一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010524914.X	申请日：	2010.10.29
公开号：	CN101974493A	公开日：	2011.02.16
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	专利实施许可合同备案的生效IPC(主分类):C12N 9/00合同备案号:2016990000290让与人:东华大学受让人:广东柏堡龙股份有限公司发明名称:一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用申请日:20101029申请公布日:20110216授权公告日:20120829许可种类:独占许可备案日期:20160720\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/00申请日:20101029\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N9/00; C12N9/42; C12N9/26; C12N9/20; C12N9/50; D06M16/00; C12S11/00; C12R1/885(2006.01)N; D06M101/06(2006.01)N	主分类号：	C12N9/00
申请人：	东华大学
发明人：	洪枫; 唐绿蓉; 杨光
地址：	201620 上海市松江区松江新城人民北路2999号
优先权：
专利代理机构：	上海泰能知识产权代理事务所 31233	代理人：	黄志达;谢文凯
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内容摘要

本发明涉及一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用，该复合酶组分包括：纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力；其制备方法，包括：将里氏木霉种子接种到种子培养基于25～30℃，120～250r/min条件下培养24～48小时，以4～10％接种量转接至含1～10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中可以通过添加棉籽壳进一步诱导产酶，在25～30℃，120～250r/min条件下培养4～8天，过滤，离心得粗酶。本发明制得的复合酶具有较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，而且安全环保，操作简单，可控性强，相比常规的碱处理反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。

权利要求书

1：一种可降解棉籽壳的复合酶，其组分主要包括：纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、脂肪酶以及蛋白酶；所述的复合酶由以下方法制得，包括：将里氏木霉种子接种到种子培养基于 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 24 ～ 48 小时，以 4 ～ 10％接种量转接至含 1 ～ 10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基 1 ～ 2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 4 ～ 8 天，过滤，离心得粗酶液；其中，种子培养基包含： 1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N 的 Vogel 培养基， pH5.0 ；或者是包含 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；发酵培养基包含： 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03％ MgSO4·7H2O， 0.0005％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。
2：如权利要求 1 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括：里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备将里氏木霉种子接种到种子培养基于 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 24 ～ 48 小时，以 4 ～ 10％接种量转接至含 1 ～ 10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基 1 ～ 2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 4 ～ 8 天，过滤，离心得粗酶液；其中，种子培养基包含： 1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N 的 Vogel 培养基， pH5.0 ；或者是包含 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；发酵培养基包含： 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03％ MgSO4·7H2O， 0.0005％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。
3：如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：所述的棉籽壳为 40 目筛截留下的，目数小于 40 目。 4. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。 2 5. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基包含： 0.1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ smedium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03 ％尿素， 0.04 ％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037 ％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。 6. 如权利要求 1 所述的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括：用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳在 10mL 粗酶液原液或者经 1 ～ 8 倍稀释的酶液中，加入 1g 棉籽壳，在 pH3.0-5.0、 40-60℃、 100-200rpm 条件下水浴振荡反应 10h。
4： 8-5.0 ；发酵培养基包含： 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03％ MgSO4·7H2O， 0.0005％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。 2. 如权利要求 1 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括：里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备将里氏木霉种子接种到种子培养基于 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 24 ～ 48 小时，以 4 ～ 10％接种量转接至含 1 ～ 10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基 1 ～ 2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 4 ～ 8 天，过滤，离心得粗酶液；其中，种子培养基包含： 1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N 的 Vogel 培养基， pH5.0 ；或者是包含 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；发酵培养基包含： 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03％ MgSO4·7H2O， 0.0005％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。 3. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：所述的棉籽壳为 40 目筛截留下的，目数小于 40 目。 4. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。 2 5. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基包含： 0.1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ smedium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03 ％尿素， 0.04 ％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037 ％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。 6. 如权利要求 1 所述的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括：用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳在 10mL 粗酶液原液或者经 1 ～ 8 倍稀释的酶液中，加入 1g 棉籽壳，在 pH3.0-5.0、 40-60℃、 100-200rpm 条件下水浴振荡反应 10h。
5： 0 ；或者是包含 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；发酵培养基包含： 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03％ MgSO4·7H2O， 0.0005％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。 2. 如权利要求 1 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括：里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备将里氏木霉种子接种到种子培养基于 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 24 ～ 48 小时，以 4 ～ 10％接种量转接至含 1 ～ 10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基 1 ～ 2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 4 ～ 8 天，过滤，离心得粗酶液；其中，种子培养基包含： 1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N 的 Vogel 培养基， pH5.0 ；或者是包含 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；发酵培养基包含： 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03％ MgSO4·7H2O， 0.0005％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。 3. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：所述的棉籽壳为 40 目筛截留下的，目数小于 40 目。 4. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。 2 5. 如权利要求 2 所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基包含： 0.1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ smedium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0 ；或者是包含 0.1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03 ％尿素， 0.04 ％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037 ％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。
6：如权利要求 1 所述的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括：用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳在 10mL 粗酶液原液或者经 1 ～ 8 倍稀释的酶液中，加入 1g 棉籽壳，在 pH3.0-5.0、 40-60℃、 100-200rpm 条件下水浴振荡反应 10h。

说明书

一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用
    技术领域本发明属于微生物技术中复合酶的发酵制备及其应用领域，特别涉及一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用。
     背景技术棉籽壳的化学成分、颜色和形态不同于棉纤维与织物，影响染色的均匀度以及织物的手感和外观，在进行织物的染色和整理前必须去除。但是棉籽壳的结构致密、成分复杂，是棉织物精练工艺中最难去除的非纤维素杂质。与棉纤维中其它杂质相比，它的降解通常需要更为剧烈的处理条件和更长的时间，因此如何去除棉织物表面的棉籽壳一直是染整工作中的难题。
     当前为了应对我国传统工业转型和节能减排的低碳经济要求，纺织工业正在发展棉织物生物酶精练的新型前处理工艺。棉籽壳的去除是实现棉织物酶精练工艺大规模工业化的关键。棉纤维共生物和棉籽壳的化学成分复杂，而酶具有高度底物催化专一性，不同种类的酶只能降解不同的杂质组分。应用酶对棉织物进行精练，单一酶制剂难以完成棉籽壳
     的降解，难以达到理想的去除率和精练效果，因此需要筛选找到最适于降解某一组分的酶，再将这些酶进行复配，同时确保在同一条件下复合酶体系中不同的酶能发挥各自的功效，才能利用多种酶制剂的协同复合作用促进棉籽壳的降解和去除。研究表明纤维素酶和木聚糖酶对棉织物中的棉籽壳有一定的降解作用。通过研究可知棉籽壳由外表皮层、外色素层、无色层、栅栏层和内色素层组成；外表皮层均匀地分布着角质 ( 类脂物 )，此外纤维素、半纤维素、木质素 ( 芳环类、多酚类 ) 和果胶也是外表皮层的主要成分；栅栏层主要以果胶、半纤维素和木质素为主；内色素层和外色素层在结构和化学成分上相同，主要以带有酚羟基类化合物的木质素为主。化学组分上主要包含纤维素 ( 约 37％ )、果胶和木聚糖等半纤维素 ( 约 25％ )、木质素 ( 约 29％ )，此外还含有灰分 ( 约 3％ )、少量蛋白质以及脂类等化学物质。在棉籽壳的三大化学组分中，木聚糖等半纤维素通常与木质素之间存在化学键，构成了木质素——碳水化合物复合体 (LCC)，木聚糖酶可以去除棉籽壳中的木聚糖，从而破坏 LCC 结构，有助于溶出木质素，而少量的纤维素酶也有助于降解棉籽壳中的纤维素，最终起到软化棉籽壳，利于在水洗中去除棉籽壳。
     目前的关键问题是，虽然许多学者和机构采用了将单一纯酶复配以提高棉籽壳的降解，譬如将纤维素酶和木聚糖酶复配，或将木聚糖酶与果胶酶复配，但是仍旧但不到理想的棉籽壳去除和精练效果。这是因为棉籽壳是一种含有包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶、角质、蛋白质以及灰分等复杂成分的复合物，酶的高度底物催化专一特性使得不同种类的酶只能降解各自不同的杂质组分。即使采用了酶的复配技术，由于不同生物来源的酶的特性不同，催化条件差异很大，再加上各种酶的配比很难掌握，因此达不到最佳协同处理效果。不同酶的活力及使用效果与使用条件有相当大的关系。不同酶的最适反应 pH 值和温度以及稳定 pH 值和温度等都各有不同，在同一条件下，发挥复合酶中各种酶的活力，确保在同一条件下复合酶体系中不同的酶能发挥各自的功效，是该工艺的一个技术难点。自然界中某些微生物自身就能独立完成包括棉籽壳在内的复杂木质纤维素类物质的降解，因此筛选找到最适于降解棉籽壳的微生物，并通过发酵调控获得最佳的复合酶系以用于棉籽壳的降解是一条很好的途径。该技术能确保在同一催化反应条件下复合酶体系中不同的酶能充分和稳定地发挥各自的功效，利用各酶的协同复合作用来高效催化水解棉籽壳。里氏木霉能同时合成多种降解木质纤维素酶类，因此本发明提出诱导该菌发酵产酶并对该酶系中各种酶活进行调控以利于棉籽壳的降解。
     采用高效生物催化剂群为主体的酶处理工艺替代传统的化学处理工艺，可以显著降低水耗、能耗，废水量显著减少并且容易处理；节省染料并获得更稳定的染色效果；织物的柔软度更好、强度更高；操作更加安全和简便；由于用量少，在使用成本上也具有竞争力，因而成为纺织工业清洁生产技术的未来发展方向。发明内容
     本发明所要解决的技术问题是提供一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用，本方法制得的复合酶具有较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，而且安全环保，操作简单，可控性强，相比常规的碱处理反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。
     本发明的一种可降解棉籽壳的复合酶，其组分主要包括：纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶，以及少部分脂肪酶、蛋白酶等；所述的复合酶由以下方法制得，包括：
     将里氏木霉种子接种到种子培养基于 25 ～ 30 ℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 24 ～ 48 小时，以 4 ～ 10％接种量转接至含 1 ～ 10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基 1 ～ 2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/ min 条件下培养 4 ～ 8 天，过滤，离心得粗酶液；
     其中，种子培养基包含： 1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N 的 Vogel 培养基， pH5.0，或者是包含 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015 ％ Tween 80， 0.14 ％ (NH4)2SO4， 0.2 ％ KH2PO4， 0.03 ％尿素， 0.04 ％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；
     发酵培养基包含： 0.1 ～ 1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0，或者是含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14％ (NH4)2SO4， 0.2％ KH2PO4， 0.03％尿素， 0.04％ CaCl2·2H2O， 0.03％ MgSO4·7H2O， 0.0005％ FeSO4·7H2O， 0.00016％ MnSO4·H2O， 0.00014％ ZnSO4·7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0。
     本发明的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括：里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备
     将里氏木霉种子接种到种子培养基于 25 ～ 30 ℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 24 ～ 48 小时，以 4 ～ 10％接种量转接至含 1 ～ 10％棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基 1 ～ 2％的棉籽壳进一步诱导产酶，在 25 ～ 30℃， 120 ～ 250r/min 条件下培养 4 ～ 8 天，过滤，离心得粗酶液；
     所述的里氏木霉种子是里氏木霉 Rut C30(Trichoderma reesei Rut C30)，购自美国 ATCC，编号 ATCC 56765，其种子培养基包含： 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N 的 Vogel 培养基， pH5.0，或者是包含 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015 ％ Tween 80， 0.14 ％ (NH4)2SO4， 0.2 ％ KH2PO4， 0.03 ％尿素， 0.04 ％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4·7H2O， 0.0005 ％ FeSO4·7H2O， 0.00016 ％ MnSO4·H2O， 0.00014 ％ ZnSO4·7H2O， 0.00037 ％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；
     所述的里氏木霉产酶发酵培养基包含： 0.1 ～ 1 ％葡萄糖， 0.1 ～ 1 ％蛋白胨， 0.05％柠檬酸， 0.015％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH5.0，或者是含 0.1 ～ 1％葡萄糖， 0.1 ～ 1％蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.015％ Tween 80， 0.14 ％ (NH4)2SO4， 0.2 ％ KH2PO4， 0.03 ％尿素， 0.04 ％ CaCl2·2H2O， 0.03 ％ MgSO4· 7H2O， 0.0005％ FeSO4· 7H2O， 0.00016％ MnSO4· H2O， 0.00014％ ZnSO4· 7H2O， 0.00037％ CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 1 ～ 10％棉籽壳， pH4.8-5.0 ；
     发酵培养基中优选以 0.1％葡萄糖加上 1 ～ 10％棉籽壳是最佳的速效碳与诱导物的产酶碳源配比。所述的棉籽壳是购自山东聊城，风干后经过粉碎机粉碎，用筛子将棉籽壳与棉短绒分离，收集小于 40 目的棉籽壳颗粒；
     所述的在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。
     测定纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力
     ①纤维素酶活力测定
     (a) 粗酶液中还原糖的测定： 0.2mL 粗酶液 +0.8mL 蒸馏水 +3mL 3， 5- 二硝基水杨酸 (DNS)，沸水浴 5min，冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD1 ；
     (b) 粗酶液与羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 反应后总还原糖的测定： 0.2mL 粗酶液 +0.8mL 1 ％ CMC-Na 溶液 ( 用 50mM， pH4.8 的醋酸缓冲液配制 )， 50 ℃水浴 10min 后加入 3mLDNS，沸水浴 5min ；冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD2 ；
     (c)ΔOD ＝ OD2-OD1， 1 个酶活力单位 (1U) 定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生
     1μmol 还原糖 ( 以葡萄糖计 ) 的酶量，式中， K 为葡萄糖标准曲线斜率， N 为稀释倍数， 1000 为 mg 转化为 μg 的系数， 180 为葡萄糖的分子量， 10 为反应时间 (min)。
     ②果胶酶酶活的测定
     (a) 底物空白： 0.2mL 0.1M 柠檬酸缓冲液 (pH5.0)+0.8mL 5g/L 果胶 +3mLDNS，沸水煮 5min，冷却加水至 25mL， 550nm 测吸光值，记为 OD1 ；
     (b) 酶液空白： 0.2mL 酶液 +0.8mL 缓冲液 +3mLDNS，沸水煮 5min，冷却加水至 25mL， 550nm 测吸光值，记为 OD2 ；
     (c) 反应液： 0.2mL 酶液 +0.8mL 果胶；
     (d)50 ℃水浴 60min，然后迅速加入 3mLDNS，沸水煮沸 5min，冷却后加水至 25mL，550nm 处测吸光值，记为 OD3 ；
     (e)ΔOD ＝ OD3-OD2-OD1，一个果胶酶活力单位 (U) 定义为每分钟生成 1μmol D- 半乳糖醛酸所需的酶量。
     式中： K 为 D- 半乳糖醛酸标准曲线斜率， N 为稀释倍数， 1000 为 mg 转化为 μg 的系数， 212 为 D- 半乳糖醛酸的分子量， 60 为反应时间 ( 分钟 )。
     ③木聚糖酶活测定
     (a) 在 25mL 刻度试管中加入 0.5mL 适当稀释的酶液和 1mL 用 0.1M(pH4.8) 柠檬酸配制的 1％ (w/v) 燕麦木聚糖 (Sigma 公司制造 ) 溶液；每个酶样至少做 3 个不同的稀释度，使反应条件下测得的木糖量在 2mg 左右；
     (b)50℃保温 30min ；
     (c) 加 DNS 试剂 3mL，沸水中煮 5min，冷却后加水至 25mL，混匀后在 550nm 测吸光值，每次应做有酶无底物和有底物无酶的空白试验；
     (d) 根据木糖标准曲线，找出反应所产生的木糖量 ( 扣除空白值 ) ；
     (e) 在半对数坐标纸上，查找释放 2mg 木糖所需要的酶量，按下式计算酶活力：
     一个木聚糖酶活力单位 (U) 定义为每分钟生成 1μmol 木糖所需的酶量。
     ④发酵液残糖测定
     (a) 粗酶液中还原糖的测定： 0.4mL 粗酶液 +0.6mL 蒸馏水 +3mL 3， 5- 二硝基水杨酸 (DNS)，沸水浴 5min，冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD1 ；
     (b)1mL 蒸馏水 +3mLDNS，沸水浴 5min，冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD2 ；
     (c)ΔOD ＝ OD1-OD2，根据葡萄标准曲线，计算出发酵液中还原糖的量。
     本发明提供的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括，用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳
     (a) 用已烘干至恒重的陶瓷坩埚，质量为 G0，装入一定量的棉籽壳颗粒 ( 小于 40 目 ) 后称重，质量记为 G1， 105℃烘至恒重，在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为 G2。
     (b) 在 10mL 获得的粗酶液原液或者经 1 ～ 8 倍稀释的酶液中，加入 1g 棉籽壳，在 pH3.0-5.0、 40-60℃、 100-200rpm 条件下水浴振荡反应 10h，每隔 1 小时取样测酶解液中还原糖的量。
     棉籽壳中含纤维素约 37 ％，半纤维素约 25 ％，因此还原糖理论总量为水解前的棉籽壳质量 ×62 ％，还原糖得率＝水解后水解液中还原糖的总量 (g)/ 还原糖理论总量 (g)×100 ％。(c) 水解 10h 后，用已烘至恒重的 G3 玻砂坩埚质量记为 M1，收集酶解残渣，
     105℃烘至恒重，取出在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为 M2，计算棉籽壳水解率。以仅用缓冲液处理的做参照。
     a％为棉籽壳的含水率， m 为棉籽壳水解前的质量。本发明针对棉籽壳中各种成分，以棉籽壳为原料对菌种进行诱导产酶，获得可降解棉籽壳中多组分的复合酶并以多酶协同作用以达到最优的降解效果。本发明中里氏木霉木聚糖酶等半纤维素酶的产量较高，且能产生纤维素酶和果胶酶，可以通过调节产酶培养基中的碳氮比和葡萄糖与棉籽壳的比例进而调控纤维素酶和木聚糖酶的活力比例，达到最佳降解棉籽壳的效果。
     有益效果
     本发明利用方便易得且价格低廉的棉籽壳为原料诱导里氏木霉生产水解棉籽壳的复合酶系。通过对发酵原料及其各成分配比的控制，生产出适合于水解棉籽壳的混合酶，并用生产的酶水解棉籽壳，为纺织工业中去除棉籽壳提供新的思路和途径。利用发酵制得的粗酶液处理棉籽壳，比常规的碱处理反应条件温和；对环境友好。本方法可得到较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，与复配的市售商品酶相比，该复合酶降解棉籽壳效果
     显著，而且安全环保，操作简单，可控性强。附图说明
     图 1 是实施例 1-3 中纤维素酶活力测定结果；
     图 2 是实施例 1-3 中果胶酶活力测定结果；
     图 3 是实施例 1-3 中木聚糖酶活力测定结果；
     图 4 是实施例 1-3 中发酵液残糖变化；
     图 5 是实施例 1-3 获得的粗酶液水解棉籽壳生成还原糖浓度的变化；
     其中，图 1-5 中， ( ◆ ) 代表实施例 1， ( ■ ) 代表实施例 2， ( ▲ ) 代表实施例 3。具体实施方式
     下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
     实施例 1
     1. 里氏木霉的种子培养
     (1) 里氏木霉种子培养基： 1 ％葡萄糖， 0.1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2 ％ Vogel’ s medium N(125g/L 二水柠檬酸钠， 250g/LKH2PO4， 100g/LNH4NO3， 10g/LMgSO4·7H2O， 250μg/L 生物素， 5g/L CaCl2·2H2O， 5mL/L 微量元素溶液 ) ；其中，微量元素溶液含 50g/L 一水柠檬酸， 50g/L ZnSO4·7H2O， 10g/L Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O， 2.5g/ LCuSO4·5H2O， 0.5g/L MnSO4·H2O， 0.5g/L H3B03， 0.5g/L Na2MoO4·2H2O ；
     (2) 以里氏木霉 (T.reesei)Rut C30 为生产菌株，在 pH5.0， 30℃， 200r/min 条件下培养 36h。
     2. 里氏木霉发酵产酶
     (1) 里氏木霉产酶培养基： 0.1 ％葡萄糖， 0.1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 2％棉籽壳， pH5.0 ；
     (2) 以 10％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在 28℃， 160r/min 条件下培养 8d 发酵产酶；
     (3) 过滤或离心收集的发酵液清液就是降解棉籽壳复合酶液。
     3. 纤维素酶活力测定
     (1) 粗酶液中还原糖的测定： 0.2mL 粗酶液 +0.8mL 蒸馏水 +3mL 3， 5- 二硝基水杨酸 (DNS)，沸水浴 5min，冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD1 ；
     (2) 粗酶液与羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 反应后总还原糖的测定： 0.2mL 粗酶液 +0.8mL1％ CMC-Na 溶液 ( 用 50mM， pH4.8 的醋酸缓冲液配制 )， 50℃水浴 10min 后加入 3mL DNS，沸水浴 5min ；冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD2 ；
     (3)ΔOD ＝ OD2-OD1， 1 个酶活力单位 (1U) 定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生 1μmol 还原糖 ( 以葡萄糖计 ) 的酶量，
     式中， K 为葡萄糖标准曲线斜率， N 为稀释倍数 (5 倍 )， 1000 为 mg 转化为 μg 的系数， 180 为葡萄糖的分子量， 10 为反应时间 (min)。
     4. 果胶酶酶活的测定
     (1) 底物空白： 0.2mL0.1M 柠檬酸缓冲液 (pH5.0)+0.8mL 5g/L 果胶 +3mLDNS，沸水煮 5min，冷却加水至 25mL， 550nm 测吸光值，记为 OD1 ：
     (2) 酶液空白： 0.2mL 酶液 +0.8mL 缓冲液 +3mLDNS，沸水煮 5min，冷却加水至 25mL， 550nm 测吸光值，记为 OD2 ：
     (3) 反应液： 0.2mL 酶液 +0.8mL 果胶
     (4)50 ℃水浴 60min，然后迅速加入 3mLDNS，沸水煮沸 5min，冷却后加水至 25mL， 550nm 处测吸光值，记为 OD3。
     (5)ΔOD ＝ OD3-OD2-OD1，一个果胶酶活力单位 (U) 定义为每分钟生成 1μmol D- 半乳糖醛酸所需的酶量。
     式中： K 为 D- 半乳糖醛酸标准曲线斜率， N 为稀释倍数， 1000 为 mg 转化为 μg 的系数， 212 为 D- 半乳糖醛酸的分子量， 60 为反应时间 ( 分钟 )。
     5. 木聚糖酶活测定
     (1) 在 25mL 刻度试管中加入 0.5mL 适当稀释的酶液和 1mL 用 0.1M(pH4.8) 柠檬酸配制的 1％ (w/v) 燕麦木聚糖 (Sigma 公司制造 ) 溶液。每个酶样至少做 3 个不同的稀释度，使反应条件下测得的木糖量在 2mg 左右。
     (2)50℃保温 30min。
     (3) 加 DNS 试剂 3mL，沸水中煮 5min，冷却后加水至 25mL，混匀后在 550nm 测吸光值，每次应做有酶无底物和有底物无酶的空白试验。
     (4) 根据木糖标准曲线，找出反应所产生的木糖量 ( 扣除空白值 )。
     (5) 在半对数坐标纸上，查找释放 2mg 木糖所需要的酶量，按下式计算酶活力：
     一个木聚糖酶活力单位 (U) 定义为每分钟生成 1μmol 木糖所需的酶量。
     6. 发酵液残糖测定
     (1) 粗酶液中还原糖的测定： 0.4mL 粗酶液 +0.6mL 蒸馏水 +3mL 3， 5- 二硝基水杨酸 (DNS)，沸水浴 5min，冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD1 ；
     (2)1mL 蒸馏水 +3mLDNS，沸水浴 5min，冷却后加蒸馏水至 25mL， 550nm 处测得 OD2 ；
     (3)ΔOD ＝ OD1-OD2，根据葡萄标准曲线，计算出发酵液中还原糖的量。
     7. 粗酶液水解棉籽壳
     (1) 用已烘干至恒重的陶瓷坩埚，质量为 G0，装入一定量的棉籽壳后称重，质量记为 G1， 105℃烘至恒重，在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为 G2.
     (2) 将发酵获得的粗酶液用 0.1M 柠檬酸缓冲液 (pH5.0) 经适当稀释后，取 10mL 酶液，水解 1g 棉籽壳，在 pH5.0、 50℃、 100rpm 条件下水浴振荡反应 10h，每隔 1 小时取样测酶解液中还原糖的量。
     棉籽壳中含纤维素约 37 ％，半纤维素约 25 ％，因此还原糖理论总量为水解前的棉籽壳质量 ×62 ％，还原糖得率＝水解后水解液中还原糖的总量 (g)/ 还原糖理论总量 (g)×100 ％。(3) 水解 10h 后，用已烘至恒重的 G3 玻砂坩埚质量记为 M1，收集酶解残渣， 105℃烘至恒重，取出在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为 M2，计算棉籽壳水解率。以仅用缓冲液处理的做参照。
     a％为棉籽壳的含水率， m 为棉籽壳水解前的质量。
     实验结果见图 1- 图 4，在培养 2 天后，纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶几乎同步上升 ( 图 1- 图 3)，这说明因为培养基中可供直接利用的单糖比较少， 1 天后残糖几乎为零 ( 图 4)，产酶菌需要合成降解酶来利用较难消化的棉籽壳，棉籽壳含有纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，可以为产酶菌提供碳源。棉籽壳中纤维素的含量比较高，产酶菌利用其中的纤维素分泌出纤维素酶，酶活最高可达 3.63U/mL ；果胶在棉籽壳中含量不高，所以产酶菌分泌的果胶酶也不算很高，最大酶活出现在培养第 7 天，达 0.022U/mL ；在培养的前 4 天木聚糖酶活力急剧上升，在第 4 天达到最高值 3.55U/mL。
     实施例 2
     1. 里氏木霉的种子培养(1) 里氏木霉种子培养基： 1 ％葡萄糖， 0.1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N ；
     (2) 以里氏木霉 Rut C30 为生产菌种，在 pH5.0， 30℃， 200r/min 条件下培养 36h。
     2. 里氏木霉发酵产酶
     (1) 里氏木霉产酶培养基： 0.5 ％葡萄糖， 0.1 ％蛋白胨， 0.05 ％柠檬酸， 0.015 ％ Tween 80， 2％ Vogel’ s medium N，添加 2％棉籽壳， pH5.0 ；
     (2) 以 5％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在 30℃， 160r/min 条件下培养 8d 发酵产酶；
     (3) 过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。
     3. 纤维素酶活力测定，详见实施例 1。
     4. 木聚糖酶活力测定，详见实施例 1。
     5. 果胶酶活力测定，详见实施例 1。
     6. 发酵液残糖测定，详见实施例 1。
     7. 粗酶液水解棉籽壳，详见实施例 1。水解条件为：在 pH5.0、 50℃、 200rpm 条件下水浴振荡反应 10h，每隔 1 小时取样测酶解液中还原糖的量。实验结果见图 1- 图 4，实施例 2 比实施例 1 中速效碳 ( 葡萄糖 ) 浓度提高了 5 倍，但是两者的纤维素酶酶活相差不大 ( 图 1)，其果胶酶最大酶活为 0.017U/mL，木聚糖酶活力是 2.15U/mL。在整个培养产酶过程中，实施例 1 产的果胶酶和木聚糖酶活力均比实施例 2 大。
     实施例 3
     1. 里氏木霉的种子培养
     (1) 里氏木霉种子培养基： 10g/L 葡萄糖， 1g/L 蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.15g/L Tween 80， 1.4g/L(NH4)2SO4， 2.0g/L KH2PO4， 0.3g/L 尿素， 0.4g/ LCaCl2·2H2O， 0.3g/L MgSO4·7H2O， 0.005g/L FeSO4·7H2O， 0.0016g/L MnSO4·H2O， 0.0014g/ L ZnSO4·7H2O， 0.0037g/L CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；
     (2) 以里氏木霉 Rut C30 为生产菌种，在 pH5.0， 30℃， 200r/min 条件下培养 36h。
     2. 里氏木霉发酵产酶
     (1) 里氏木霉产酶培养基： 10g/L 葡萄糖， 1g/L 蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.15g/L Tween 80， 1.4g/L(NH4)2SO4， 2.0g/L KH2PO4， 0.3g/L 尿素， 0.4g/ LCaCl2·2H2O， 0.3g/L MgSO4·7H2O， 0.005g/L FeSO4·7H2O， 0.0016g/L MnSO4·H2O， 0.0014g/ L ZnSO4·7H2O， 0.0037g/L CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 2％棉籽壳， pH4.8-5.0 ；
     (2) 以 10％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在 28℃， 160r/min 条件下培养 8d 发酵产酶；
     (3) 过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。
     3. 纤维素酶活力测定，详见实施例 1。
     4. 木聚糖酶活力测定，详见实施例 1。
     5. 果胶酶活力测定，详见实施例 1。
     6. 发酵液残糖测定，详见实施例 1。
     7. 粗酶液水解棉籽壳，详见实施例 1。
     实验结果见图 1- 图 4，在发酵的前 6 天，实施例 3 产的纤维素酶比前两者都低 ( 图 1)，但是后期就相差不大了；在培养 2 天后，其果胶酶酶活力达到最大，为 0.026U/mL，均比实施例 1 和实施例 2 的高，发酵后期果胶酶趋于平缓，略有下降 ( 图 2)。木聚糖酶是三个实施例当中最低的，最高酶活为 1.76U/mL( 图 3)。这可能是由于实施例 3 中单糖浓度比较高， 4 天后培养基中残余葡萄糖浓度才几乎接近零 ( 图 4)，所以产酶菌不需要利用比较难消化的棉籽壳，从而使得纤维素酶和木聚糖酶的产量都比前两个实施例低。
     通过比较实施例 1 至实施例 3 的酶活结果可知 ( 见图 1、图 2 和图 3)，在里氏木霉培养基中添加棉籽壳可诱导发酵产生降解棉籽壳的复合酶系，用发酵产生的酶液水解棉籽壳，降解效果显著，水解率可达 8.1-20.4％ ( 表 1)，实施例 1 产的复合酶降解棉籽壳产生的还原糖浓度最高 ( 图 5) ；而未加棉籽壳发酵的粗酶液处理效果远不如诱导发酵产生的酶液。此外，发酵培养基中的碳氮比和葡萄糖与棉籽壳的比例也会影响到纤维素酶和木聚糖酶的产量，生产中可以根据需要调整碳氮比例以及葡萄糖与棉籽壳的比例以获得最佳的酶系。如表 1，初始糖浓比较低时 ( 实施例 1)，可以得到较高的木聚糖酶，降解棉籽壳的效果也最好。
     表 1 棉籽壳水解效果比较
     水解率 (％ ) 实施例 1 实施例 2 实施例 3
     还原糖得率 (％ ) 23.4 13.7 8.120.4 12.6 8.1实施例 4
     1. 里氏木霉的种子培养
     (1) 里氏木霉种子培养基： 10g/L 葡萄糖， 10g/L 蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.15g/L Tween 80， 1.4g/L(NH4)2SO4， 2.0g/L KH2PO4， 0.3g/L 尿素， 0.4g/ LCaCl2·2H2O， 0.3g/L MgSO4·7H2O， 0.005g/L FeSO4·7H2O， 0.0016g/L MnSO4·H2O， 0.0014g/ L ZnSO4·7H2O， 0.0037g/L CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基， pH4.8-5.0 ；
     (2) 以里氏木霉 Rut C30 为生产菌种，在 pH5.0， 25℃， 120r/min 条件下培养 24h。
     2. 里氏木霉发酵产酶
     (1) 里氏木霉产酶培养基： 10g/L 葡萄糖， 10g/L 蛋白胨，终浓度为 0.05M 的柠檬酸缓冲液， 0.15g/L Tween 80， 1.4g/L(NH4)2SO4， 2.0g/L KH2PO4， 0.3g/L 尿素， 0.4g/ LCaCl2·2H2O， 0.3g/L MgSO4·7H2O， 0.005g/L FeSO4·7H2O， 0.0016g/L MnSO4·H2O， 0.0014g/ L ZnSO4·7H2O， 0.0037g/L CoCl2·6H2O 的 Mandels 培养基，添加 2％棉籽壳， pH4.8-5.0 ；
     (2) 以 5％接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在 30℃， 250r/min 条件下培养 4d 发酵产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基 1 ～ 2％的棉籽壳进一步诱导产酶；
     (3) 过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。
     3. 纤维素酶活力测定，详见实施例 1。4. 木聚糖酶活力测定，详见实施例 1。 5. 果胶酶活力测定，详见实施例 1。 6. 发酵液残糖测定，详见实施例 1。 7. 粗酶液水解棉籽壳，详见实施例 1。

资源描述

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1、10申请公布号CN101974493A43申请公布日20110216CN101974493ACN101974493A21申请号201010524914X22申请日20101029C12N9/00200601C12N9/42200601C12N9/26200601C12N9/20200601C12N9/50200601D06M16/00200601C12S11/00200601C12R1/885200601D06M101/0620060171申请人东华大学地址201620上海市松江区松江新城人民北路2999号72发明人洪枫唐绿蓉杨光74专利代理机构上海泰能知识产权代理事务所31233代理人黄志达。

2、谢文凯54发明名称一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用57摘要本发明涉及一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用，该复合酶组分包括纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力；其制备方法，包括将里氏木霉种子接种到种子培养基于2530，120250R/MIN条件下培养2448小时，以410接种量转接至含110棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中可以通过添加棉籽壳进一步诱导产酶，在2530，120250R/MIN条件下培养48天，过滤，离心得粗酶。本发明制得的复合酶具有较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，而且安全环保，操作简单，可控性强，相比常规的碱处理反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。。

3、51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图2页CN101974497A1/2页21一种可降解棉籽壳的复合酶，其组分主要包括纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、脂肪酶以及蛋白酶；所述的复合酶由以下方法制得，包括将里氏木霉种子接种到种子培养基于2530，120250R/MIN条件下培养2448小时，以410接种量转接至含110棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基12的棉籽壳进一步诱导产酶，在2530，120250R/MIN条件下培养48天，过滤，离心得粗酶液；其中，种子培养基包含1葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN8。

4、0，2VOGELSMEDIUMN的VOGEL培养基，PH50；或者是包含1葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，PH4850；发酵培养基包含011葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN，添加110棉籽壳，PH50；或者是包含011葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，。

5、0015TWEEN80，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，添加110棉籽壳，PH4850。2如权利要求1所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备将里氏木霉种子接种到种子培养基于2530，120250R/MIN条件下培养2448小时，以410接种量转接至含110棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基12的棉籽壳进一步诱导产酶，在。

6、2530，120250R/MIN条件下培养48天，过滤，离心得粗酶液；其中，种子培养基包含1葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN的VOGEL培养基，PH50；或者是包含1葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，PH4850；发酵培养基包含011葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，00。

7、15TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN，添加110棉籽壳，PH50；或者是包含011葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，0015TWEEN80，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，添加110棉籽壳，PH4850。3如权利要求2所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于所述的棉籽壳为40目筛截留下的，目数小于40目。4如权利要求2所述的一种可降解棉。

8、籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。权利要求书CN101974493ACN101974497A2/2页35如权利要求2所述的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基包含01葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN，添加110棉籽壳，PH50；或者是包含01葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，0015TWEEN80，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FES。

9、O47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，添加110棉籽壳，PH4850。6如权利要求1所述的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳在10ML粗酶液原液或者经18倍稀释的酶液中，加入1G棉籽壳，在PH3050、4060、100200RPM条件下水浴振荡反应10H。权利要求书CN101974493ACN101974497A1/10页4一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用技术领域0001本发明属于微生物技术中复合酶的发酵制备及其应用领域，特别涉及一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和。

10、应用。背景技术0002棉籽壳的化学成分、颜色和形态不同于棉纤维与织物，影响染色的均匀度以及织物的手感和外观，在进行织物的染色和整理前必须去除。但是棉籽壳的结构致密、成分复杂，是棉织物精练工艺中最难去除的非纤维素杂质。与棉纤维中其它杂质相比，它的降解通常需要更为剧烈的处理条件和更长的时间，因此如何去除棉织物表面的棉籽壳一直是染整工作中的难题。0003当前为了应对我国传统工业转型和节能减排的低碳经济要求，纺织工业正在发展棉织物生物酶精练的新型前处理工艺。棉籽壳的去除是实现棉织物酶精练工艺大规模工业化的关键。棉纤维共生物和棉籽壳的化学成分复杂，而酶具有高度底物催化专一性，不同种类的酶只能降解不同的杂。

11、质组分。应用酶对棉织物进行精练，单一酶制剂难以完成棉籽壳的降解，难以达到理想的去除率和精练效果，因此需要筛选找到最适于降解某一组分的酶，再将这些酶进行复配，同时确保在同一条件下复合酶体系中不同的酶能发挥各自的功效，才能利用多种酶制剂的协同复合作用促进棉籽壳的降解和去除。研究表明纤维素酶和木聚糖酶对棉织物中的棉籽壳有一定的降解作用。通过研究可知棉籽壳由外表皮层、外色素层、无色层、栅栏层和内色素层组成；外表皮层均匀地分布着角质类脂物，此外纤维素、半纤维素、木质素芳环类、多酚类和果胶也是外表皮层的主要成分；栅栏层主要以果胶、半纤维素和木质素为主；内色素层和外色素层在结构和化学成分上相同，主要以带有酚。

12、羟基类化合物的木质素为主。化学组分上主要包含纤维素约37、果胶和木聚糖等半纤维素约25、木质素约29，此外还含有灰分约3、少量蛋白质以及脂类等化学物质。在棉籽壳的三大化学组分中，木聚糖等半纤维素通常与木质素之间存在化学键，构成了木质素碳水化合物复合体LCC，木聚糖酶可以去除棉籽壳中的木聚糖，从而破坏LCC结构，有助于溶出木质素，而少量的纤维素酶也有助于降解棉籽壳中的纤维素，最终起到软化棉籽壳，利于在水洗中去除棉籽壳。0004目前的关键问题是，虽然许多学者和机构采用了将单一纯酶复配以提高棉籽壳的降解，譬如将纤维素酶和木聚糖酶复配，或将木聚糖酶与果胶酶复配，但是仍旧但不到理想的棉籽壳去除和精练效果。

13、。这是因为棉籽壳是一种含有包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶、角质、蛋白质以及灰分等复杂成分的复合物，酶的高度底物催化专一特性使得不同种类的酶只能降解各自不同的杂质组分。即使采用了酶的复配技术，由于不同生物来源的酶的特性不同，催化条件差异很大，再加上各种酶的配比很难掌握，因此达不到最佳协同处理效果。不同酶的活力及使用效果与使用条件有相当大的关系。不同酶的最适反应PH值和温度以及稳定PH值和温度等都各有不同，在同一条件下，发挥复合酶中各种酶的活力，确保在同一条件下复合酶体系中不同的酶能发挥各自的功效，是该工艺的一个技术难点。说明书CN101974493ACN101974497A2/10页5000。

14、5自然界中某些微生物自身就能独立完成包括棉籽壳在内的复杂木质纤维素类物质的降解，因此筛选找到最适于降解棉籽壳的微生物，并通过发酵调控获得最佳的复合酶系以用于棉籽壳的降解是一条很好的途径。该技术能确保在同一催化反应条件下复合酶体系中不同的酶能充分和稳定地发挥各自的功效，利用各酶的协同复合作用来高效催化水解棉籽壳。里氏木霉能同时合成多种降解木质纤维素酶类，因此本发明提出诱导该菌发酵产酶并对该酶系中各种酶活进行调控以利于棉籽壳的降解。0006采用高效生物催化剂群为主体的酶处理工艺替代传统的化学处理工艺，可以显著降低水耗、能耗，废水量显著减少并且容易处理；节省染料并获得更稳定的染色效果；织物的柔软度更。

15、好、强度更高；操作更加安全和简便；由于用量少，在使用成本上也具有竞争力，因而成为纺织工业清洁生产技术的未来发展方向。发明内容0007本发明所要解决的技术问题是提供一种可降解棉籽壳的复合酶及其制备方法和应用，本方法制得的复合酶具有较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，而且安全环保，操作简单，可控性强，相比常规的碱处理反应条件温和，对环境友好，具有良好的应用前景。0008本发明的一种可降解棉籽壳的复合酶，其组分主要包括纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶，以及少部分脂肪酶、蛋白酶等；所述的复合酶由以下方法制得，包括0009将里氏木霉种子接种到种子培养基于2530，120250R/MIN条件下培养2448。

16、小时，以410接种量转接至含110棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基12的棉籽壳进一步诱导产酶，在2530，120250R/MIN条件下培养48天，过滤，离心得粗酶液；0010其中，种子培养基包含1葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN的VOGEL培养基，PH50，或者是包含1葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，0015TWEEN80，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，0000。

17、14ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，PH4850；0011发酵培养基包含011葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN，添加110棉籽壳，PH50，或者是含011葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，0015TWEEN80，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，添加110棉籽壳，P。

18、H4850。0012本发明的一种可降解棉籽壳的复合酶的制备方法，包括里氏木霉降解棉籽壳酶系的发酵制备0013将里氏木霉种子接种到种子培养基于2530，120250R/MIN条件下培养2448小时，以410接种量转接至含110棉籽壳的发酵培养基产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基12的棉籽壳进一步诱导产酶，在2530，120250R/说明书CN101974493ACN101974497A3/10页6MIN条件下培养48天，过滤，离心得粗酶液；0014所述的里氏木霉种子是里氏木霉RUTC30TRICHODERMAREESEIRUTC30，购自美国ATCC，编号ATCC56765，其种子培养基包含。

19、1葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN的VOGEL培养基，PH50，或者是包含1葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，0015TWEEN80，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，PH4850；0015所述的里氏木霉产酶发酵培养基包含011葡萄糖，011蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMED。

20、IUMN，添加110棉籽壳，PH50，或者是含011葡萄糖，011蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，0015TWEEN80，014NH42SO4，02KH2PO4，003尿素，004CACL22H2O，003MGSO47H2O，00005FESO47H2O，000016MNSO4H2O，000014ZNSO47H2O，000037COCL26H2O的MANDELS培养基，添加110棉籽壳，PH4850；0016发酵培养基中优选以01葡萄糖加上110棉籽壳是最佳的速效碳与诱导物的产酶碳源配比。0017所述的棉籽壳是购自山东聊城，风干后经过粉碎机粉碎，用筛子将棉籽壳与棉短绒分离，收集小于40。

21、目的棉籽壳颗粒；0018所述的在发酵培养基产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。0019测定纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力0020纤维素酶活力测定0021A粗酶液中还原糖的测定02ML粗酶液08ML蒸馏水3ML3，5二硝基水杨酸DNS，沸水浴5MIN，冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD1；0022B粗酶液与羧甲基纤维素钠CMCNA反应后总还原糖的测定02ML粗酶液08ML1CMCNA溶液用50MM，PH48的醋酸缓冲液配制，50水浴10MIN后加入3MLDNS，沸水浴5MIN；冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD2；0023CODOD2OD1，。

22、1个酶活力单位1U定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1MOL还原糖以葡萄糖计的酶量，式中，K为葡萄糖标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为MG转化为G的系数，180为葡萄糖的分子量，10为反应时间MIN。0024果胶酶酶活的测定0025A底物空白02ML01M柠檬酸缓冲液PH5008ML5G/L果胶3MLDNS，沸水煮5MIN，冷却加水至25ML，550NM测吸光值，记为OD1；0026B酶液空白02ML酶液08ML缓冲液3MLDNS，沸水煮5MIN，冷却加水至25ML，550NM测吸光值，记为OD2；0027C反应液02ML酶液08ML果胶；0028D50水浴60MIN，然后迅速加入3MLD。

23、NS，沸水煮沸5MIN，冷却后加水至25ML，说明书CN101974493ACN101974497A4/10页7550NM处测吸光值，记为OD3；0029EODOD3OD2OD1，一个果胶酶活力单位U定义为每分钟生成1MOLD半乳糖醛酸所需的酶量。00300031式中K为D半乳糖醛酸标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为MG转化为G的系数，212为D半乳糖醛酸的分子量，60为反应时间分钟。0032木聚糖酶活测定0033A在25ML刻度试管中加入05ML适当稀释的酶液和1ML用01MPH48柠檬酸配制的1W/V燕麦木聚糖SIGMA公司制造溶液；每个酶样至少做3个不同的稀释度，使反应条件下测得的木。

24、糖量在2MG左右；0034B50保温30MIN；0035C加DNS试剂3ML，沸水中煮5MIN，冷却后加水至25ML，混匀后在550NM测吸光值，每次应做有酶无底物和有底物无酶的空白试验；0036D根据木糖标准曲线，找出反应所产生的木糖量扣除空白值；0037E在半对数坐标纸上，查找释放2MG木糖所需要的酶量，按下式计算酶活力00380039一个木聚糖酶活力单位U定义为每分钟生成1MOL木糖所需的酶量。0040发酵液残糖测定0041A粗酶液中还原糖的测定04ML粗酶液06ML蒸馏水3ML3，5二硝基水杨酸DNS，沸水浴5MIN，冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD1；0042B1ML蒸。

25、馏水3MLDNS，沸水浴5MIN，冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD2；0043CODOD1OD2，根据葡萄标准曲线，计算出发酵液中还原糖的量。0044本发明提供的复合酶在水解棉籽壳中的应用，包括，用发酵获得的粗酶液水解棉籽壳0045A用已烘干至恒重的陶瓷坩埚，质量为G0，装入一定量的棉籽壳颗粒小于40目后称重，质量记为G1，105烘至恒重，在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为G2。00460047B在10ML获得的粗酶液原液或者经18倍稀释的酶液中，加入1G棉籽壳，在PH3050、4060、100200RPM条件下水浴振荡反应10H，每隔1小时取样测酶解液中还原糖的量。0048棉。

26、籽壳中含纤维素约37，半纤维素约25，因此还原糖理论总量为水解前的棉籽壳质量62，还原糖得率水解后水解液中还原糖的总量G/还原糖理论总量G100。C水解10H后，用已烘至恒重的G3玻砂坩埚质量记为M1，收集酶解残渣，说明书CN101974493ACN101974497A5/10页8105烘至恒重，取出在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为M2，计算棉籽壳水解率。以仅用缓冲液处理的做参照。0049A为棉籽壳的含水率，M为棉籽壳水解前的质量。0050本发明针对棉籽壳中各种成分，以棉籽壳为原料对菌种进行诱导产酶，获得可降解棉籽壳中多组分的复合酶并以多酶协同作用以达到最优的降解效果。本发明中里氏木霉木聚。

27、糖酶等半纤维素酶的产量较高，且能产生纤维素酶和果胶酶，可以通过调节产酶培养基中的碳氮比和葡萄糖与棉籽壳的比例进而调控纤维素酶和木聚糖酶的活力比例，达到最佳降解棉籽壳的效果。0051有益效果0052本发明利用方便易得且价格低廉的棉籽壳为原料诱导里氏木霉生产水解棉籽壳的复合酶系。通过对发酵原料及其各成分配比的控制，生产出适合于水解棉籽壳的混合酶，并用生产的酶水解棉籽壳，为纺织工业中去除棉籽壳提供新的思路和途径。利用发酵制得的粗酶液处理棉籽壳，比常规的碱处理反应条件温和；对环境友好。本方法可得到较高的酶活、更适合棉籽壳降解的复合酶体系，与复配的市售商品酶相比，该复合酶降解棉籽壳效果显著，而且安全环保。

28、，操作简单，可控性强。附图说明0053图1是实施例13中纤维素酶活力测定结果；0054图2是实施例13中果胶酶活力测定结果；0055图3是实施例13中木聚糖酶活力测定结果；0056图4是实施例13中发酵液残糖变化；0057图5是实施例13获得的粗酶液水解棉籽壳生成还原糖浓度的变化；0058其中，图15中，代表实施例1，代表实施例2，代表实施例3。具体实施方式0059下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的。

29、范围。0060实施例100611里氏木霉的种子培养00621里氏木霉种子培养基1葡萄糖，01蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN125G/L二水柠檬酸钠，250G/LKH2PO4，100G/LNH4NO3，10G/LMGSO47H2O，250G/L生物素，5G/LCACL22H2O，5ML/L微量元素溶液；其中，微量元素溶液含50G/L一水柠檬酸，50G/LZNSO47H2O，10G/LFENH42SO426H2O，25G/LCUSO45H2O，05G/LMNSO4H2O，05G/LH3B03，05G/LNA2MOO42H2O；00632以里氏木霉TREE。

30、SEIRUTC30为生产菌株，在PH50，30，200R/MIN条件下说明书CN101974493ACN101974497A6/10页9培养36H。00642里氏木霉发酵产酶00651里氏木霉产酶培养基01葡萄糖，01蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN，添加2棉籽壳，PH50；00662以10接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在28，160R/MIN条件下培养8D发酵产酶；00673过滤或离心收集的发酵液清液就是降解棉籽壳复合酶液。00683纤维素酶活力测定00691粗酶液中还原糖的测定02ML粗酶液08ML蒸馏水3ML3，5二硝基水杨酸DNS，沸水浴5M。

31、IN，冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD1；00702粗酶液与羧甲基纤维素钠CMCNA反应后总还原糖的测定02ML粗酶液08ML1CMCNA溶液用50MM，PH48的醋酸缓冲液配制，50水浴10MIN后加入3MLDNS，沸水浴5MIN；冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD2；00713ODOD2OD1，1个酶活力单位1U定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1MOL还原糖以葡萄糖计的酶量，00720073式中，K为葡萄糖标准曲线斜率，N为稀释倍数5倍，1000为MG转化为G的系数，180为葡萄糖的分子量，10为反应时间MIN。00744果胶酶酶活的测定00751底物空白02M。

32、L01M柠檬酸缓冲液PH5008ML5G/L果胶3MLDNS，沸水煮5MIN，冷却加水至25ML，550NM测吸光值，记为OD100762酶液空白02ML酶液08ML缓冲液3MLDNS，沸水煮5MIN，冷却加水至25ML，550NM测吸光值，记为OD200773反应液02ML酶液08ML果胶0078450水浴60MIN，然后迅速加入3MLDNS，沸水煮沸5MIN，冷却后加水至25ML，550NM处测吸光值，记为OD3。00795ODOD3OD2OD1，一个果胶酶活力单位U定义为每分钟生成1MOLD半乳糖醛酸所需的酶量。00800081式中K为D半乳糖醛酸标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为M。

33、G转化为G的系数，212为D半乳糖醛酸的分子量，60为反应时间分钟。00825木聚糖酶活测定00831在25ML刻度试管中加入05ML适当稀释的酶液和1ML用01MPH48柠檬酸配制的1W/V燕麦木聚糖SIGMA公司制造溶液。每个酶样至少做3个不同的稀释度，使反应条件下测得的木糖量在2MG左右。0084250保温30MIN。说明书CN101974493ACN101974497A7/10页1000853加DNS试剂3ML，沸水中煮5MIN，冷却后加水至25ML，混匀后在550NM测吸光值，每次应做有酶无底物和有底物无酶的空白试验。00864根据木糖标准曲线，找出反应所产生的木糖量扣除空白值。00。

34、875在半对数坐标纸上，查找释放2MG木糖所需要的酶量，按下式计算酶活力00880089一个木聚糖酶活力单位U定义为每分钟生成1MOL木糖所需的酶量。00906发酵液残糖测定00911粗酶液中还原糖的测定04ML粗酶液06ML蒸馏水3ML3，5二硝基水杨酸DNS，沸水浴5MIN，冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD1；009221ML蒸馏水3MLDNS，沸水浴5MIN，冷却后加蒸馏水至25ML，550NM处测得OD2；00933ODOD1OD2，根据葡萄标准曲线，计算出发酵液中还原糖的量。00947粗酶液水解棉籽壳00951用已烘干至恒重的陶瓷坩埚，质量为G0，装入一定量的棉籽壳后称。

35、重，质量记为G1，105烘至恒重，在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为G2009600972将发酵获得的粗酶液用01M柠檬酸缓冲液PH50经适当稀释后，取10ML酶液，水解1G棉籽壳，在PH50、50、100RPM条件下水浴振荡反应10H，每隔1小时取样测酶解液中还原糖的量。0098棉籽壳中含纤维素约37，半纤维素约25，因此还原糖理论总量为水解前的棉籽壳质量62，还原糖得率水解后水解液中还原糖的总量G/还原糖理论总量G100。3水解10H后，用已烘至恒重的G3玻砂坩埚质量记为M1，收集酶解残渣，105烘至恒重，取出在干燥器中平衡半小时，称重，质量记为M2，计算棉籽壳水解率。以仅用缓冲液处理的。

36、做参照。0099A为棉籽壳的含水率，M为棉籽壳水解前的质量。0100实验结果见图1图4，在培养2天后，纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶几乎同步上升图1图3，这说明因为培养基中可供直接利用的单糖比较少，1天后残糖几乎为零图4，产酶菌需要合成降解酶来利用较难消化的棉籽壳，棉籽壳含有纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，可以为产酶菌提供碳源。棉籽壳中纤维素的含量比较高，产酶菌利用其中的纤维素分泌出纤维素酶，酶活最高可达363U/ML；果胶在棉籽壳中含量不高，所以产酶菌分泌的果胶酶也不算很高，最大酶活出现在培养第7天，达0022U/ML；在培养的前4天木聚糖酶活力急剧上升，在第4天达到最高值355U/ML。。

37、0101实施例201021里氏木霉的种子培养说明书CN101974493ACN101974497A8/10页1101031里氏木霉种子培养基1葡萄糖，01蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN；01042以里氏木霉RUTC30为生产菌种，在PH50，30，200R/MIN条件下培养36H。01052里氏木霉发酵产酶01061里氏木霉产酶培养基05葡萄糖，01蛋白胨，005柠檬酸，0015TWEEN80，2VOGELSMEDIUMN，添加2棉籽壳，PH50；01072以5接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在30，160R/MIN条件下培养8D发酵产酶；01083。

38、过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。01093纤维素酶活力测定，详见实施例1。01104木聚糖酶活力测定，详见实施例1。01115果胶酶活力测定，详见实施例1。01126发酵液残糖测定，详见实施例1。01137粗酶液水解棉籽壳，详见实施例1。水解条件为在PH50、50、200RPM条件下水浴振荡反应10H，每隔1小时取样测酶解液中还原糖的量。0114实验结果见图1图4，实施例2比实施例1中速效碳葡萄糖浓度提高了5倍，但是两者的纤维素酶酶活相差不大图1，其果胶酶最大酶活为0017U/ML，木聚糖酶活力是215U/ML。在整个培养产酶过程中，实施例1产的果胶酶和木聚糖酶活力均比实施。

39、例2大。0115实施例301161里氏木霉的种子培养01171里氏木霉种子培养基10G/L葡萄糖，1G/L蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，015G/LTWEEN80，14G/LNH42SO4，20G/LKH2PO4，03G/L尿素，04G/LCACL22H2O，03G/LMGSO47H2O，0005G/LFESO47H2O，00016G/LMNSO4H2O，00014G/LZNSO47H2O，00037G/LCOCL26H2O的MANDELS培养基，PH4850；01182以里氏木霉RUTC30为生产菌种，在PH50，30，200R/MIN条件下培养36H。01192里氏木霉发酵产酶0。

40、1201里氏木霉产酶培养基10G/L葡萄糖，1G/L蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，015G/LTWEEN80，14G/LNH42SO4，20G/LKH2PO4，03G/L尿素，04G/LCACL22H2O，03G/LMGSO47H2O，0005G/LFESO47H2O，00016G/LMNSO4H2O，00014G/LZNSO47H2O，00037G/LCOCL26H2O的MANDELS培养基，添加2棉籽壳，PH4850；01212以10接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在28，160R/MIN条件下培养8D发酵产酶；01223过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。012。

41、33纤维素酶活力测定，详见实施例1。01244木聚糖酶活力测定，详见实施例1。01255果胶酶活力测定，详见实施例1。01266发酵液残糖测定，详见实施例1。01277粗酶液水解棉籽壳，详见实施例1。说明书CN101974493ACN101974497A9/10页120128实验结果见图1图4，在发酵的前6天，实施例3产的纤维素酶比前两者都低图1，但是后期就相差不大了；在培养2天后，其果胶酶酶活力达到最大，为0026U/ML，均比实施例1和实施例2的高，发酵后期果胶酶趋于平缓，略有下降图2。木聚糖酶是三个实施例当中最低的，最高酶活为176U/ML图3。这可能是由于实施例3中单糖浓度比较高，4天。

42、后培养基中残余葡萄糖浓度才几乎接近零图4，所以产酶菌不需要利用比较难消化的棉籽壳，从而使得纤维素酶和木聚糖酶的产量都比前两个实施例低。0129通过比较实施例1至实施例3的酶活结果可知见图1、图2和图3，在里氏木霉培养基中添加棉籽壳可诱导发酵产生降解棉籽壳的复合酶系，用发酵产生的酶液水解棉籽壳，降解效果显著，水解率可达81204表1，实施例1产的复合酶降解棉籽壳产生的还原糖浓度最高图5；而未加棉籽壳发酵的粗酶液处理效果远不如诱导发酵产生的酶液。此外，发酵培养基中的碳氮比和葡萄糖与棉籽壳的比例也会影响到纤维素酶和木聚糖酶的产量，生产中可以根据需要调整碳氮比例以及葡萄糖与棉籽壳的比例以获得最佳的酶系。

43、。如表1，初始糖浓比较低时实施例1，可以得到较高的木聚糖酶，降解棉籽壳的效果也最好。0130表1棉籽壳水解效果比较0131水解率还原糖得率实施例1204234实施例2126137实施例381810132实施例401331里氏木霉的种子培养01341里氏木霉种子培养基10G/L葡萄糖，10G/L蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，015G/LTWEEN80，14G/LNH42SO4，20G/LKH2PO4，03G/L尿素，04G/LCACL22H2O，03G/LMGSO47H2O，0005G/LFESO47H2O，00016G/LMNSO4H2O，00014G/LZNSO47H2O，0003。

44、7G/LCOCL26H2O的MANDELS培养基，PH4850；01352以里氏木霉RUTC30为生产菌种，在PH50，25，120R/MIN条件下培养24H。01362里氏木霉发酵产酶01371里氏木霉产酶培养基10G/L葡萄糖，10G/L蛋白胨，终浓度为005M的柠檬酸缓冲液，015G/LTWEEN80，14G/LNH42SO4，20G/LKH2PO4，03G/L尿素，04G/LCACL22H2O，03G/LMGSO47H2O，0005G/LFESO47H2O，00016G/LMNSO4H2O，00014G/LZNSO47H2O，00037G/LCOCL26H2O的MANDELS培养基，添。

45、加2棉籽壳，PH4850；01382以5接种量，未加棉籽壳的培养为对照，在30，250R/MIN条件下培养4D发酵产酶，培养过程中通过添加相对发酵培养基12的棉籽壳进一步诱导产酶；01393过滤或离心收集的发酵液清液就是水解棉籽壳的复合酶液。01403纤维素酶活力测定，详见实施例1。说明书CN101974493ACN101974497A10/10页1301414木聚糖酶活力测定，详见实施例1。01425果胶酶活力测定，详见实施例1。01436发酵液残糖测定，详见实施例1。01447粗酶液水解棉籽壳，详见实施例1。说明书CN101974493ACN101974497A1/2页14图1图2图3说明书附图CN101974493ACN101974497A2/2页15图4图5说明书附图CN101974493A。

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