技术领域
本发明涉及一种防治菌株，尤其涉及一种以群体感应信号分子AHLs为靶标的病害防治菌株及其应用。
背景技术
在农业生产中，高效防治病原菌，减少病害引起的损失，一直是生产者想要达到的目标。果胶杆菌(Pectobacterium)是农业生产上危害重大的一类病原菌，这类病原菌可以分泌多种水解酶，如：果胶酶，多聚半乳糖酶、蛋白酶等。果胶杆菌利用这些水解酶来打破寄主植物的防御体系，破坏植物组织结构，成功侵染并引起寄主植物出现软腐病的相关症状，最终导致相关农作物减产，甚至绝产。针对这一类致病菌，生产上尚无十分有效的控制措施。
目前，国内外针对果胶杆菌所用的防治措施主要是通过喷洒化学试剂，如：噻菌酮、噻枯唑、农用链霉素或中生菌素等化学农药或抗生素来进行防治，然而这些化学药物的大量使用已经带来了环境污染，生态平衡被破坏、病原菌抗药性增强和食品安全等一系列问题。因此，寻找新型、绿色、环保、高效的病害防治方法迫在眉睫。
细菌可以合成，分泌并感知特定信号分子，当细菌的群体密度达到一定阈值后，环境中的信号分子浓度也达到一定水平，这时细菌的某些基因开始表达，一些群体水平达的行为开始出现，这种现象即群体感应(Quorum sensing,QS)。(Fuqua WC,SC Winans,EP Greenberg et al.Quorum sensing in bacteria:the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators.[J]J Bacteriol,1994,176:269)。群体感应现象广泛存在于果胶杆菌(Pectobacterium)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和水稻基腐菌(Dickeya zeae)等革兰氏阴性菌中，并参与调控一些重要的生物功能，如水解酶的合成、绿脓毒素等。酰基高丝氨酸内酯类物质(N-Acylhomoserine lactones，AHLs)为革兰氏阴性菌的群体感应信号分子，AHLs除了包括一些传统的AHLs，如：N-(3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯(N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone，OHHL)、N-(3-氧代辛酰)-L-高丝氨酸内酯(N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone，OOHL)等，还包括一些新型的AHLs，如：异戊酰基-高丝氨酸内酯(Isovaleryl-homoserine lactone)、羧化酰基-高丝氨酸内酯(carboxyl-AHLs)、芳基-高丝氨酸内酯(Aryl-homoserine lactone)和香豆酰基-高丝氨酸内酯(p-coumaroyl-HSL)等。群体感应淬灭(Quorum quenching,QQ)是一种干扰群体感应系统的方式，它是通过抑制信号分子的合成、积累、监测、或对信号分子进行酶降解或修饰的机制来实现干扰群体感应系统的目的(Fetzner S.Quorum quenching enzymes[J].J Biotechnol,2015,201:2-14.)。
群体感应淬灭是一种病害防治新策略，利用这一方式进行病原菌的防治，不会增加致病菌的生存压力，避免其抗药性的出现。这一新途径具有操作简便、经济实用、环境友好等优点。不同信号群体感应淬灭制剂的研发是目前国际研究热点。
发明内容
本发明克服了现有病原菌生物防治技术的不足，提供一种可以高效降解群体感应信号分子AHLs的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)及其在病害防治方面的应用。蜡样芽孢杆菌对群体感应信号分子AHLs具有显著的降解作用，在防治依赖AHLs致病的病原菌方面具有巨大潜力，对解决化学农药或抗生素滥用及病原菌耐药性问题具有重大现实意义。
为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案为：
一种以群体感应信号分子AHLs为靶标的病害防治菌株，其特征在于，所述菌株保藏号为GDMCC 60434。
一种以群体感应信号分子AHLs为靶标的病害防治菌株在降解群体感应信号分子AHLs中的应用，或在制备降解AHLs产品中的应用。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述群体感应信号分子AHLs包括以下中的一种或几种：N-(3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯、N-(3-氧代辛酰)-L-高丝氨酸内酯、异戊酰基-高丝氨酸内酯、羧化酰基-高丝氨酸内酯、芳基-高丝氨酸内酯、香豆酰基-高丝氨酸内酯。
一种杆菌在防治依赖AHLs介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖AHLs致病的致病菌的防治制剂中的应用。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述菌株为蜡样芽孢杆菌菌株XN-42。
一种防治依赖AHLs致病的致病菌病害的方法，用蜡样芽孢杆菌菌株XN-42对作物进行接种处理。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述依赖AHLs致病的致病菌包括：迪卡氏菌、果胶杆菌、绿脓杆菌。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述降解菌剂包含蜡样芽孢杆菌菌株XN-42、蜡样芽孢杆菌菌株XN-42菌液。
一种依赖AHLs致病的致病菌的生物防治剂，所述生物防治剂包含蜡样芽孢杆菌菌株XN-42、蜡样芽孢杆菌菌株XN-42菌液。
本发明的菌株从采自广州华南农业大学校农场蔬菜地的土壤中，经人工筛选分离纯化获得，经过对该菌株的形态学特征及16S rDNA系统发育分析，鉴定菌株XN-42为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，并命名为XN-42。
保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60434。
菌株XN-42的菌落形态学特征：浅黄色，圆形，凸起，不透明，边缘整齐。
电镜观察菌体的形态特征为：细胞呈杆状，有鞭毛。
菌株XN-42对氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸新霉素和链霉素的抗性达到400μg/mL以上，对庆大霉素的抗性达到150μg/mL，对羧苄青霉素的抗性达到350μg/mL，对四环素抗性达到10μg/mL，对氯霉素的抗性均达5μg/mL以下。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株XN-42能够有效降解群体感应信号分子OHHL，可在浓度为0.5mM的以OHHL为唯一碳源的培养基中正常生长，并在96h内对初始浓度为0.5mM的群体感应信号分子降解率达到73％，因此，该菌株在防治AHLs介导致病的致病菌方面有巨大的应用潜力。
用蜡样芽孢杆菌菌株XN-42的菌液对作物进行接种处理，以预防依赖AHLs致病的致病菌的侵染。
制备菌株XN-42菌液的最适培养基为Luria-Bertani培养基，其配方为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH 6.8～7.2，121℃灭菌20min。
本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明具备以下有益效果：
本发明研究发现，该蜡样芽孢杆菌针对群体感应信号分子AHLs具有较好的降解活性，且降解效果稳定并显著，在防治AHLs介导致病的致病菌危害方面具有巨大的应用潜力，这为病害的生物防治提供了一种新的途径和方法。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明的菌株XN-42在LB培养基上的菌落形态图。
图2为本发明的菌株XN-42的扫描电镜图。
图3为本发明的菌株XN-42的系统进化树分析图。
图4为本发明的菌株XN-42在不同抗生素中的生长情况图。
图5为本发明的菌株XN-42对OHHL的降解活性测定图。(CK为未添加淬灭菌的空白对照)。
图6A为未接种菌株XN-42的对照图。
图6B为菌株XN-42对OHHL降解0d的高效液相色谱图。
图6C为菌株XN-42对OHHL降解1d的高效液相色谱图。
图6D为菌株XN-42对OHHL降解2d的高效液相色谱图。
图6E为菌株XN-42对OHHL降解3d的高效液相色谱图。
图6F为菌株XN-42对OHHL降解4d的高效液相色谱图。
图7为本发明的菌株XN-42以OHHL为唯一碳源的生长曲线和降解曲线图。
图8为本发明的菌株XN-42、E.coli、B23分别与Z3-3共同接种于马铃薯块茎24h后的发病情况。
图9为本发明的菌株XN-42、E.coli、B23分别与Z3-3共同接种于白菜梗24h后的发病情况。
图10为本发明的菌株XN-42、E.coli、B23分别与Z3-3共同接种于胡萝卜24h后的发病情况。
具体实施方式
现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
除非特别说明，本发明实施例中所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所用到的培养基及试剂如下：
Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH 6.8～7.2，121℃灭菌20min。LB固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5％(w/v)的琼脂。
基础盐培养基(MSM)：(NH4)2SO4，2.0g/L；CaCl2·2H2O，0.01g/L；Na2HPO4·12H2O，1.5g/L；KH2PO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.001g/L；pH 6.5。
基础培养基(MM)：K2HPO4，10.5g/L；KH2PO4，4.5g/L；(NH4)2SO4，2.0g/L；Mannitol，2.0g/L；Glycerol，2.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；CaCl2，0.01g/L；FeSO4，0.005g/L；MnCl2，0.002g/L；pH 6.5。
OHHL采购自上海有德化工科技有限公司，X-gal、培养基所需试剂均采购自广州齐湘、华奇盛等公司。
实施例1蜡样芽孢杆菌XN-42的分离、筛选
1.1、土样采集：采集自华南农业大学校农场的土壤样本作为微生物源。
土样于2017年7月30日采集自广东省广州市华南农业大学校农场蔬菜地，在此地进取样、装袋，作为微生物源带回实验室进行菌株的分离。
1.2、菌株的富集培养：制备基础盐培养基(MSM)，在250mL三角瓶内装入50mL的MSM培养基，121℃灭菌20min，冷却后在无菌条件下加入OHHL母液(浓度为100mm/L，溶剂为乙腈)，使培养基里OHHL最终浓度为5μmol/L，然后加入5g土样，放置于30℃、200rpm摇床培养7d后，按10％的接种量取样转接到OHHL浓度为10μmol/L的MSM培养基中。相同条件培养7d后，再按10％的接种量取样转接到OHHL浓度为20μmol/L的MSM培养基中，再以相同条件培养7d。以此类推，7d一个周期，不断使OHHL的浓度增加至80μmol/L。
1.3、菌株分离与纯化：采用稀释、平板涂布法和平板划线法进行菌株的分离和纯化。
取1mL终MSM培养液，用无菌水将其稀释成浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的培养液，然后分别吸取各个浓度的培养液100μL，在LB固体平板上涂布均匀、晾干，30℃培养24h。挑取平板上长出的不同形态的单菌落，在LB固体平板反复划线培养纯化，直至分离出单菌株。用甘油保菌法将菌株保藏，待进一步实验检测降解活性。
1.4、菌株筛选：利用报告菌株CF11(Agrobacterium tumefaciensCF11)筛选具有降解活性的菌株。
将待筛选的菌株从-80℃冰箱取出，划线于LB固体培养基平板上进行活化，在30℃培养箱培养24h。挑取单菌落，接种至LB液体培养基，在30℃，200rpm的条件下过夜培养，得到菌液。取1个OD600值的菌体转移至OHHL浓度为20μmol/L的1mL MSM培养基里，并混合均匀，得到1mL待培养液。将待培养液转移至2mL离心管中，以30℃，200rpm的条件培养24h。24h后，取5μL反应混合物点样至1cm宽的MM琼脂条顶端，晾干，之后在下方点一排(约13-18个点)报告菌株的菌液。其中，报告菌株以28℃，200rpm的条件过夜培养至浑浊，琼脂条由X-gal浓度为40μg/mL的MM板切条所得。将已经点有样本及报告菌株的琼脂条放置于28℃培养箱，并避光处理，放置24h后观察实验结果。
结果分析，OHHL具有扩散性，且扩散距离与其浓度成正比。当报告菌株CF11感知到环境中OHHL的存在时，其β-半乳糖苷酶的基因开始表达，并向环境中释放β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶可以将MM琼脂条中的无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)酶解为半乳糖和深蓝色物质5-溴-4-靛蓝，5-溴-4-靛蓝可使整个报告菌株的菌落变成蓝色。也就是说，当反应混合物中含有的OHHL越多，自顶端变蓝的距离越长，反之，则距离越长。根据实验结果筛选出对OHHL降解效果最好的菌株，命名为XN-42。
实施例2蜡样芽孢杆菌菌株XN-42的鉴定
本实施例针对降解菌XN-42进行了形态学特征、16S rDNA系统发育分析，鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。具体如下：
2.1菌落形态特征：在LB固体平板上培养48h，菌落浅黄色，圆形，凸起，不透明，边缘整齐，如图1所示；在LB液体培养基中呈扩散性混浊，好氧，30℃下生长良好。
2.2菌体形态特征：如图2所示，菌体呈杆状，表有鞭毛。
2.3 16S rDNA序列及系统进化分析：菌株XN-42的16S rDNA基因序列长度为1436bp，与NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对后发现，菌株XN-42与Bacillus cereus具有较高的同源性(>99％)，其系统进化树如图3所示。
实施例3菌株XN-42的抗生素敏感性分析
为了能够更好地研究菌株XN-42，本实施例对菌株XN-42进行了多种抗生素敏感性检测，具体结果如图4所示。
实验结果表明：该菌株XN-42对氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸新霉素和链霉素的抗性达到400μg/mL以上，对庆大霉素的抗性达到150μg/mL，对羧苄青霉素的抗性达到350μg/mL，对四环素抗性达到10μg/mL，对氯霉素的抗性均达5μg/mL以下。这一结果为后续研究选取合适的抗生素作为参考。
实施例4菌株XN-42对OHHL的降解活性测定
本实施例利用报告菌株CF11(Agrobacterium tumefaciens)检测菌株XN-42对OHHL的降解效果。
用LB固体培养基平板活化菌株XN-42，将平板置于30℃培养箱，培养24h。挑取单菌落接种至液体LB培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养得到菌液。取1个OD600值的菌体与以OHHL作为唯一碳源的1mL MSM培养基均匀混合后，转移至2mL离心管中，得到待培养液，使MSM培养基中OHHL的浓度为10μmol/L。以30℃，200rpm的条件培养24h。24h后，取5μL反应混合物点至琼脂条顶端，然后在下方依次点报告菌株菌液，报告菌株按照实施例1所述的方法培养。之后，将已经点好反应混合物和报告菌株的琼脂条放置于28℃培养箱，进行避光处理，培养24h后观察实验结果。其中，琼脂条为含有40μg/mL X-gal的MM板切条所得。CK为不含XN-42的空白对照。
实验结果如图5所示，CK实验组的琼脂条大约1/2变蓝，说明样品中含有OHHL；XN-42实验组的琼脂条未变蓝，说明样品中不含OHHL，即OHHL已经被XN-42完全降解。结果表明：菌株XN-42具有降解OHHL的活性。
实施例5利用HPLC检测菌株XN-42降解OHHL的活性
5.1、将冻存于-80℃的菌株XN-42用LB固体板活化，30℃培养24h后挑取平板上的单菌落接种于液体LB培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养得到菌液。取1个OD600值的菌体，菌体用1mL的MSM培养基重悬，将重悬液加入19mL MSM基础培养基中，并添加OHHL母液(浓度为100mmol/L)，使其最终浓度为0.2mmol/L。在30℃，200rpm的条件下培养，于0d，1d，2d，3d和4d五个时间点取样，并将样品中残余的OHHL提取，利用HPLC测定OHHL的残留量表示菌株XN-42对OHHL的降解情况。
5.2、OHHL的提取方法
取7mL样品至15mL离心管中，以4000rpm的速度离心10min后，取5mL上清液至50mL分液漏斗中，并向分液漏斗中加入等体积的乙酸乙酯，剧烈震荡3min后，静置，分层，将下层溶液转移至刻度玻璃试管中，上层萃取液液经铺有滤纸的漏斗过滤到50mL圆底烧瓶中。下层溶液按上述方法再进行萃取。滤液旋转蒸发至干燥后，用色谱乙腈分两次洗涤圆底烧瓶，定容至2mL。最后经0.45μm有机滤膜过滤至进样瓶，待使用HPLC测定OHHL残余量。
5.3、OHHL的HPLC检测条件
HPLC仪器型号：Waters 2695。色谱柱：C18反相色谱柱(250谱柱(2695待使用法)。流速为0.5mL/min。柱温为30℃。流动相：乙腈：水＝70；30(v：v)。检测波长为210nm。进样量为20μL。
5.4、降解率计算方法
降解率(％)＝(1-A1/A0)×100，A1为降解菌处理后OHHL残留浓度，A0为对照处理后的OHHL残留浓度。
5.5、实验结果分析
HPLC检测结果如图6所示，图A为未接种菌株XN-42的对照图，图B、C、D、E、F分别为菌株XN-42在0d，1d，2d，3d和4d时对OHHL的降解图，其降解率分别达到0％，30％，50％，64％，73％，对应时间菌株XN-42的OD600值分别为0.002，0.547，0.640，0.784和0.683。实验表明，在OHHL以唯一碳源存在的条件下，菌株能够降解OHHL并利用其生长。
由图7可知，OHHL的降解与菌株生长呈正相关，在OHHL的存在下，菌株生长没有滞留期，迅速进入生长对数期，1d内为菌株生长的对数期，此时该菌株对OHHL的降解速率最快。
实施例6菌株XN-42对软腐病的生防效果研究
本实施例以植物软腐病致病菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovora,Pcc)Z3-3为例，研究菌株XN-42对依赖AHLs致病的致病菌的生防效果。
用LB固体培养基平板活化菌株XN-42，Z3-3，E.coli和B23，30℃培养。24h后分别挑取平板上的单菌落，接种至液体LB培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养至菌液OD600＞2.0。其中，苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Israelensis)B23为已知对OHHL具有降解效果的菌株(Dong Y,Xu J,Li X,et al.AiiA,an enzyme that inactivates the acylhom oserinelactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(7):3526-3531.)，E.coli为已知不具备降解OHHL的菌株。在生防实验中，将设置四个实验组：Z3-3+LB，Z3-3+E.coli，Z3-3+B23和Z3-3+XN-42。其中，实验组Z3-3+LB为空白对照组；Z3-3+E.coli为阴性对照组，Z3-3+B23为阳性对照组。
选取新鲜的马铃薯，白菜和胡萝卜作为实验材料，将材料用蒸馏水洗净，其中马铃薯和胡萝卜切成厚度约0.3cm的切片，白菜梗切为约6cm×4cm的小长方形。将Z3-3菌液分别与B23、E.coli、XN-42的菌液和液体LB培养基以一定比例混合，使XN-42、E.coli、B23、Z3-3最终工作OD600＝2.0。每个实验组的混合菌液取2μL分别接种至处理好的实验材料中央。加入湿水棉花保湿并用保鲜膜密封防止杂菌污染，放置28℃培养箱培养24h后观察结果。
结果如图8、图9和图10所示，在马铃薯、白菜和胡萝卜的生防实验中，实验组Z3-3+LB和Z3-3+E.coli的发病面积较实验组Z3-3+B23和Z3-3+XN-42发病面积较大，发病程度较为严重。即OHHL降解菌XN-42与致病菌共同接种较单独接种致病菌时软腐病病害症状明显减轻。实验结果表明，菌株XN-42在对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovora,Pcc)Z3-3引起的马铃薯软腐病，白菜软腐病和胡萝卜软腐病具有显著的生防效果。
通过上述实施例研究发现，该蜡样芽孢杆菌针对群体感应信号分子AHLs具有较好的降解活性，且降解效果稳定并显著，在防治AHLs介导致病的致病菌危害方面具有巨大的应用潜力，这为病害的生物防治提供了一种新的途径和方法。
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。