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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201180041898.1 (22)申请日 2011.07.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103080294 A (43)申请公布日 2013.05.01 (30)优先权数据 2010-200679 2010.09.08 JP (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2013.02.28 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2011/065662 2011.07.08 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2012/032844 JA 2012.。
2、03.15 (73)专利权人 株式会社岛津制作所 地址 日本国京都府京都市中京区西之京桑 原町1番地 专利权人 国立大学法人京都大学 学校法人早稻田大学 (72)发明人 务中达也阿部浩久叶井正树 明地将一前川平木村晋也 芦原英司庄子习一川合健太郎 (74)专利代理机构 上海市华诚律师事务所 31210 代理人 徐申民刘香兰 (51)Int.Cl. C12M 1/04(2006.01) C12M 3/00(2006.01) C12M 3/06(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (56)对比文件 WO 2008028241 A1,2008.03.13,说明书第 12页第6至第。
3、15页第10行,第20页第20-25行,以 及说明书附图2,3. US 5416022 A,1995.05.16,全文. US 2009280522 A1,2009.11.12,全文.(续) 审查员 齐悦如 (54)发明名称 细胞培养容器及使用该容器的细胞培养方 法 (57)摘要 孔的一对侧面中的一个侧面通过气体透过 膜与第1流路的一部分区间相接， 另外一个侧面 通过气体透过膜与第2流路的一部分区间相接。 在孔内填充了细胞培养液的状态下， 通过用第1 流路和第2流路相互流通特定成分浓度不同的高 浓度气体和低浓度气体， 从而在孔内形成特定成 分的浓度分布。 转续页 权利要求书1页 说明书7页 附。
4、图5页 CN 103080294 B 2017.02.15 CN 103080294 B (56)对比文件 Joe F. Lo et.al.,.Oxygen gradients for open well cellular culturesvia microfluidic substrates. Lab on a Chip .2010,P.23942401. Ning Li,et.al.Microfluidic generation and dynamically switching of oxygen gradients applied to the observation of cell 。
5、aerotactic behaviour. Microelectronic Engineering .2011, P.16981701. 2/2 页 2 接上页 CN 103080294 B 1.一种细胞培养容器， 包括： 孔， 所述孔形成于基体内部， 具有底面和侧面， 具有容纳细胞的空间， 与流通细胞培养 液的流路相连， 载置有细胞的所述底面为平面状， 所述空间的相对的一对侧面中的一个侧 面由允许气体透过而不允许液体透过的第1气体透过膜形成， 所述一对侧面中的另一个侧 面由允许气体透过而不允许液体透过的第2气体透过膜形成， 所述孔是将细胞培养液以与 所述第1气体透过膜、 所述第2气体透过膜、。
6、 上表面以及所述底面接触的密闭状态填充的孔； 第1流路， 所述第1流路通过所述第1气体透过膜与所述孔相接， 流通含有特定成分的气 体； 和 第2流路， 所述第2流路通过所述第2气体透过膜与所述孔相接， 流通不含特定成分或与 所述第1流路中流通的气体相比含有低浓度特定成分的气体， 根据流通所述第1流路的气体与流通所述第2流路的气体之间的所述特定成分的浓度 差， 在所述孔内的细胞培养液中的沿着所述底面的平面内形成所述特定成分的稳定的浓度 梯度。 2.根据权利要求1所述的细胞培养容器， 其中， 所述孔具有从6.310-6mm3到1mm3之间的 容积。 3.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器， 其中。
7、， 封闭所述孔的上下表面的上下表面 封闭部中的至少一个形成为能够从外部目视确认所述孔内部的透明窗。 4.根据权利要求3所述的细胞培养容器， 其中， 在一个所述透明窗的内表面固定有随接 触液中的氧浓度而改变光学性质的氧监测物质。 5.一种进行细胞培养的细胞培养方法， 包括： 在权利要求3所述的细胞培养容器的孔中填充细胞培养液并同时导入细胞的步骤； 通过所述透明窗识别导入到所述孔中的细胞在孔内的停留位置的步骤； 根据所述第1流路及第2流路的气体流量与孔内形成的特定成分的浓度分布之间的预 先求得的关系， 设定第1流路及第2流路的气体流量以使细胞的停留位置处的所述特定成分 的浓度为规定浓度的步骤； 和。
8、 使所述孔内的细胞培养液保持静止的状态下， 以在所述气体流量设定步骤中设定的气 体流量在所述第1流路及第2流路中流通气体的步骤。 6.根据权利要求5所述的细胞培养方法， 其中， 所述特定成分为氧。 7.根据权利要求6所述的细胞培养方法， 其中， 所述孔内的氧浓度小于21。 8.根据权利要求7所述的细胞培养方法， 其中， 所述细胞为iPS细胞， 将细胞停留位置处 的氧浓度设定为5。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103080294 B 3 细胞培养容器及使用该容器的细胞培养方法 技术领域 0001 本发明涉及具有用于细胞培养的孔并用于在该孔内形成适合细胞培养的环境的 细胞培养容器和使用该容器。
9、的细胞培养方法。 这样的细胞培养容器例如用于通过模拟生物 体内的微环境来分析细胞功能和药剂对细胞的功效。 背景技术 0002 在生物体内的正常组织中， 由血管供给充分的氧和营养。 与此相对， 一般认为， 在 肿瘤组织内， 由于没有与癌细胞的增殖相应的血管新生以及各血管结构无序且脆弱等， 因 而氧或营养处于低浓度状态。 关于癌与氧或营养的低浓度的关系， 一直以来被探讨， 最近研 究尤其更为活跃。 作为目前为止得到的知识已知， 例如一部分癌细胞获得了在低氧浓度区 域中的耐性 （例如参考非专利文献1） 。 0003 此外， 非专利文献1中， 作为干细胞壁龛 （niche） 的重要要素之一而列举了低氧。
10、浓 度的同时， 还揭示了癌细胞通过低氧浓度变为癌干细胞 “样” 。 这样， 作为详细考察癌的功能 的途径之一， 低氧浓度状态下的癌细胞培养就变得很重要， 有必要再现癌细胞所生存的环 境。 0004 目前， 细胞培养一般是在能够保持温度37、 水蒸气饱和、 约5%CO2状态的培养器 内进行的。 培养器内的氧浓度基本与大气中的相同， 为20%左右。 此外， 用低氧浓度状态进行 研究时， 使用能够将氧浓度保持在0.7%或约5%的所谓低氧浓度状态的特别的培养器。 0005 然而， 认为： 在离血管较远的癌细胞或在例如形成为10个以上的一定大小的块的 癌细胞群的周边微环境中， 在氧浓度上具有梯度。 特别。
11、是关于从骨髓内朝向骨的方向， 认为 骨深部的氧浓度基本为0%， 因而认为在同方向上存在氧浓度梯度。 因此， 为了培养癌细胞， 有必要制作出具有低氧浓度区域内的氧浓度梯度的环境。 0006 然而， 即使想在以前的细胞培养中通常使用的培养皿、 烧瓶或者孔板 （well plate） 等容器中形成氧浓度梯度， 由于这些容器容积大、 而且存在作为热源的碳酸气培养 器、 显微镜照明灯、 荧光灯和其它电器等， 因而发生以热对流为主要原因的液体 （此处为培 养基） 的移动， 不能稳定地制作出具有氧浓度梯度的环境。 0007 与此相对， 在被称作 TAS （microTotalAnalysissystem） 。
12、或微小流体控制技术 （microfluidics） 的研究领域中， 使用应用了微细加工技术而制备的微小容器 （例如容积为 1 L以下） 。 认为如果将容器内的容积设得很微小， 液体就被困在微小空间的密闭体系中， 受 周围的壁的影响较大， 不易流动， 即使有热源， 对流的发生也被抑制。 0008 现有技术文献 0009 专利文献 0010 专利文献1： 日本专利特表2004-508571号公报 0011 非专利文献 0012 非专利文献1： 実験医学Vol.25,No.14,P2139-2143,2007 （实验医学Vol.25, No.14,P2139-2143,2007） 说明书 1/7 页。
13、 3 CN 103080294 B 4 0013 非专利文献2： 島津評論66123744 （2009.9）（岛津评论66123744 （2009.9） ） 发明内容 0014 发明所要解决的课题 0015 作为使用上述微小容器制作特定成分的浓度梯度的方法， 一般的方法是如专利文 献1所示的那样使不同浓度的多个液体一边流动一边相接触的方法。 然而， 将这种方法转用 到细胞培养上时， 由于细胞培养液一直处于流动状态， 因此会发生如下问题： 细胞因细胞培 养液的流动而受到某些压力 （stress） 、 或细胞周边微环境的液性因子随细胞培养液的流动 而流失、 变成与实际的细胞周边环境不同的环境。 0。
14、016 而且， 微小容器的孔的上表面等多由PDMS （聚二甲基硅氧烷） 形成。 由于PDMS是气 体透过性的， 因此如果是通常的细胞培养， 则对在孔内维持与培养器内同样的各气体分压 而言是有效的。 然而， 由于孔内通过PDMS膜与培养器内处于平衡状态， 因此形成如低氧浓度 区域中的氧浓度梯度这样的浓度梯度是很困难的。 0017 由于以上情况， 还不能在细胞培养液不流动的状态下制作出具有低氧浓度区域中 的氧浓度梯度的环境。 因此， 无论是模拟肿瘤周边的微环境， 还是稳定地并以良好的再现性 培养与癌干细胞具有同样的行为的细胞， 还是取出变为癌干细胞样的癌细胞， 都很困难。 而 且， 由于在白血病的。
15、研究中也不能维持低氧浓度区域中的氧浓度梯度， 因此也不能模拟骨 髓内微环境。 0018 为此， 本发明的目的在于能够稳定地制作出以氧和二氧化碳等为代表的气体的、 具有适于细胞培养的浓度区域的环境。 0019 用于解决课题的手段 0020 本发明的细胞培养容器包括： 孔、 第1流路和第2流路， 所述孔形成于基体内部， 具 有容纳细胞的空间， 与使细胞培养液流通的流路相连， 空间的相对的一对侧面中的一个侧 面由允许气体透过而不允许液体透过的第1气体透过膜形成， 一对侧面中的另一个侧面由 允许气体透过而不允许液体透过的第2气体透过膜形成； 所述第1流路通过第1气体透过膜 与孔相接， 使含有特定成分的。
16、气体流通； 所述第2流路通过第2气体透过膜与孔相接， 流通不 含特定成分或与第1流路中流通的气体相比含有低浓度的特定成分的气体。 0021 对本发明的细胞培养容器的孔体积进行考虑。 在该孔中优选以其原本的规模模拟 生物体内的微环境。 此处， 作为用于测定细胞和组织的功能的最小单位， 对细胞进行考虑。 如果把细胞近似地看做直径为R的球， 为了观测2个细胞间的相互作用， 孔底面需要排列2个 细胞， 最小成为直径为2R的圆以上的大小。 如果将细胞径设为10 m， 最小也成为直径20 m的 圆。 如果高度有必要为细胞2倍的话， 则最小体积为6.310-6mm3。 0022 另一方面， 如果考虑最大体积。
17、， 则为1mm1mm1mm=1mm3左右。 如果比该体积大， 细胞间就会过分分开， 不能观察到相互作用。 0023 由此， 孔优选具有从6.310-6mm3至1mm3之间的容积。 0024 即使在该最大体积， 液体也被困在微小空间的密闭体系中， 受周围的壁的影响较 大， 不易流动， 对流的发生被抑制。 实际上， 实验时是不流动的状态， 交换培养液时等的流速 也充其量在10 m/sec左右。 即使假设流速偏离10mm/sec级别而发生大的液体流动， 雷诺数 说明书 2/7 页 4 CN 103080294 B 5 （Re） 比从层流向乱流转变的2300还要充分地小， 成为层流， 因此孔内液体被扩。
18、散所左右而 被混合。 也就是说， 可以稳定地维持孔内形成的环境。 0025 优选封闭孔的上下表面的上下表面封闭部中的至少一个形成为可从外部目视确 认孔内部的透明窗。 这样的话， 就可以使用显微镜等从外部确认培养细胞的位置和状态等。 0026 此时， 可在该透明窗的内表面固定随接触液中的氧浓度而改变光学性质的氧监测 物质。 这样的话， 就可对孔中形成的氧浓度分布进行光学测定。 这样的细胞培养容器也可作 为用于检证孔中的氧浓度梯度的测试块 （testchip） 而利用。 0027 作为 “氧监测物质” ， 例如可以使用铂卟啉等荧光色素。 关于使用了铂卟啉等的氧 浓度分布的测定， 将在实施例中详述。。
19、 0028 本发明的细胞培养方法是包括如下步骤进行细胞培养的方法： 使用本发明的细胞 培养容器中封闭基体的孔上下表面的上下表面封闭部中的至少一个形成为可从外部目视 确认孔内部的透明窗的细胞培养容器， 在孔中填充细胞培养液并同时导入细胞的步骤； 通 过透明窗识别导入到孔中的细胞在孔内的停留位置的步骤； 根据第1流路及第2流路的气体 流量与孔内形成的特定成分的浓度分布之间的预先求得的关系， 设定第1流路及第2流路的 气体流量以使细胞的停留位置处的特定成分的浓度为规定浓度的步骤； 和使孔内的细胞培 养液保持静止的状态下， 以在上述气体流量设定步骤中设定的气体流量在第1流路及第2流 路中流通气体的步骤。
20、。 0029 作为在孔内形成浓度梯度的对象的特定成分， 可以列举氧。 此时， 孔内的氧浓度优 选小于21%。 这样的话， 就可在孔内制作出近似于生物体内环境的氧浓度梯度。 0030 作为通过本发明的细胞培养方法培养的细胞， 可以列举iPS细胞。 此时， 优选调整 高浓度气体及低浓度气体的流量， 以使细胞的停留位置的氧浓度为约5%。 0031 在一部分的癌细胞培养中， 优选制作低氧浓度状态。 此处的低氧浓度状态是指氧 浓度约为05%的状态。 理由如下所述。 人肺泡是人体中氧最丰富的环境， 其氧分压在一大 气压下为100mmHg， 即100/760=13%。 该氧经血管由血红蛋白循环到全身， 毛细。
21、血管末端的氧 浓度为45-50mmHg， 即5.9%-6.5%。 此外， 在正常组织的神经、 胶原纤维、 纤维芽细胞等的间质 中， 氧浓度为20-40mmHg， 即2.6%-5.2%。 再者， 肿瘤内以0-5%的区域分布， 中央值为1.3%左 右。 另一方面， 报告有这样的情况， 干细胞/前体细胞的增殖和分化的控制多在氧浓度15% 的范围内， iPS细胞也在氧浓度5%时增殖能力亢进。 因此， 所谓用于模拟生物体的癌细胞培 养的 “低氧浓度状态” 设定为约05%左右的氧浓度是合适的。 0032 发明效果 0033 本发明所涉及的细胞培养容器由于孔内部的空间的相对的一对侧面分别由允许 气体透过而不。
22、允许液体透过的第1气体透过膜和第2气体透过膜形成， 使含有特定成分的气 体流通的第1流路通过第1气体透过膜与孔相接， 不含特定成分或使得与第1流路中流通的 气体相比含有低浓度特定成分的气体的第2流路通过第2气体透过膜与孔相接， 因此通过在 第1流路及第2流路中分别以一定流量流通气体， 就可以在孔内的细胞培养液中稳定地形成 特定成分的浓度梯度。 孔内的细胞培养液中形成的特定成分的浓度梯度可通过流入第1流 路及第2流路的气体的特定成分浓度和各气体流量进行调整。 0034 本发明所涉及的细胞培养方法由于使用本发明细胞培养容器中构成为可从外部 目视确认到孔内部的容器， 识别导入到孔内的细胞位置， 并将。
23、该位置的特定成分浓度调整 说明书 3/7 页 5 CN 103080294 B 6 为规定浓度， 因此可以将细胞的周围环境设定为适于培养的环境， 或设定为近似于生物体 内环境的环境。 该方法中， 虽然在第1流路及第2流路中不断流通高浓度气体和低浓度气体， 但由于不在孔内流通细胞培养液， 因此不会对细胞带来不必要的压力， 从而可以稳定地制 作出适于细胞培养的环境。 附图说明 0035 图1A为显示细胞培养容器的一个实施例的俯视图。 0036 图1B为图1A的A-A位置处的截面图。 0037 图2为该实施例的立体图。 0038 图3为用于模拟孔内的氧浓度分布的容器的关键部位的立体图。 0039 图。
24、4A为显示孔内氧浓度分布的模拟结果的浓度分布模式图。 0040 图4B为显示孔中央部分的氧浓度梯度的图。 0041 图5为显示使用了该实施例的细胞培养容器的细胞培养方法的流程图。 0042 图6为显示将氧分压与测定的荧光量通过Stern-Bolmer式画图得到的结果的一例 的图。 0043 符号说明 0044 1 细胞培养容器 0045 2、 4 透明基板 0046 3 流路形成片 0047 5 孔 0048 6 导入用流路 0049 8 排出用流路 0050 10 第1流路 0051 12 第2流路 0052 14、 16 气体透过膜 （多孔质膜） 0053 18、 20、 22、 24、 。
25、26、 28贯通孔 具体实施方式 0054 用图1和图2对细胞培养容器的一个实施例进行说明。 0055 该实施例的细胞培养容器1在其内部具备孔5、 第1流路10及第2流路12。 孔5为长方 体形状的空间， 第1流路10的一部分区间通过气体透过膜14与孔5的相对的一对侧面中的一 个侧面相接， 第2流路12的一部分区间通过气体透过膜16与相反一侧的侧面相接。 气体透过 膜14、 16是气体可通过而液体不能通过的膜。 在孔5的另外一对侧面中的一个侧面上具备细 胞培养液的导入用流路6， 在另外一个侧面上具备排出用流路8。 0056 细胞培养容器1作为一个块 （chip） 如下构成： 在作为封闭基板的2。
26、枚透明基板2、 4 之间夹有具备了形成孔5、 第1流路10及第2流路12的贯通槽的流路形成片3并通过热压接而 被一体化。 透明基板2、 4可从外侧目视确认到孔5内部的程度地透明， 可以使用不允许气体 和液体透过的平板， 例如玻璃基板和石英玻璃基板。 为保持强度， 透明基板4优选具有0.5 1.0mm左右的厚度。 例如在以使用倒置显微镜观察孔5内部为前提的情形下， 透明基板2适宜 说明书 4/7 页 6 CN 103080294 B 7 的是0.17mm左右的厚度。 0057 作为流路形成片3的材质， 可以使用粘合性氟树脂 （注册商标） EFEP （乙 烯-全氟乙烯丙烯共聚物） 。 流路形成片3。
27、的厚度为20 m1000 m比较合适。 可通 过切割进行图案化。 此外， 作为分隔孔5与第1流路10及第2流路12的气体透过膜14、 16， 可以 使用PTFE （聚四氟乙烯） 制的多孔质膜 （注册商标： 住友电工 株 式会社的产品） 、 孔径例如为0.1 m的膜。 0058 在封闭孔5、 第1流路10及第2流路12的上表面的透明基板4上， 在导入用流路6、 排 出用流路8、 第1流路10及第2流路12的端部位置处开有作为各流路6、 8、 10、 12入口或出口的 贯通孔18、 20、 22、 24、 26及28。 0059 细胞培养容器1在孔5中填充细胞培养液， 在该细胞培养液中容纳细胞， 。
28、并使孔5内 的细胞培养液保持静止的状态下， 通过在第1流路10和第2流路12中相互流通特定成分浓度 不同的高浓度气体和低浓度气体， 就可在孔5内形成特定成分的浓度分布。 将所含的特定成 分浓度高的气体设为高浓度气体， 浓度低的气体设为低浓度气体。 特定成分是指例如氧和 二氧化碳。 在该实施例中， 如图2所示的那样， 将贯通孔22作为通向第1流路10的高浓度气体 入口， 将贯通孔24作为其排出口， 将贯通孔26作为通向第2流路12的低浓度气体入口， 将贯 通孔28作为其排出口。 通过以一定流量在第1流路10流通高浓度气体， 以一定流量在第2流 路12流通低浓度气体， 就可在孔5内形成以高浓度气体。
29、的特定成分浓度为最大浓度、 以低浓 度气体的特定成分浓度为最低浓度的浓度梯度。 0060 通过在透明基板2或4的孔5部分的内侧表面固定作为氧监测物质的铂卟啉等荧光 色素， 可作成用于测定氧浓度分布的测试块。 为了对氧分压的分布进行可视化， 以往就已知 有压敏涂料法。 这是利用了铂卟啉等荧光色素因氧而消光、 发光量为氧分压函数的情况的 涂料法。 制备将该荧光色素与基体聚合物同时溶解于溶剂中的试剂， 将该试剂例如以3 m的 厚度涂布于透明基板2或4的内侧表面上。 具体而言， 通过选择称作P-TMSP （聚1-三甲基硅烷 基1-丙炔） 的气体透过性好的聚合物作为基体聚合物， 就可增大因氧而导致的荧光。
30、量变化， 并同时减少温度依赖性 （参考非专利文献2） 。 荧光强度的测定可通过如下方法进行： 例如将 405nm的紫色激光作为激发光， 将该激发光用扩散板均一化后照射于氧浓度可视化测试块 上表面， 用CCD照相机测定从荧光色素发出的650nm的荧光。 0061 通过对用CCD照相机测定得到的荧光强度进行数据处理， 得到涂布了荧光色素的 各位置处的氧分压。 已知铂卟啉等荧光试剂按照下式 （1） 所示的Stern-Bolmer式因氧而发 生消光。 此外， 下式 （1） 中的I为氧分压p时的发光强度， Iref为氧分压pref（通常设定为大气压 21kPa） 时的发光强度， A0A3为拟合系数。 0。
31、062 Iref/I=A0+A1(p/pref)+A2(p/pref)2+A3(p/ref)3 0063 将氧分压与测定的荧光量按上述 （1） 式进行画图得到的结果如图6所示。 纵轴为标 准化后的荧光量倒数， 横轴为标准化后的氧分压。 从该图可知， 在氧分压零附近， 与常压相 比荧光量增大数十倍， 是一种相对于氧分压荧光量变化较大的试剂， 具有充分的性能来测 定本发明中氧浓度梯度用块的孔内的氧浓度。 0064 根据该方法， 就可对测试块孔内的氧浓度分布进行可视化。 由此就可观测、 分析测 试块孔内的氧浓度分布， 控制孔内的氧浓度梯度， 还可进一步将孔内任意位置控制为期望 的浓度。 说明书 5/。
32、7 页 7 CN 103080294 B 8 0065 接下来， 使用流体分析软件来模拟在孔5内形成的浓度梯度的数据如图4所示。 作 为模拟用的流体分析软件， 使用了根据有限要素法进行分析的CoventorWare （Coventor, Inc.） 。 作为流体分析软件， 还可使用应用有限要素法的其它分析软件。 0066 该模拟使用了模拟细胞培养容器1的图3所示的模型。 该模型在用多孔质膜50、 52 分别围起四周的2条流路54、 56之间配置填充了水的区域 （浓度梯度形成区域） 58。 各流路 54、 56与浓度梯度形成区域58之间的多孔质膜50、 52的宽度为100 m， 浓度梯度形成区域。
33、58 的平面形状设为500 m500 m的正方形。 0067 在该模拟中， 算出了分别以0.001 L/min、 0.01 L/min、 0.1 L/min、 1 L/min、 10 L/ min的流量在一侧的流路中流通氧浓度为100%气体、 另外一侧的流路中流通氧浓度为0%气 体时的氧浓度分布。 图4A表示在图3的模型中的氧浓度分布。 虽然图4B所示的结果是在浓度 梯度形成区域的中央部 （图4A中箭头所示的线上的位置） 的结果， 但从该结果可知， 在浓度 梯度形成区域内形成直线性的浓度梯度， 而且气体流量越大， 其浓度梯度也越大， 若气体流 量变小， 则其浓度梯度变小。 由此， 通过控制细胞。
34、培养容器1中流通第1流路10的高浓度气体 的浓度和流量、 流通第2流路12的低浓度气体的浓度和流量， 就可控制孔5内形成的浓度梯 度， 并同时将孔5内的任意位置的特定成分浓度控制在期望浓度。 0068 下面， 参照图2和图5对使用了细胞培养容器1的细胞培养方法进行说明。 此处对培 养癌细胞的情形进行说明。 在第1流路10中流通的高浓度气体为含氧约5%的气体， 在第2流 路12中流通的低浓度气体为含氧约0.1%的气体。 实施该细胞培养方法的前提是， 预先测定 或模拟高浓度气体和低浓度气体的流量与用该流量流通两种气体形成平衡状态时孔5内所 形成的浓度分布之间的关系， 并将该测定数据或模拟数据用保存。
35、于存储介质等中。 然后， 用 于根据该保存的测定数据或模拟数据使孔5内的任意位置的浓度设成期望浓度的两气体流 量就成为可设定的状态。 0069 此处， 高浓度气体和低浓度气体的流量与孔5内形成的浓度分布之间的关系的测 定数据例如可使用涂布了铂卟啉的测试块来求得， 模拟数据可通过使用图3及图4进行说明 的模拟来求得。 0070 首先， 从作为培养液入口的贯通孔18供给培养液， 填充孔5内。 此时， 将癌细胞与培 养液一起导入到孔5。 优选控制培养液的供给流量， 使得细胞停留在孔5的中央部附近。 在孔 5内填充培养液后， 停止供给培养液， 使孔5内的培养液处于静止状态。 0071 识别导入到孔5内。
36、的细胞的位置。 作为细胞位置的识别方法， 例如可以列举使用了 显微镜图像的图像识别。 从预先准备的测定数据或模拟数据中选择使识别的细胞位置的氧 浓度和其周边环境成为适于培养的环境的条件并进行设定。 通过分别以设定的流量供给高 浓度气体和低浓度气体， 经过一定时间后， 第1流路10和第2流路12之间的孔5内的氧浓度达 到平衡状态， 孔5内形成了稳定的氧浓度梯度， 就可在合适的条件下进行导入到孔5内的癌 细胞的培养。 由于孔5内没有培养液的流动， 因此癌细胞不会受到压力， 其周边环境也可保 持稳定的状态。 由于孔5的容积在1mm3以下， 因此也不发生培养液的对流， 可以稳定地维持 适于细胞培养的环。
37、境。 0072 此外， 在该例中虽然使用了含氧约5%的气体作为高浓度气体， 在需要更高浓度条 件的情形下， 例如可以使用含氧21%的气体作为高浓度气体。 由于生物体内存在021%的氧 浓度梯度， 因此如果使用含氧21%的气体作为高浓度气体， 则生物体内的所有的环境都可以 说明书 6/7 页 8 CN 103080294 B 9 在孔5内得到再现。 0073 而且， 想在孔5内模拟骨髓时， 作为孔5内配置的细胞， 可以使用骨芽细胞、 骨髓细 胞、 破骨细胞等， 也可根据情形的不同在孔5内配置骨片。 骨片的配置可以通过例如在块制 备过程中的、 上表面部为开放状态的孔内放入骨来进行。 骨片用外科手术。
38、刀等细细切成能 够放入孔内的大小， 用镊子等放在孔底面上的期望位置处。 之后进行上部材料的粘合工序。 当对离血管较远的骨的端部沿骨的长度方向进行切断时， 在同方向上就存在氧浓度梯度。 朝向血管通过的方向存在氧浓度梯度， 血管处的氧浓度最大。 只是， 认为离肺较远的末端器 官中的氧浓度与大气中的20%不同， 约5%左右。 0074 研究白血病癌细胞的行为时， 在孔内导入癌细胞进行观察。 在模拟其它肿瘤周边 微环境时， 可以通过在孔5的低浓度侧导入一个或多个癌细胞进行。 此处， 通过确认某细胞 是否处在细胞周期的休止期和是否对抗癌剂具有耐药性等， 就可对有癌干细胞样的行为的 癌细胞进行特定。 如果。
39、能检测到癌干细胞样的细胞， 就可以例如用光镊取出该细胞。 此外， 还可以在孔5内培养iPS细胞。 iPS细胞在约5%左右的氧浓度区域被活化， 可以在孔5内的iPS 细胞位置处形成氧浓度约5%左右的区域进行培养。 0075 这样， 可以通过使用了该细胞培养容器1的细胞培养方法来培养各种细胞。 培养后 取出的细胞可用于基因分析等现有的各种方法的分析中。 0076 工业上的可利用性 0077 本发明可以利用于供给到基因分析等各种分析的细胞的培养中。 说明书 7/7 页 9 CN 103080294 B 10 图1A 图1B 说明书附图 1/5 页 10 CN 103080294 B 11 图2 图3 说明书附图 2/5 页 11 CN 103080294 B 12 图4A 图4B 说明书附图 3/5 页 12 CN 103080294 B 13 图5 说明书附图 4/5 页 13 CN 103080294 B 14 图6 说明书附图 5/5 页 14 CN 103080294 B 15 。