (Vol.Ed.F. Ed.Vértes， A.， Nagy， S.， Klencsár， Z.， )Kluver Academic Publishers， 2003 ； 第 279-310 页 )。所述放射性标记为包含放射性同位素的络合物和 / 或与所述化合物或络合物共价结 18 11 123 124 125 131 64 67 89 合的基团或原子。所述放射性同位素选自 99mTc、 F、 C、 I、 I、 I、 I、 Cu2+、 Cu2+、 Zr、 68 3+ 67 3+ 111 3+ 14 3 32 89 33 Ga 、 Ga 、 In 、 C、 H、 P、 Zr 和 P。 68 67
具体而言， 对于正电子发射断层摄影 (PET)， 优选 18F、 Ga、 Cu 或 124I 作为正电子 发射放射性同位素， 更优选 18F 或 68Ga。 对于单光子发射计算机断层摄影 (SPECT)， 优选 123I、125 111 I、 In 和 99mTc， 更优选 123I 或 99mTc。
优选地， 所述标记 (T) 选自(FITC- 标记 ) 或其它荧光染料所述连接基 (L) 为 C1-C6 烷基、 O-C1-C6 烷基、 C1-C6 烷氧基、 C1-C6 亚烷基、 (CH2CH2O) 取代或未取代的芳基、 取代或未取代的 O- 芳基、 取代或未取代的杂芳基、 (CH2)nPh、 nCH2CH2、 (CH2CH2CH2O)nCH2CH2、 CO(CH2)n、 [O(CH2)n-O(CH2)n]m 或 -O(CH2)n、 [O(CH2)n-O(CH2)n]m，
其中 Ph ＝苯基， 并且 n 或 m ＝ 1、 2、 3、 4、 5、 6。
优选地， n 或 m 各自独立地为 1 至 4， 更优选为 1 至 3。
优选地， 所述连接基 (L) 为 C1-C6 烷基、 O-C1-C6 烷基、 C1-C6 烷氧基。
优选地， 所述连接基 (L) 为具有本领域公知的分子式的 PEG 链。优选地， 所述连接 基 (L) 为 (CH2CH2CH2O)nCH2CH2、 CO(CH2)n、 [O(CH2)n-O(CH2)n]m 或 -O(CH2)n、 [O(CH2)n-O(CH2)n]m。 更优选地， 所述连接基为 O(CH2)n、 [O(CH2)n-O(CH2)n]m， 其中 n 为 2 且 m 为 1。
除了可检测标记 (T)， 所述化合物或络合物还可以与例如可在中风后向患者给药 的治疗性化合物 ( 例如药物， 如抗凋亡物质 ) 共价或非共价结合。
在本发明的一优选实施方案中， 所述环多胺单元 (C) 为取代或未取代的基团， 所 述基团具有 9 至 20 个环成员， 并且所述环中的 3 至 6 个胺氮被 2 个或更多个碳原子彼此间 隔。优选地， 所述环多胺单元 (C) 为 ：
式 Ia 的四氮杂环十二烷 ( 亚乙基桥联的四胺 )，
式 Ib 的四氮杂环十四烷 ( 混合的亚乙基 - 亚丙基桥联的四胺 )， 以及
式 Ic 的四氮杂环十二烷 - 四氮杂环十四烷混合物 ( 混合的亚乙基 - 亚丙基桥联 的四胺 )，
式 Ia 式 Ib 式 Ic
其中 R1、 R2、 R3 和 R4 各自独立地选自键、 氢、 C1-C6 烷基、 C1-C6 烷氧基或烷基 -COO-、 芳基 -COO-。
优选地， R1、 R2、 R3 和 R4 各自独立地选自氢、 C1-C4 烷基、 C1-C4 烷氧基。
更优选地， 所述四氮杂环十二烷为式 Ia 的四氮杂环十二烷， 其中 R1 至 R4 为氢。
式 Ia(H) 更优选地， 所述四氮杂环十四烷为式 Ib 的四氮杂环十四烷， 其中 R1 至 R4 为氢。式 Ib(H)
更优选地， 所述四氮杂环十二烷 - 四氮杂环十四烷混合物为式 Ic 的四氮杂环十二 烷 - 四氮杂环十四烷混合物， 其中 R1 至 R4 为氢。
式 Ic(H)
优选地， 所述化合物或络合物包含 1 至 10 个环多胺单元 (C)。 更优选地， 所述化合 物或络合物包含 1 至 6 个环多胺单元 (C)。更优选地， 所述化合物或络合物包含 1 至 4 个环 多胺单元 (C)。更优选地， 所述化合物或络合物包含 1 至 2 个环多胺单元 (C)。更优选地， 所述化合物或络合物包含 2 个环多胺单元 (C)。
当本发明的化合物或络合物包含多于 2 个环多胺单元 (C) 时， 则环多胺单元 (C) 各自独立地选自 ：
式 Ia 的四氮杂环十二烷 ( 亚乙基桥联的四胺 )，
式 Ib 的四氮杂环十四烷 ( 混合的亚乙基 - 亚丙基桥联的四胺 )， 或者
式 Ic 的四氮杂环十二烷 - 四氮杂环十四烷混合物 ( 混合的亚乙基 - 亚丙基桥联 的四胺 )。
如上所述， 多价 ( 特别是二或三价 ) 金属离子被其中所述环通过环 N 原子或环 C 原子连接的四氮杂环十二烷、 四氮杂环十四烷或四氮杂环十二烷 - 四氮杂环十四烷混合物 络合。
在一优选实施方案中， 所述化合物或络合物含有或包含至少两个通过桥联单元 (B) 连接的环多胺单元。
在另一优选实施方案中， 含有或包含单个环多胺单元 (C) 的化合物或络合物任选 地与桥联单元 (B) 连接。
已令人惊讶地发现数个作为桥联单元的结构， 并且其为本发明的一部分。下文显 示了优选的桥联单元 ： 在本发明的化合物或络合物的一优选实施方案中， 所述桥联单元 (B) 为式 II 的单 元， 其中苯基核心结构为在未被 X1、 X2 或 X3 占据的位点取代或未取代的。
式 II
其中 X1、 X2 和 X3 各自独立地为 H、 C1-C6 烷基、 C1-C6 烷氧基、 C1-C6 亚烷基、 C(O)、 [O(CH2)n]m、 (CH2CH2O)m、 CH2OPhCH2、 (CH2CH2CH2O)m、 (CONHPhCH2)、 (CONH(CH2CH2O)2CH2CH2)、 [O(CH2)n]m-NH2 或 C(O)NH-[(CH2)n-O]m， Ph ＝苯基， n ＝ 2 至 6， 并且 m ＝ 1 至 6。
任选地， X1、 X2 或 X3 各自独立地与环多胺单元 (C)、 标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共价结合， 其条件是 X1、 X2 或 X3 不为 H。
优选地， n ＝ 2 至 3， 并且 m ＝ 1 至 3。
优选地， X1、 X2 和 X3 各自独立为 C1-C6 烷基、 C(O) 或 (CONH(CH2CH2O)2CH2CH2)。更 优选地， X1、 X2 和 X3 各自独立为甲基或 C(O)。
优选地， 所述桥联单元 (B) 为式 II 的单元， 其选自
其中 X 为 X1、 X2 或 X3。
式 II 的桥联单元 (B) 任选地与所述标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共价结合， 参见式 IIa1，
式 IIa1
其中 X 为如上文定义的 X1、 X2 或 X3，
R ＝如上所述的标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)。
优选地， 式 II 的桥联单元 (B) 任选地与所述标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共 价结合， 参见式 IIa2
其中，
其中 X 为如上文定义的 X1 和 / 或 X2，
R ＝如上所述的标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)。
优选地， 所述可检测标记 (T) 为或包含如上所述的荧光染料、 放射性同位素、 酶、 蛋白质或被标记的取代基。
优选地， 当存在多于 2 个 X 基团时， 式 II、 IIa1 或 IIa2 的桥联单元的 X 基团相同。
优选地， 式 II、 IIa1 或 IIa2 的桥联单元的 X 基团彼此不同。
在本发明的化合物或络合物的第二种优选实施方案中， 所述桥联单元 (B) 为取代 或未取代的式 III 的单元， 所述式 III 为取代苯系骨架。
式 III
其中 X1 和 X2 各自独立地为 H、 C1-C6 烷基、 C1-C6 烷氧基、 C1-C6 亚烷基、 C(O)、 [O(CH2) (CH2CH2O)m、 CH2OPhCH2、 (CH2CH2CH2O)m、 (CONHPhCH2)、 (CONH(CH2CH2O)2CH2CH2)、 [O(CH2)n] n]m、 Ph ＝苯基， n ＝ 2 至 6， 并且 m ＝ 1 至 6， m-NH2 或 C(O)NH-[(CH2)n-O]m，
Y ＝ (CH2)n( 其中 n ＝ 1、 2 或 3)、 (CH2CH2O)m( 其中 m ＝ 0、 1、 2 或 3)、 O(CH2)pO( 其 中 p ＝ 2、 3 或 4) 或 O( 彼此独立 )。
优选地， X1 和 X2 各自独立地为 C1-C6 烷基、 C(O) 或 (CONH(CH2CH2O)2CH2CH2)。更优 选地， X1 和 X2 各自独立地为甲基或 C(O)， 并且 Y 为甲基或 C(O)。
任选地， X1 或 X2 各自独立地与环多胺单元 (C)、 标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共价结合， 其条件是 X1 或 X2 或不为 H。
式 III 的桥联单元 (B) 任选地与所述标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共价结合， 参见式 IIIa1，
式 IIIa1
其中 X 为如上文定义的 X1 和 / 或 X2，
R ＝如上所述的 H、 标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)。
优选地， 式 IIIa1 的化合物为其中 R 为如上文定义的 H、 标记 (T) 或连接基 (L)- 标 记 (T) 的式 IIIa1 的化合物， 其条件是仅有一个 R 包含标记 (T)。
优选地， 式 III 的桥联单元 (B) 任选地与所述标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共 价结合， 参见式 IIIa2，
其中 X 为如上文定义的 X1 和 / 或 X2，R ＝如上所述的标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)。
优选地， 所述可检测标记 (T) 为或包含如上所述的荧光染料、 放射性同位素、 酶、 蛋白质或被标记的取代基。本文包括上文公开的优选实施方案。
在式 III、 IIIa1 或 IIIa2 中， 所述桥联单元 (B) 的 X 与环多胺单元 (C) 通过环多 胺单元 (C) 环的环 N 原子或环 C 原子共价结合。
优选地， 当存在多于 2 个 X 基团时， 式 III、 IIIa1 或 IIIa2 的桥联单元的 X 基团相 同。优选地， 式 III、 IIIa1 或 IIIa2 的桥联单元的 X 基团彼此不同。
在本发明的化合物或络合物的第三种优选实施方案中， 所述桥联单元 (B) 为取代 或未取代的式 IV 的单元， 所述式 IV 为金刚烷系骨架。
式 IV
其中 X1、 X2 和 X3 如上文所定义。
X1、 X2 或 X3 各自独立与环多胺单元 (C)、 标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共价结 合， 其条件是 X1、 X2 或 X3 不为 H。
式 IV 的桥联单元 (B) 任选地与标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共价结合， 参见 式 IVa，
式 IVa其中 X 为 X1、 X2 和 / 或 X3， 并且 R 如上文所定义。
其它分子构造 ( 例如包含上述取代基和标记的树状体 (dendrimeric) 结构 ) 也是 可能的。
如上所述的基团 X 与环多胺单元 ( 例如四氮杂环十二烷或四氮杂环十四烷 ) 的 C 原子或 N 原子， 优选其 N 原子之一共价结合。
在本发明的化合物或络合物的第四种优选实施方案中， 所述桥联单元 (B) 为取代 或未取代的式 V′和 V′ a 的单元， 所述式 V′和 V′ a 为肽系骨架。 式 V′是基于具有 α- 氨 基酸的肽骨架， 而式 V′ a 是基于具有 β- 氨基酸的肽骨架。
式 V′为由 α- 氨基酸组成的线性肽。
式 V′ a 为由 β- 氨基酸组成的线性肽。
式 V′和 V′ a 的桥联单元 (B) 任选地与所述标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共 价结合， 参见式 V 和 Va，
式V
式 Va其中 m ＝ 1、 2、 3、 4、 5 或 6， 并且
R′＝ X，
其 中 X 为 X1、 X2 和 X3，其 各 自 独 立 地 为 H、 C1-C6 烷 基、 C1-C6 烷 氧 基、 C1-C6 亚 烷 基、 C(O)、 [O(CH2)n]m、 (CH2CH2O)m、 CH2OPhCH2、 (CH2CH2CH2O)m、 (CONHPhCH2)、 (CONH(CH2CH2O)2CH2CH2)、 [O(CH2)n]m-NH2 或 C(O)NH-[(CH2)n-O]m， Ph ＝苯基， n ＝ 2 至 6， 并且 m ＝ 1 至 6，
X1、 X2 或 X3 各自独立地与环多胺单元 (C)、 标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 共价 结合， 其条件是 X1、 X2 或 X3 不为 H， 并且 R ＝如上所述的标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)。
优选地， X1、 X2 和 / 或 X3 各自独立地为与式 Ia、 式 Ib 或式 Ic 的环多胺单元 (C) 连接的烷基或芳基桥。
诸如四氮杂环十二烷或四氮杂环十四烷的环多胺单元 (C) 通过式 V 或 Va 的化合 物或络合物中的 C 或 N， 优选地通过其 N 原子之一结合。
此外， 可以提供功能化颗粒， 例如超微超顺磁性氧化铁颗粒 (USPIO)， 本发明的化 合物或络合物的四氮杂环十二烷或四氮杂环十四烷或其混合物结合到所述颗粒的预定表 面上。将这样的功能化颗粒与所述化合物或络合物结合的方法已记载于他处 (27)。
通过在使用对照和凋亡 Jurkat 细胞的结合实验中使用图 3 所示的 Zn2+ 络合的以 及 FITC- 标记的双 - 四氮杂环十二烷 (bis-cyclen) 衍生物， 发明人惊奇地获得与使用荧光 膜联蛋白 V 所获得的那些结果相当的结果。与使用 Zn2+ 络合的以及 FITC 标记的双 -DPA 络 合物所进行的实验相反， 这些 FACS 测量是可重现的。
使用体外凋亡检测 (apo-test) 系统获得的阳性结果 (15) 显示， 此类小金属有机 化合物或络合物可用于细胞死亡显像， 例如凋亡或坏死显像。表 1 列出了本发明的优选化 合物或络合物。
在另一实施方案中， 本发明涉及用于结合或检测磷脂酰丝氨酸的化合物或络合 物， 其特征在于所述化合物或络合物包含至少一个用于二价或三价金属离子的络合的环多 胺单元 (C)。 优选地， 用于结合或检测磷脂酰丝氨酸的化合物或络合物包含至少一个用于非 放射性二价或三价金属离子的络合或用于络合非放射性二价或三价金属离子的环多胺单 元 (C)。所公开的优选实施方案和上文公开的优选替代方案均包括于本文中。
第二方面， 本发明涉及化合物或络合物 VI， 其特征在于所述化合物或络合物包 含：
至少一个用于二价或三价金属离子的络合或用于络合二价或三价金属离子的环 多胺单元 (C)， 以及
至少一个用于共价结合标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 的基团。
任选地， 本发明的化合物或络合物 VI 还包含至少一个桥联单元 (B) 或键。
优选地， 所述二价或三价金属离子为非放射性二价或三价金属离子。
优选地， 所述化合物或络合物包含 ：
至少一个用于二价或三价金属离子的络合或用于络合二价或三价金属离子的环 多胺单元 (C)，
至少一个用于共价结合标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 的基团， 以及
至少一个桥联单元 (B) 或键。
用于共价结合标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 的基团是本领域已知的基团。所 述基团会使得标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 能够与环多胺单元 (C) 或桥联单元 (B) 共 价结合。
用于共价结合标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 的基团， 其中标记 (T) 为荧光染料， 例如异硫氰酸荧光素 (FITC)、 罗丹明、 BODIPY 荧光团 (4， 4- 二氟 -4- 硼 -3a， 4a- 二氮杂 - 对 称引达省， 分子探针 )、 Alexa Fluor 染料 ( 分子探针 )、 Cy-3、 Cy-5 及其混合物， 或在例如 Handbook of Fluorescent Probes R.P.Hangland， ISBN 0-9652240-1-5 ； 1996， 第 8-39 页 中列出的任何其它荧光化合物。 用于共价结合其中标记 (T) 为蛋白质的标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 的基团 是本领域公知的。参考书提供了当标记为蛋白质时适用于结合标记的方法和试剂。
用于共价结合其中标记 (T) 为放射性标记的标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 的 基团选自本领域公知的合适的 PET 放射性同位素基团 (Handbook of Nuclear Chemistry，
第 4 卷 (Vol.Ed.F.Ed.Vértes， A.， Nagy， S.， Klencsár， Z.)Kluver AcademicPublishers， 2003 ； 第 119-202 页 )。用于 SPECT 显像的合适的包含放射性同位素的络合物 是本领域公知的 ( 同上 ； 第 279-310 页 )。上文公开的实施方案适用于此。 第三方面， 本发明涉及用于在体外和体内结合和检测濒死细胞的如本文所述的化 合物或络合物。具体而言， 这样的用途使得通过利用正电子发射断层摄影 (PET)、 单光子发 射计算机断层摄影 (SPECT)、 磁共振显像 (MRI) 和 / 或光学显像 ( 优选正电子发射断层摄影 (PET)) 进行体内凋亡或坏死显像成为可能。
在一实施方案中， 所述化合物或络合物的特征在于所述化合物或络合物包含 ：
至少一个用于非放射性二价或三价金属离子的络合或用于络合非放射性二价或 三价金属离子的环多胺单元 (C)。
在一实施方案中， 所述化合物或络合物的特征在于所述化合物或络合物包含 ：
至少一个用于非放射性二价或三价金属离子的络合或用于络合非放射性二价或 三价金属离子的环多胺单元 (C)， 其用于制备药物组合物或用作检测濒死细胞的显像剂。
细胞死亡通过坏死或凋亡发生。坏死 (31) 是由突然的和意外的细胞损伤所引起 的， 并且为不可调控的过程， 其间细胞通常不向免疫系统发出经历凋亡的细胞所发出的相 同的化学信号。这阻止了邻近的吞噬细胞定位并吞噬死亡细胞， 导致死亡组织和细胞碎片 在细胞死亡位点或附近聚积。 许多毒性化学和物理事件例如毒素、 辐射、 热、 创伤、 缺氧可导
致坏死。凋亡 (31) 是由不可修复的细胞损伤 ( 例如 DNA- 损伤 )、 必要蛋白质或发育过程中 的突变所引起的细胞自我破坏的可调控过程。 程序性细胞死亡涉及一系列导致细胞死亡并 引起细胞碎片处理过程的生物化学事件， 其结果不损伤生物体。
在另一实施方案中， 本发明涉及如本文所述的环多胺化合物或络合物或其组合物 用于体内或体外检测由凋亡或坏死导致的细胞死亡的用途。更优选地， 所述用途为用于体 外检测。可以通过 FACS、 显微测谱术、 显微术或 ELISA 进行体外检测。更优选地， 所述用途 为用于体内检测。可以通过 PET、 SPECT、 CT 或 MRT 进行体内检测。
优选地， 本发明涉及如本文所述的环多胺化合物或络合物或其组合物用于体内或 体外检测凋亡或坏死的用途。
有利的是， 这样的方法使得能够将患有肿瘤、 患有感染和 / 或患有炎症、 患有损 伤、 患有中风、 患有心脏病发作的患者分别对抗肿瘤疗法、 抗感染疗法和或抗炎疗法的反应 评价为与疾病发展或消退直接相关的细胞死亡的测量值， 并且还使得能够监测疗效。具体 而言， 本发明的化合物或络合物的优势在于其摄取的降低是容易检测的。
优选地， 所述用途为用于制备药物组合物或用作检测坏死的显像剂。
优选地， 所述用途为用于制备药物组合物或用作检测凋亡的显像剂。
相应地， 本发明还提供了体内或体外检测在凋亡或坏死过程中发生的细胞死亡， 并由此在患者的组织中检测肿瘤、 感染和 / 或炎症的发展或消退的方法。这样的方法包括 或包含以下步骤 ：
a) 向患者给药如本文所述的化合物或络合物， 以及
b) 测量所述化合物或络合物在所述组织中的量和 / 或浓度。
相应地， 本发明还提供了检测磷脂酰丝氨酸， 并由此在患者的组织中检测肿瘤、 感 染和 / 或炎症、 中风、 心脏病发作、 损伤的发展或消退的方法。这样的方法包括或包含以下 步骤 ：
a) 向患者给药如本文所述的化合物或络合物， 以及
b) 测量所述化合物或络合物在所述组织中的量和 / 或浓度。
所述患者可以是任何哺乳动物， 并优选为人类。可以利用 PET、 SPECT、 MRI、 CT 和 / 或光学显像来进行对所关注的组织 ( 即患病组织 ) 中的化合物或络合物的量和 / 或浓度 的测量。
用于这一检测方法的化合物或络合物优选包含至少两个通过桥联单元连接的环 多胺单元， 所述桥联单元用于将至少两个环多胺单元彼此连接。所述桥联单元优选地选自 如上所示的式 II 至式 V 的化合物或络合物。
本发明涉及 AMD3100(1， 1′ -[1， 4- 亚苯基双 ( 亚甲基 )] 双 [1， 4， 8， 11- 四氮杂环 十四烷 ]- 八氢溴化物 - 二水合物 ) 用于结合和检测濒死细胞或死亡细胞或用于结合和检 测磷脂酰丝氨酸的用途。
优选地， 上述用途为用于结合和检测濒死细胞和死亡细胞， 其中所述濒死细胞或 死亡细胞是由凋亡或坏死所导致的。
上文公开的实施方案适用于此。
本发明的化合物可用于检测和诊断以濒死细胞为特征的多种医学病症。
以濒死细胞为特征的临床病症的实例如下 ：以发生过度凋亡 (excessive apoptosis) 为特征的疾病， 例如退行性病症、 神经变 性病症 ( 例如帕金森病、 阿尔茨海默病、 亨廷顿舞蹈病 )、 AIDS、 诸如肌萎缩侧索硬化 (ALS) 的运动神经元病、 朊病毒病 ( 例如 Creutzfeldt-Jacob 病 )、 骨髓增生异常综合征、 缺血或毒 性损伤 (toxic insult)、 移植排斥期间的移植物细胞消亡 (graft cell loss) ； 肿瘤， 特别 是非常恶性的 / 侵袭性很强的肿瘤， 它们除了过度的组织增殖外通常也具有凋亡增加的特 征。
血管病， 例如心肌梗塞、 脑中风、 深静脉血栓形成、 弥散性血管内凝血 (DIC)、 血栓 性血小板减少性紫癜 (TTP)、 镰刀型细胞病、 珠蛋白生成障碍性贫血、 抗磷脂抗体综合征、 全 身性红斑狼疮。
炎性疾病和 / 或与免疫介导的病因学或发病机制相关的疾病 ； 自身免疫性疾 病， 例如抗磷脂抗体综合征、 全身性红斑狼疮、 诸如类风湿性关节炎的结缔组织病、 硬 皮病 ； 甲状腺炎 ； 皮肤病， 例如天疱疮或结节性红斑 ； 自身免疫性血液病 (autoimmune hematological disorder) ； 自身免疫性神经病 (autoimmune neurological disorder)， 例 如重症肌无力、 多发性硬化症、 诸如溃疡性结肠炎的炎性肠病以及血管炎。
粥样硬化斑块 ( 特别是不稳定的、 脆弱的且易于破碎的斑块 ) 也以濒死细胞 ( 例 如凋亡的巨噬细胞、 凋亡的平滑肌细胞或凋亡的内皮细胞 ) 为特征。
本发明的方法可用于在人类患者或动物个体中检测和 / 或诊断一种或多种前述 临床病症。 此外， 还可以在已知患有各自的疾病的人中进行所述检测， 用于评价疾病的严重 性或用于监测。
第四方面， 本发明涉及合成如本文所述的本发明化合物或络合物的方法。
在一实施方案中， 本发明涉及合成包含至少一个用于非放射性二价或三价金属离 子的络合或用于络合非放射性二价或三价金属离子的环多胺单元 (C) 的化合物或络合物 的方法。
在另一实施方案中， 本发明涉及包括使式 VI 的化合物或络合物反应的步骤的方 法， 所述式 VI 的化合物或络合物包含 ：
至少一个用于非放射性二价或三价金属离子的络合或用于络合非放射性二价或 三价金属离子的环多胺单元 (C)， 以及
至少一个用于共价结合标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T) 以获得化合物或络合物 的基团， 所述化合物或络合物包含 ：
至少一个用于非放射性二价或三价金属离子的络合或用于络合非放射性二价或 三价金属离子的环多胺单元 (C)， 以及
至少一个标记 (T) 或连接基 (L)- 标记 (T)。
根据这一方法， 至少两个环多胺单元通过桥联单元连接， 所述桥联单元用于将至 少两个环多胺单元彼此连接。优选地， 所述桥联单元选自式 II 至式 V 的化合物或络合物。
上文公开的实施方案适用于此。
第五方面， 本发明涉及药物组合物， 其包含如本文所述的化合物或络合物， 并可能 还包含合适的载体和 / 或添加剂， 其中所述化合物或络合物包含至少一个用于非放射性二 价或三价金属离子的络合或用于络合非放射性二价或三价金属离子的环多胺单元 (C)。
上文公开的实施方案适用于此。本发明用于治疗的药物组合物以及诊断组合物可通过任何已知途径给药， 特别是 口服、 静脉内、 腹膜内、 肌内、 皮下、 舌下、 眼内、 鼻内或局部给药或脑内给药。应根据期望的 给药方式来选择载体， 并且所述载体包括任何已知组分， 例如溶剂、 乳化剂、 赋形剂、 滑石 ； 矫味剂 ； 着色剂等。 所述药物组合物可视需要包含用于治疗疾病、 消除副作用或增加活性组 分的活性的其它药学活性化合物。
第六方面， 本发明涉及包含本发明的化合物或络合物之一的药盒。 优选地， 所述药 盒用于特别是在体内结合和检测磷脂酰丝氨酸。 这样的药盒包含如本文所述的化合物或络 合物以及用于溶解和 / 或稀释所述化合物或络合物的合适的缓冲液、 用于检测所述化合物 或络合物的试剂 ( 例如抗体 ) 和 / 或用于进行 ELISA 测定的 ELISA 板。
第七方面， 本发明涉及将可药用的化合物选择性地针对细胞群中的濒死细胞的方 法， 所述方法包括 ： 使细胞群接触如本申请中公开和要求保护的任何本发明化合物所显示 的结构所表示的化合物， 由此使所述药用化合物选择性地针对所述细胞群中的濒死细胞。
优选地， 本发明的化合物或络合物选自下组， 并与二价或三价金属离子络合。
本发明化合物 ：
双 -Zn(II)-Cyc B双 -Zn(II)-Cyc A
四 -Zn(II)-Cyc附图说明 图1：
图示了膜联蛋白 V 的结构域 III 之一与甘油磷酸丝氨酸 (glycerophosphoserine) ( 截短的 PS) 在 Ca2+- 膜联蛋白 V 结合位点 (9) 上的相互作用。一级 AB 和次级 AB′ Ca2+ 位 点位于各结构域的 A 螺旋和 B 螺旋之间的环内。它们也被分别称作 II 型和 III 型 Ca2+ 结 合位点。该图显示了膜联蛋白 V 的第三结构域 ( 阴影 ) 中 AB 和 AB′ Ca2+ 结合位点中的甘 油磷酸丝氨酸 ( 浅色 ) 的结构排列。
图2：
描绘了根据现有技术的 FITC 标记的 Zn2+- 双 DPA 络合物。
图3：
描绘了本发明的优选化合物或络合物， 即 FITC 标记的 Zn2+- 双 - 四氮杂环十二烷
络合物。 图4：
对 膜 联 蛋 白 V 和 碘 化 丙 啶 的 流 式 细 胞 计 数 FACS， FL-I、 FL-III 和 FL-I/ FL-III- 图。
图5：
对 膜 联 蛋 白 V 和 碘 化 丙 啶 的 流 式 细 胞 计 数 FACS， FL-I、 FL-III 和 FL-I/ FL-III- 图。
图6：
化合物 19 在诱导肝细胞凋亡后 3.5h 时间点的生物分布 (biodistribution) 数 据。
图7：
横向切片 (transversal section) 中 18F-Zn 络合物 19 的 PET 采集。a) 放射疗法 前 1 天， b) 放射后第 6 天， c) 放射后第 10 天的被辐射肿瘤 ( 左 ) 和对照 ( 右 )。
图8：
用化合物 1 孵育的未诱导的对照细胞。FL-1 为化合物 1 的荧光， FL-III 为 PI 的 荧光。Q1 中发现凋亡细胞、 Q2 和 Q4 中发现坏死细胞、 Q3 中发现活细胞。左侧第一个示意 图为绿色。
图9：
用 化 合 物 1 孵 育 的 凋 亡 诱 导 的 Jurkat 细 胞。A ： FL-I 为 化 合 物 1 的 荧 光 ( 绿 色 )， B： FL-III 为 PI 的荧光 ( 红色 )。C ： 前向散射和侧向散射显示区域 RN1 中的同源群体 (homogeneous population)。D ： 补偿重叠的荧光光谱。Q1 中发现凋亡细胞， Q2 和 Q4 中发 现坏死细胞， Q3 中发现活细胞。
图 10 ：
用化合物 AB(FL-III) 和膜联蛋白 V(FL-I) 孵育的凋亡诱导的 Jurkat 细胞。
图 11 ：
用化合物 1( 左图， 绿色 ) 和化合物 we( 右图， 绿色 ) 孵育的凋亡诱导的 Jurkat 细 胞。
图 12 ：
用与 Zn2+ 络合的化合物 1( 左图， 绿色 ) 或无 Zn2+ 的化合物 1( 右图， 绿色 ) 孵育的 凋亡诱导的 Jurkat 细胞。
图 13 ：
用化合物 1 和 PI 孵育的凋亡诱导的 Jurkat 细胞。来自化合物 1 的绿色荧光 ( 左 2) 与来自 PI 的红色荧光 ( 右 2) 的叠加得到可在右图中观察到的黄色荧光。左图显示透射 图 (transmission picture)。
图 14 ：
用化合物 AB( 红色 ) 和膜联蛋白 V( 绿色 ) 孵育的凋亡诱导的 Jurkat 细胞。来自 化合物 AB 的红色荧光与来自膜联蛋白 V 的绿色荧光的叠加显示出化合物 AB 对凋亡细胞和 坏死细胞二者的标记。左图显示透射图。
定义 ：
用于非放射性二价或三价金属离子的络合的环多胺单元 (C) 意指能够适当地络 合一个或多个非放射性二价或三价金属离子的环多胺单元。优选地， 所述环多胺单元能够 络合一个非放射性二价或三价金属离子。
络合非放射性二价或三价金属离子的环多胺单元 (C) 意指适当地络合或包含一 个或多个非放射性二价或三价金属离子的环多胺单元。优选地， 所述环多胺单元络合或包 含一个非放射性二价或三价金属离子。
本文中使用的术语 “烷基” 指 C1 至 C6 直链或支链烷基基团， 例如甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 正丁基、 叔丁基、 正戊基或新戊基。烷基基团可以是全氟代的， 或者可被 1 至 5 个选 自卤素、 羟基、 C1-C4 烷氧基或 C6-C12 芳基 ( 其可被 1 至 3 个卤素原子所取代 ) 的取代基所 取代。更优选地， 烷基为 C1 至 C4 烷基或 C1 至 C3 烷基。
本文中使用的术语 “烯基” 指含有至少一个双键并且具有 2 至 10 个碳原子的直链 或支链的一价或二价基团， 例如乙烯基、 丙 -2- 烯 -1- 基、 丁 -1- 烯基、 戊 -1- 烯基、 戊 -1， 4- 二烯基等。
本文中使用的术语 “炔基” 指含有至少一个三键并且具有 2 至 10 个碳原子的直链 或支链的一价或二价基团， 例如乙炔基、 丙 -1- 炔基、 丁 -1- 炔基、 戊 -1- 炔基、 戊 -3- 炔基 等。
烯 基 和 炔 基 可 以 被 一 个 或 多 个 选 自 卤 素、 羟 基、 烷 氧 基、 -CO2H、 -CO2 烷 基、 -NH2、 -NO2、 -N3、 -CN、 C1-C20 酰基或 C1-C6 酰氧基的取代基所取代。
本文中使用的术语 “芳基” 指包含 5 至 10 个环原子的芳族碳环或杂环基团， 例 如苯基、 萘基、 呋喃基、 噻吩基、 吡啶基、 吡唑基、 嘧啶基、 噁唑基、 哒嗪基、 吡嗪基、 喹啉基 (chinolyl) 或噻唑基。芳基基团可被一个或多个选自卤素、 羟基、 烷氧基、 -CO2H、 -CO2 烷 基、 -NH2、 烷基 -NH2、 C1-C20 烷基 - 四氢噻吩基 (C1-C20 alkyl-thiolanyl)、 -NO2、 -N3、 -CN、 C1-C20 烷基、 C1-C20 酰基或 C1-C20 酰氧基的取代基所取代。如果不引起芳族特性的丧失， 这些 杂原子可被氧化， 例如吡啶基团可被氧化以得到吡啶 N- 氧化物。
每当使用术语 “取代的” ， 其旨在表示在使用 “取代的” 的表述中所表示的原子上的 一个或多个氢被选自指定基团的基团所取代， 其条件是不超过所表示原子的正常化合价， 并且所述取代得到化学稳定的化合物 ( 即稳定到足以经受从反应混合物中分离成为有用 的纯度以及配制成药物组合物的化合物 )。所述取代基基团可选自卤素原子、 羟基基团、 硝 基、 (C1-C6) 羰基、 氰基 (cyano)、 腈基 (nitrile)、 三氟甲基、 (C1-C6) 磺酰基、 (C1-C6) 烷基、 (C1-C6) 烷氧基和 (C1-C6) 硫烷基 (sulfanyl)。
卤素意指氯、 碘、 氟和溴。优选地， 卤素意指碘或氟。
如果本发明的化合物中存在手性中心或其它形式的异构中心， 则本文意图涵盖包 括对映异构体和非对应异构体在内的这样的立体异构体的所有形式。 含有手性中心的化合 物可用作外消旋混合物或用作对映异构体富集的混合物， 或者可使用公知技术分离该外消 旋混合物并且可单独使用单独的对映异构体。在化合物具有不饱和碳 - 碳双键的情况下， (Z)- 异构体和 (E)- 异构体二者均在本发明的范围之内。 在化合物可以以互变异构形式 ( 例 如酮 - 烯醇互变异构体 ) 存在的情况下， 不论是均衡存在或是主要以一种形式存在， 每种互 变异构体均意图包括在本发明的范围之内。
本领域技术人员公知本发明的化合物在生理 pH 为 7.4 的情况下为或可以为两性离子和 / 或盐的形式 ( 视情况而定 )。
优选地， 所述患者为哺乳动物 ； 最优选地， 所述患者为人。
尽管有可能将显像剂单独给药， 但是优选将其以药物制剂的形式给药， 所述药物 制剂包含至少一种显像剂化合物以及一种或多种药学可接受的载体 ( 例如稀释剂或赋形 剂 )， 所述载体可包括例如填充剂、 增量剂 (extender)、 润湿剂、 崩解剂、 表面活性剂或润滑 剂 ( 视给药的性质和方法以及剂型而定 )。在与制剂的其它成分相容并且对患者无害的 意义上， 每种载体必须是 “可接受的” 。所述药物制剂可任选地包含其它诊断剂或治疗剂。 技术和制剂可见例如 Remington′ s Pharmaceutical Sciences.Mack Publishing Co.， Easton， PA.( 最新版 )。
应当理解， 除了上文特别提及的成分， 本发明的制剂还可以包含就所讨论的制剂 类型而言在本领域为常规的其它药剂， 例如那些适用于口服给药的制剂可以包含这样的其 它药剂， 例如甜味剂、 增稠剂和矫味剂。
除非另外指明， 当涉及分子式化合物时， 本发明本身以及本发明的任何药物组合 物包括本发明化合物的所有水合物、 盐、 溶剂合物、 络合物和前药。前药为释放本发明的活 性母体药物的任何共价结合的化合物。
本文中通篇使用的术语 “前药” 意指药学可接受的衍生物， 例如酯、 酰胺和磷酸 盐， 使得所得的衍生物的体内生物转化产物为如式 (I) 化合物中所定义的活性药物。将对 前药进行概括性记载的 Goodman 和 Gilman 的参考文献 (The Pharmacological Basis of Therapeutics， 8ed， McGraw-HiM， Int.Ed.1992， ″ Biotransformation of Drugs ″， 第 13-15 页 ) 援引加入本文。通过以下方式制备本发明化合物的前药 ： 修饰本发明化合物中 所存在的官能团， 使得在常规操作中或者在体内将这些修饰分离得到母体化合物。本发明 化合物的前药包括这样的化合物， 其中例如羟基 ( 例如不对称碳原子上的羟基 ) 或氨基与 任意基团键合， 使得当将所述前药向患者给药时， 分别分离以形成游离羟基或游离氨基。
细胞死亡通过坏死或凋亡发生。
坏死是由突然的和意外的细胞损伤所引起的， 并且为不可调控的过程， 其间细胞 通常不向免疫系统发出经历凋亡的细胞所发出的相同的化学信号。 这阻止了邻近的吞噬细 胞定位并吞噬死亡细胞， 导致死亡组织和细胞碎片在细胞死亡位点或附近聚积。许多毒性 化学和物理事件例如毒素、 辐射、 热、 创伤、 缺氧可导致坏死。
凋亡是由不可修复的细胞损伤 ( 例如 DNA- 损伤 )、 必要蛋白质或发育过程中的突 变所引起的细胞自我破坏的可调控过程。 程序性细胞死亡涉及一系列导致细胞死亡并引起 细胞碎片处理过程的生物化学事件， 其结果不损伤生物体。
术语 “濒死细胞” 在本文中指经历死亡过程的细胞。这样的细胞例如经历凋亡过 程的细胞或经历神经变性的神经细胞。
以下公开内容为本发明的一部分。本发明还涉及用于结合磷脂酰丝氨酸的化合 物，
其特征在于
1. 所述化合物包含至少一个用于二价或三价金属离子的络合的环多胺单元。
2. 如权利要求 1 所述的化合物， 其中所述二价金属离子选自 Zn2+、 Ca2+、 Cu2+、 Be2+、 Mg2+、 Sr2+、 Ba2+、 Cd2+、 Cr2+、 Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+、 Pb2+、 Hg2+， 以及前述离子的对应的放射性金属(radiometal)。
3. 如权利要求 1 所述的化合物， 其中所述三价金属离子选自 Al3+、 Ga3+、 In3+、 Cr3+、 Mn3+、 Fe3+、 Co3+、 Ni3+， 以及前述离子的对应的放射性金属。
4. 如权利要求 1-3 所述的化合物， 其还包含用于检测所述化合物的标记。
5. 如权利要求 1 至 4 所述的化合物， 其中所述标记选自荧光染料、 酶、 蛋白质和放 射性标记。
6. 如权利要求 5 所述的化合物， 其中
- 所述荧光染料选自荧光素、 罗丹明、 BODIPY、 Cy-3、 Cy-5 及其衍生物 ；
- 所述蛋白质选自过氧化物酶、 荧光素酶、 生物素、 抗生物素蛋白、 以及抗体或其部 分； 18 11 124 123 64 68 111 14 3 32
- 所述放射性标记选自 99mTc、 F、 C、 I、 I、 Cu2+、 Ga3+、 In3+、 C、 H、 P 和 33P。
7. 如权利要求 1-6 所述的化合物， 其中所述环多胺单元为具有式 Ia 的结构的四氮 杂环十二烷或具有式 Ib 的结构的四氮杂环十四烷，
式 Ia 式 Ib。
8. 如权利要求 1-7 所述的化合物， 其包含通过桥联单元连接的两个环多胺单元， 所述桥联单元选自 ：
(a) 式 II
其中 X ＝ (CH2)n、 (CH2CH2O)n 或 CH2OPhCH2 或 CO， 其中 n ＝ 1、 2 或 3， 并且 Ph ＝苯基， 其中 X 各自与环多胺单元共价结合 ； 并且 123 Z ＝卤素、 放射性卤素 (radiohalogen)( 例如 18F、 I) 或 H ； 并且 18 11 123 R ＝ H， 或如权利要求 4-6 所述的标记， 优选为荧光染料、 F、 C、 I 或被标记的取 其中所述标记优选为被标记的取代基 R2，代基，
其中
其任选地包含间隔基 (spacer)R1， 使得具有间隔基 R1 的被标记的取代基 R2 为
(b) 式 III 的取代苯系骨架 (scaffold) 式 III其中，
Y ＝ (CH2)n( 其中 n ＝ 1、 2 或 3)、 (CH2CH2O)m( 其中 m ＝ 0、 1、 2 或 3)、 O(CH2)pO( 其 中 p ＝ 1、 2、 3 或 4) 或 O( 彼此独立 )， 或其混合物，
并且， 123
Z ＝卤素、 放射性卤素 ( 例如 18F、 I) 或 H ； 并且
R 和 X 如上文对式 II 中所述 ；
(c) 式 IV 的金刚烷系骨架
式 IV
其中 X 和 R 如上文对式 II 所述 ； (d) 式 V( 具有 α- 氨基酸的肽骨架 ) 或式 Va( 具有 β- 氨基酸的肽骨架 ) 的肽系 式V27骨架
102137849 A CN 102137855
说明书24/40 页
式 Va
其中 m ＝ 1、 2、 3、 4、 5 或 6， 并且 R′＝彼此独立地与四氮杂环十二烷或四氮杂环十四烷连接的烷基或芳基桥 ； 并且 R 如对式 II 中所述。
9. 如权利要求 1-8 所述， 如表 1 或表 2 所示， 或者式 VI、 VII、 VIII 的化合物。
10. 如权利要求 1-9 所述的化合物用于结合磷脂酰丝氨酸的用途。
11. 如权利要求 1-9 所述的化合物用于凋亡显像的用途。
12. 如权利要求 10 或 11 所述的用途， 其利用正电子发射断层摄影 (PET)、 单光子 发射计算机断层摄影 (SPECT)、 磁共振显像 (MRI) 或光学显像。
13. 如权利要求 10-12 所述的用途， 其用于评价肿瘤状态， 或者患有肿瘤、 患有感 染和 / 或患有炎症的患者分别对抗肿瘤疗法、 抗感染疗法和 / 或抗炎疗法的反应。
14. 在患者的组织中检测肿瘤、 感染和 / 或炎症的方法， 其包括
(a) 向患者给药如权利要求 1-9 所述的化合物， 以及
(b) 测量所述化合物在所述组织中的量或浓度。
15. 合成如权利要求 1-9 所述的化合物的方法， 其中至少两个环多胺单元通过桥 联单元彼此共价结合。
16. 如权利要求 15 所述的方法， 其中所述桥联单元选自式 II、 III、 IV、 V、 Va。
17. 药物组合物， 其包含如权利要求 1-9 所述的化合物。
18. 如权利要求 17 所述的药物组合物， 其还包含合适的载体和 / 或添加剂。
19. 用于结合磷脂酰丝氨酸的药盒， 其包含权利要求 1-9 所述的化合物以及任选 存在的用于体外检测磷脂酰丝氨酸的缓冲液。
20. 如权利要求 1-9 所述的化合物或如权利要求 17 所述的药物组合物用于体内或 体外凋亡检测的用途。
表 1. 本发明的优选化合物 ： 所示的每种化合物包含至少两个通过桥联单元结合 的四氮杂环十二烷或四氮杂环十四烷形式的环多胺单元。 该桥联单元还可携带可检测标记 R， 所述可检测标记 R 可以为可任选地包含间隔基 R1 的被标记的取代基 R2。下文中给出的 任何给定的桥联单元可以与表格 ( 以粗线分隔 ) 相同部分所列的的 R1 和 R2 的任意组合相 结合。
此处显示优选化合物与 Zn2+ 络合。 但是所述化合物可以与本文所述的任何其它多 价 ( 特别是二价或三价 ) 金属离子或其混合物形成络合物。
表 2. 本发明的优选化合物 ： 所示的每种化合物包含至少两个通过桥联单元结合 的四氮杂环十二烷或四氮杂环十四烷形式的环多胺单元。该桥联单元还可携带残基 A。Z 为用于检测所述化合物的放射性卤素。 下文中给出的通过桥联单元结合的环多胺单元可与 表中的残基 A 和残基 Z 的任意组合相结合。
此处显示优选化合物与 Zn2+ 络合。 但是这些化合物可以与本文所述的任何其它多 价 ( 特别是二价或三价 ) 金属离子或其混合物形成络合物。
实施例a) 荧光标记的双 - 四氮杂环十二烷络合物的合成 a-1所用的全部溶剂均以无水 p.A.- 溶剂购买。硅胶 60(0.04-0.063μm， Fluka) 被 用于柱色谱纯化。使用半制备柱 SemiPrep， RP18e， 100-10mm(Merck)， 由 Agilent(1100 系列 )HPLC 进行制备 HPLC- 纯化。
化合物 4 的合成
将溴代化合物 2(22)(130mg， 254μmol) 和 1， 4， 7- 三 ( 叔丁氧羰基 ) 四氮杂环十二 烷 (3)(23)(295mg， 624μmol， 2.5eq.) 溶于 4ml 乙腈中， 并加入碳酸钾 (175mg， 1.27mmol)。 将该悬浮液在 40℃下搅拌 60h。 然后通过过滤除去碳酸钾， 并真空除去溶剂。 然后以 EtOAc/ 石油醚＝ 1 ∶ 1 作为洗脱液， 使用硅胶进行柱色谱纯化， 获得白色固体物质。
产率 ： 220mg(90％ )。
化合物 5 的合成
将双四氮杂环十二烷化合物 4(220mg， 170μmol) 溶于 1.4ml 的 50％ TFA 的二氯甲 烷溶液中， 并在室温下搅拌 3h。真空除去溶剂。未进行进一步纯化。
产率 ： 定量地。
化合物 6 的合成
将胺 5(8.3mg， 13.9μmol) 溶于 250μl 无水 DMF 中。将 5-/6- 羧基荧光素五氟苯 基酯 (24)(7.5mg， 13.9μmol) 也溶于无水 DMF 中， 并加入到 5 中。将该反应混合物在室温 下搅拌 16h。真空除去溶剂。在半制备 HPLC(A ＝ H2O， B ＝ ACN， 0.1％ TFA ； 5min 40％ B) 上 纯化粗产品。
MALDI-MS ： m/z ＝ 968.6(M+H+)， 990.6(M+Na+)( 理论值 967.55)。
化合物 1 的合成
将配体 6(1.1mg， 1.16μmol) 溶于 20μl 的 EtOH 和 23.1μl 的 0.1mol/lZn(NO3)2 水溶液 (2.31μmol) 中。将该溶液加热到 50℃， 持续 40 分钟。冻干后得到黄色固体物质。
产率 ： 100％
a-2 流式细胞计数 (FACS)
a-2.1 流式细胞计数方法学
流式细胞计数是用于计数和检测以单细胞流通过激光束的细胞的技术。 激光散射 器提供关于细胞特征的信息。前向散射 (FSC) 主要取决于细胞的大小， 而侧向散射 (SSC) 则用于测量细胞的粒度。此外， 如果细胞携带荧光染料， 可以检测各自的荧光信号。
流式细胞计数是广泛应用于细胞生物学的技术。特别是在细胞死亡机制的研究 中， 它是用于计数并区分凋亡细胞、 坏死细胞和健康细胞的标准操作。对于凋亡的检测， 使 用通常与绿色荧光染料结合的蛋白质膜联蛋白 V。 因为膜联蛋白 V 也可与坏死细胞相结合， 所以同时应用红色荧光核染剂碘化丙啶作为坏死标记。
以下显示了从使用膜联蛋白 V 和碘化丙啶的流式细胞计数操作中获得的所得荧 光示意图 (fluorescence diagram)。将绿色荧光的检测通道命名为 FL-1( 图 4)， 红色荧光 的检测通道命名为 FL-III( 图 4)。将细胞数量 ( 计数 ) 对 FL-I 强度的图称作直方图。样 品的荧光信号总是伴有低强度的第二信号 ( 在直方图左侧 )， 其为背景荧光。通过将红色 荧光对绿色荧光作图 (FL-I/FL-III- 图 ) 得到示意图， 其中可将细胞分成红色、 绿色以及红 色 + 绿色荧光细胞。将信号分选到四个象限区域 (Q1-Q4)( 图 4) 后， 在该示意图中表示出 用不同方法染色的细胞的百分比。
a-2.2 流式细胞计数分析
用星状孢子素处理用荧光素标记的双 - 四氮杂环十二烷化合物和四 - 四氮杂环 十二烷化合物染色的细胞以诱导凋亡 ( 图 5)。 绿色荧光信号表示与这些四氮杂环十二烷化 合物反应的细胞的数量。 FL-I/FL-III- 图显示大部分被染色的细胞不仅发出绿色荧光而且 发出红色荧光， 这表明除了四氮杂环十二烷化合物 ( 绿色 ) 外， 细胞还携带坏死标记物碘化 丙啶 ( 红色 )。
使 用 以 下 实 验 方 案， 用 DAKO Galaxy 流 式 细 胞 计 数 系 统 (DAKO GalaxyFlow Cytometry System) 进行 FACS 测量 ： 使 Jurkat- 细胞生长至密度为约 1×106 个细胞 /ml。 通过加入 1μmol/l 星状孢子素 (Stepczynska A 等人， Staurosporine and conventional anticancer drugs induce overlapping， yet distinct pathways of apoptosis and caspase activation， Oncogene(2001)20， 1193) 诱导凋亡。在 37 ℃下孵育 4h， 然后用冷 PBS- 缓冲液 (140mmol/lNaCl、 10mmol/l KCl、 6.4mmol/l Na2HPO4、 2mmol/l KH2PO4) 洗涤细胞， 并再次悬浮于冷 TES- 缓冲液 (5mmol/l TES、 145mmol/l NaCl) 中。将 100μl 缓冲液中 6 的 10 个细胞与 1μl 络合物 1 的 0.5mmol/l 水溶液在 37℃下孵育 15 分钟。然后将细胞用 500μl 的 TES- 缓冲液洗涤两遍， 并将细胞再次悬浮于 400μl 的 TES- 缓冲液中。 用 900μl 缓冲液稀释 100μl 探针， 并立即测量。为了与坏死区别开来， 在测量前直接加入 10μl 碘 化丙啶溶液 (250μg/ml)。
表 2. 利用碘化丙啶 (PI) 进行坏死鉴别， 通过膜联蛋白 V 和三种不同的 Zn(II)- 络 合物对经星状孢子素处理的 Jurkat 细胞进行凋亡检测的实例
表 2 中总结了利用碘化丙啶 (PI) 进行坏死鉴别， 通过膜联蛋白 V 和三种不同的 Zn(II)- 络合物对经星状孢子素处理的 Jurkat 细胞进行凋亡检测的实例。 该结果证明了这 三种 Zn(II)- 四氮杂环十二烷衍生物与膜联蛋白 V 的凋亡检测能力的平行性。
对未诱导的 Jurkat 细胞的 FACS 分析显示出极少的凋亡， 并因此显示出双 - 四氮 杂环十二烷化合物与活细胞极少结合。图 8 显示了化合物 1 的结果， 活细胞为 Q3 中的最大 组分， 占 82％； Q1 中有少量的凋亡细胞 (4％ ) ； Q2 和 Q4 中有坏死细胞 ( 共 14％ )。但在 Q3 中未观察到化合物 1 对活细胞的标记。对化合物 xx 获得了相同的结果。如果通过星状孢 子素诱导凋亡 ( 图 9)， 则可以观察到化合物 1 对凋亡细胞 (Q1 ＝ 12％ ) 和坏死细胞 (Q2 ＝ 42％ ) 的标记 ( 与化合物 xx 的结果相同 )。
在与膜联蛋白 V 的直接比较中， 证明双 - 四氮杂环十二烷表现出对一些凋亡细胞 和大多数坏死细胞的标记。图 10 显示例如化合物 AB 标记 Q2 中的凋亡细胞和 Q4 中的坏死 细胞， 而膜联蛋白 V 则标记 Q1 和 Q2 中的凋亡细胞。
通过经诱导的凋亡 Jurkat 细胞可以观察到， 双 - 四氮杂环十二烷化合物的多聚化 引起标记强度的增加， 而被标记细胞的百分比保持不变。图 11 显示了化合物 1( 二聚体＝ 两个四氮杂环十二烷单元 ) 和化合物 we( 四聚体＝四个四氮杂环十二烷单元 ) 的实例， 其 中四聚体的荧光强度中值为 130， 而二聚体的荧光强度中值为 56， 而被标记细胞的百分比 保持不变。
二价阳离子， 特别是 Zn2+ 的络合对于双 - 四氮杂环十二烷化合物的结合特异性是 重要的。这对于例如化合物 1 非常明显， 该化合物作为与 Zn2+ 的络合物表现出与被诱导的 Jurkat 细胞的良好结合 ； 但是如果没有络合 Zn2+， 则其几乎不与被诱导的 Jurkat 细胞结合 ( 参见图 12)。在化合物 we 中也观察到相同的效应， 但不如化合物 1 明显。
为 了 用 可 视 数 据 验 证 FACS 数 据 而 进 行 共 焦 显 微 镜 检 查。 也 对 Jurkat 细 胞 进 行 共 焦 显 微 镜 检 查， 并 通 过 将 106 个 细 胞 /ml 在 1μM 星 状 孢 子 素 中 孵 育 4h 来
诱 导 凋 亡 (Stepczynska A 等 人， Staurosporine and conventional anticancer drugs induce overlapping， yet distinct pathways of apoptosis and caspase activationOncogene(2001)20， 1193)。 同样在 TES- 缓冲液中进行这些实验。 为了进行化合 6 物结合， 在室温下将 10 个细胞 ( 用星状孢子素诱导的或未诱导的 ) 在含最终浓度为 5μM 的化合物的 100μL 冷 TES- 缓冲液中孵育 15min， 然后将细胞固定到聚赖氨酸涂覆的载玻片 上， 并用碘化丙啶 (PI) 短暂孵育。
用化合物 1 和 PI 对被诱导的细胞的孵育显示化合物 1 和 PI 被很好地摄入相同的 细胞中， 显示化合物 1 被摄入坏死细胞中 ( 图 13)。
用膜联蛋白 -V 和化合物 AB 对被诱导的细胞进行共孵育， 以使凋亡细胞显影。图14 显示了膜联蛋白 V 对凋亡细胞的绿膜染色 (green membranestaining)。来自化合物 AB 的红色标记将用膜联蛋白 V 染色的凋亡细胞共标记 (co-label)， 但是也显示对不能被膜联 蛋白 -V 检测的细胞的标记。这明确显示了化合物 AB 对凋亡细胞和坏死细胞的标记。
b) 放射性标记的双 - 四氮杂环十二烷络合物的合成 b-1 化合物 15 的合成根据文献 (25) 进行 2-[18F] 甲苯磺酸氟乙酯 12 的合成。将 18F- 甲苯磺酸氟乙酯 溶于 200μL 无水 DMF 中， 并加入 5mg K2CO3。加入在 10μL 无水 DMF 中的前体 11(2mg)， 并 将该溶液在 120℃下加热 30 分钟。将该反应混合物通过 RP18 HPLC。蒸发溶剂。放射化学 产率 ： 65％。
将 18F- 氟乙氧基 - 双 ( 四氮杂环十二烷 ) 溶于 50μL 的 ACN 中， 并加入 200μL 的 TFA。 10 分钟后， 在室温下除去溶剂。 将该反应混合物通过 RP18HPLC。 将脱保护的 18F- 氟乙 氧基 - 双 ( 四氮杂环十二烷 ) 溶于 100μL 的 PBS- 缓冲液中， 加入 10μL 的 1.5mM Zn(NO3)2 溶液， 并将该溶液在 70℃下加热 5min。用 400μL 的 PBS 稀释该混合物。放射化学产率 ： ＞ 50％ (d.c)。
b-2 化合物 19 的合成将 18F- 甲苯磺酸氟乙酯溶于 200μL 无水 DMF 中， 并加入 5mg K2CO3。加入在 10μL 无水 DMF 中的酚前体 16(2mg)， 并将该溶液在 120℃下加热 35 分钟。将该反应混合物经制 备 HPLC 纯化 ： SemiPrepRP-18e 柱 (100×10mm， Merck， Darmstadt， 德国 )， 梯 度： 100％水 (0.1％ TFA) 至 100％乙腈 (0.1％ TFA)， 流速 ： 8mL/min ； (tR ＝ 5.7min)。放射 化学产率 ： 77％。
将 18F- 氟乙氧基 -BOC- 双 ( 四氮杂环十二烷 )17 溶于 50μL 的 MeCN 中， 并加入 200μL 的 TFA。10 分钟后， 在室温下真空除去溶剂。将该反应混合物经制备 HPLC 纯化 ： SemiPrep RP-18e 柱 (100×10mm， Merck， Darmstadt， 德国 )， 梯度 ： 100％水 (0.1％ TFA) 至 100％乙腈 (0.1％ TFA)， 流速 ： 8mL/min ； (tR ＝ 1.7min)。将定量脱保护的 18 F- 氟乙氧基 - 双 ( 四氮杂环十二烷 ) 溶于 100μL 的 PBS- 缓冲液中， 加入 10μL 的 1.5mM Zn(NO3)2 溶液， 并将该溶液在 70℃下加热 5 分钟。用 400μL 的 PBS 稀释该混合物， 无需进
一步纯化即可使用。
b-3 生物分布和 PET 诊断
在雄性 Balb/c 小鼠 (6-8 周， 体重约 20g) 中进行生物分布。通过腹膜内注射放 线 菌 酮 (cycloheximid)(50μg/kg， 在 500μL PBS 中 ) 来 诱 导 肝 细 胞 凋 亡 (J.F.Tait， C.Smith， Z.Levashova， B.Patel， F.G.Blankenberg， J.Vanderheyden， J.Nucl.Med.2006， 47， 1546)。诱导肝细胞凋亡后第 1.5h 和第 3.5h 静脉内注射 18F- 标记的化合物 (1-2MBq， 在 100μL PBS 中 )。在 30min、 1h、 2h 和 3h 后进行器官分布。通过 γ 计数器测定 18F- 化 合物的量。
图 6 显示了化合物 19 在诱导肝细胞凋亡后 3.5h 时间点的生物分布数据。该化合物显示出早在注射后 30min 在凋亡肝脏中的积累， 并且该信号在长于 3h 内是稳定的。
使用辐射模型获得 PET 影像。在体重约 180g 的雄性哥本哈根大鼠的左上肢和右 上肢移植非激素依赖型 (hormone independent) 腺癌 ( 前列腺 )R3327-AT1。当左侧肿瘤 达到 3.5cm3 大小时， 用线性粒子加速器以 50Gy 的单剂量进行辐射， 而将右侧的肿瘤用作对 照。
在辐射前一天以及辐射后第 6 天和第 10 天静脉内注射 18F- 化合物 19(15-25MBq， 在约 200μL PBS 中 )， 并经 1h 动态 PET 测量进行 PET 采集。图 7 明确显示了与对照肿瘤相 比， 被辐射的肿瘤在第 6 天和第 10 天的化合物 19 的积累增加。
c) 放射性标记的四 - 四氮杂环十二烷络合物的合成
c-1 间接标记， 化合物 21 ：
根据化合物 15 和 19 进行放射性标记， 以得到化合物 22， 对于 [18F]- 甲苯磺酸氟 乙酯， 化合物 22 经衰变校正的总放射化学产率为 30％。
c-2 直接标记， 化合物 17 ：
化合物 20 的合成
将 化 合 物 16(25mg， 24μmol) 溶 于 另 外 的 100mL 干 燥 MeCN 中， 并加入碳酸钾 (10mg， 72μmol， 3eq.) 和乙二醇双甲苯磺酸酯 (100mg， 235μmol， 10eq.)。将该反应混合 物回流 16h。滤除碳酸钾， 并真空除去溶剂。将粗品经半制备 HPLC 纯化 (100％ H2O(0.1％ TFA) 至 80％ MeCN 在 0.1％三氟乙酸中的溶液， 8 分钟 )。真空除去溶剂后， 获得作为无色固 体的 19mg 产物 20， 产率为 67％。
分 析 HPLC ： Performance RP-18e 柱 (100×4.6mm ； MerckKGaA， Darmstadt， 德国 ) ； 溶剂梯度 ： 100％水 (0.1％三氟乙酸 ) 至 95％乙腈在 0.1％三氟乙酸中 的溶液， 5min， 流速 ： 4mL/min。
Rt( 分析 HPLC， λ ＝ 215， 254nm) ： 4.2min。
1H-NMR(500MHz ，DMSO-D6 ， 343K) ： δ ＝ 7.80-7.77(m ， 2H ，H-3 ， 3J2 ， 3 ＝ 8.2Hz) ； 7.49-7.45(m， 2H， H-3) ； 6.84-6.67(m， 3H， H-9， H-11) ； 4.35-4.31(m， 2H， H-7) ； 4.17-4.13(m， 2H， H-6) ； 3.74(bs， 4H， H-12) ； 3.49(bs ， 8H ， H-Cy4) ； 3.37-3.27(m， 16H ， H-Cy3， H-Cy2) ； 2.60(bs， 8H， H-Cy1) ； 2.42(s， 3H， H-1) ； 1.41(s， 18H， H-Boc3) ； 1.36(s， 36H， H-Boc3)ppm.
13C-NMR(500MHz ，DMSO-D6 ， 343K) ： δ ＝ 157.48(C-8) ； 155.31(C-Boc1) ； 154.30(C-Boc1) ； 144.42(C-5) ； 139.53(C-2) ； 137.47(C-10) ； 129.64(C-3) ； 127.08(C-4) ； 125.50(C-11) ； 114.94(C-9) ； 78.05(C-Boc2) ； 77.84(C-Boc2) ； 68.43(C-7) ； 65.20(C-6) ； 53.40(C-12) ； 48.28(C-Cy1 ， C-Cy3) ； 47.03(C-Cy2) ； 46.20(C-Cy4) ； 27.86(C-Boc3) ； 27.64(C-Boc3) ； 20.59(C-1)ppm.
化合物 17 的直接放射合成
将含水的 [18F] 氟化物 (1GBq) 上样到 QMA 短柱 (Waters) 上， 并用 5mgK2.2.2 在 0.95ml MeCN 中的溶液 +1mg K2CO3 在 50μl 水中的溶液洗脱到 Wheaton V- 小瓶中。 通过在 氮气流下在 120℃下加热 10min 来除去溶剂。加入无水 MeCN(1mL)， 并如前所述地蒸发。加 入前体 20(5mg) 在 500μL 无水 DMF 中的溶液。 在 130℃下加热 30min， 然后将该粗反应混合 物与 3mL H2O 混合， 并经制备 HPLC 纯化 ： SemiPrep RP-18e 柱 (100×10mm， Merck， Darmstadt， 德国 )， 梯度 ： 100％水 (0.1％ TFA) 至 100％乙腈 (0.1％ TFA)， 流速 ： 8mL/ min ； tR ＝ 5.7min。用 40ml 水稀释所收集的 HPLC 组分， 并固定到 Sep-Pak light C18 短柱 (Waters) 上， 将其用 5ml 水洗涤， 并用 2ml 乙醇洗脱以得到 340MBq 产品 (50 ％， 经衰变校 正； 放射化学纯度＞ 95％ TLC， ＞ 95％ HPLC)， 总合成时间为 60min。使用分析 HPLC 分析期 望的 F-18 标记的产品 ： Performance RP-18e 柱 (100-4.6mm ； Merck KGaA， Darmstadt， 德国 ) ； 溶剂梯度 ： 起始 100％水 (0.1％三氟乙酸 )-95％乙腈在 0.1％三氟乙酸 中的溶液， 5min， 流速 ： 4mL/min， 并通过在分析 HPLC 上与对应的非放射性 F-19 氟代标准品 一同进样来进行验证。
缩写
ACN- 乙腈 (acetonitril)
CF-PFPE-5-/6- 羧基荧光素五氟苯基酯
DCM- 二氯甲烷
DMF-N， N- 二甲基甲酰胺
EtOAc- 乙酸乙酯
EtOH- 乙醇
FACS- 荧光激活细胞分选
FITC- 荧光素
TES-[N-[ 三 ( 羟甲基 ) 甲基 ]-2- 氨基磺酸 ]
PI- 碘化丙啶
TFA- 三氟乙酸
参考文献
1.Blankenberg FG， Katsikis PD， Tait JF 等人， Increased localisation of Tc-99m hydrazino nicotinamide(HYNIC)labeled annexin V lipocortin in lymphatic tissue of animals treated with dexamethasone[ 摘要 ].J Nucl Med.1997 ； 38( 增刊 ) ： 268P.
2.Blankenberg FG， Katsikis PD， Tait JF 等人， In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death.Proc Natl Acad Sci USA.1998 ； 95 ： 6349-6354.
3.Koopman G， Reutelingsperger CP， Kuijten GA， Keehnen RM， Pals ST， van Oers MH.Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.Blood.1994 ； 84 ： 1415-1420.
4.Bohn H， Kraus W.Isolation and characterization of a new placenta specific protein(PP10).Arch Gynecol.1979 ； 227 ： 125-134.
5.Reutelingsperger CP， Hornstra G， Hemker HC.Isolation and partialpurification of a novel anticoagulant from arteries of human umbilical cord.Eur J Biochem.1985 ； 151 ： 625-629.
6.Rescher U， Zobiack N， Gerke V.Intact Ca(2+)-binding sites are required for targeting of annexin 1 to endosomal membranes in living HeLa cells.J Cell Sci.2000 ； 113 ： 3931-3938.
7.Boon JM， Smith BD.Facilitated phosphatidylcholine flip-flop across erythrocyte membranes using low molecular weight synthetic translocases.J Am Chem Soc.2001 ； 123 ： 6221-6226.
8.Andree HA， Stuart MC， Hermens WT， Reutelingsperger CP， Hemker HC， Frederik PM， Willems GM.J Biol Chem 1992 年 9 月 5 日 ； 267(25) ： 17907-12.
9.Tait JF， Gibson D， Fujikawa K.Phospholipid binding properties of human placental anticoagulant protein-I， a member of the lipocortin family.J Biol Chem.1989 ； 264 ： 7944-7949.
10.Swairjo MA， Concha NO， Kaetzel MA， Dedman JR， Seaton BA.Ca(2+)-bridging mechanism and phospholipid head group recognition in the membrane-binding protein annexin V.Nat Struct Biol.1995 ； 2： 968-974. 11.Tait JF ，Gibson DF ，Smith C.Measurement of the affinity and cooperativity of annexin V-membrane binding under conditions of low membrane occupancy.Anal Biochem.2004 ； 329 ： 112-119.
12.Nicolson DW， Thornberry NA.Caspases ： killer proteases.TIBS.1997 ； 22 ： 299-306.
13.Cohen GM.Caspases ： the executioners of apoptosis.J Biochem.1997 ； 326 ： 1-16.
14.Thornberry NA， Lazebnik Y.Caspases ： enemies within.Science.1998 ； 282 ： 1312-1316.
15.Haberkorn U， Kinscherf R， Krammer PH 等人， Investigation of a potential scintigraphic marker of apoptosis ： radioiodinated Z-Val-Ala-DL-Asp(o-methyl)-f luoromethylketone.Nucl Med Biol.2001 ； 28 ： 793-798.
16.Bauer C， Bauder-Wuest U， Mier W， Haberkorn U， Eisenhut M.Investigation 131 of I labelled Peptides as Caspases Substrates for Apoptosis Imaging.J Nucl Med 2005 ； 46 ： 1066-1074.
17.Kamp D， T.Sieberg and C.W.M.Haest， Biochemistry， 2001， 40， 9438.
18.Zweifach A， Biochem.J.， 2000， 349， 255.
19.Dachary-Prigent J ， J.M.Pasquet ， J.M.Freyssinet and A.T.Nurden ， Biochemistry， 1995， 34， 11625.
20.Hanshaw RG， E.J.O’ Neil， M.Foley， R.T.Carpenter and B.D.Smith， J.Mater. Chem.， 2005， 15， 2707.
21.Hanshaw RG ， C.Lakshmi ， T.N.Lambert ， J.R.Johnson and B.D.Smith ， ChemBioChem， 2005， 12， 2214.22.Lakshmi C， R.G.Hanshaw， B.D.Smith， Tetrahedron 2004， 60， 11307-11315.
23.Peng W 等人， Bioorg.Chem.2005， 33， 374-385.
24.Adamczyk M， Fishpaugh JR， Heuser KJ.Bioconjugate Chem.1997， 8， 253-255.
25.Wester HJ ， Herz M ， Weber W ， Heiss P ， Senekowitsch-Schmidtke R ， Schwaiger M ，Stocklin G.Synthesis and radiopharmacology of O-(2-[18F] fluoroethyl)-L-tyrosine for tumor imaging.J Nucl Med 1999Jan ； 40(1) ： 205-12.
26.Bauer C， Bauder-Wuest U， Mier W， Haberkorn U， Eisenhut M.Investigation 131 of I labelled Peptides as Caspases Substrates for Apoptosis Imaging.J Nucl Med 2005 ； 46 ： 1066-1074.
27.Chunfu Z， Jugold M， Woenne EC， Lammers T， Morgenstern B， Mueller MM， Zentgraf H， Bock M， Eisenhut M， Semmler W， and Kiessling f.Specific Targeting of Tumor Angiogenesis by RGD-Conjugated Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide Particles Using a Clinical 1.5-T Magnetic Resonance Scanner.Cancer Res 2007 ； 67 ： 1555-1562.
28.Eisenhut M.， U.Haberkorn.Invited perspective ： The molecular position of radiolabels and its impact on functional integrity of proteins.J Nucl Med 2006 ； 47 ： 1400-1402.
29.GB Saha(Editor) ， Basics of PET Imaging-Physics ， Chemistry ， and Regulations， Springer New York 2005，第 6 章 ： Cyclotron and Production of PET Radionuclides).
30.Graham Lappin， Simon Temple， Radiotracers in Drug Development， CRC Taylor&Francis 2006， 第 12.1.5 章 Choice of radionuclide for Gamma Scintigraphy and SPECT
31.Kanduc D 等人， Cell death ： apoptosis versus necrosis(review)， Int J Oncol(2002)21 ： 165-70.