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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510182503.X (22)申请日 2015.04.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104860952 A (43)申请公布日 2015.08.26 (73)专利权人 贵州大学 地址 550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大 学 （北区） 科技处 (72)发明人 董南 (74)专利代理机构 贵阳东圣专利商标事务有限 公司 52002 代理人 徐逸心袁庆云 (51)Int.Cl. C07D 487/22(2006.01) 审查员 张倩 (54)发明名称。
2、 一种高纯度七元瓜环的提取分离方法 (57)摘要 本发明一种高纯度七元瓜环的提取分离方 法， 属于超分化学领域中的七元瓜环的提取分离 方法， 利用反相色谱法分离纯化常规分离方法得 到的含五、 六元瓜环及少量其他杂质的七元瓜 环， 使七元瓜环纯度达到99%或99%以上， 本发明 提取分离方法简单快速， 不使用有机溶剂做流动 相， 环保无污染色,得到的七元瓜环产品纯度高， 产率好， 色谱柱经处理后可反复使用， 成本低。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 104860952 B 2017.11.14 CN 104860952 B 1.一种高纯度七元瓜环的提取分离方法， 其特征在于用MCI 。
3、GEL CHP20P反相色谱填料 为固定相， 水为流动相的反相色谱法分离纯化常规分离方法得到的含五、 六元瓜环及少量 其他杂质的七元瓜环， 使七元瓜环纯度达到99%或99%以上。 2.根据权利要求1 所述的一种高纯度七元瓜环的提取分离方法， 其特征是提取分离方 法按下列步骤进行： （1） 样品准备： 将常规分离方法得到的含五、 六元瓜环及少量其他杂质的七元瓜环500 mg溶于30mL 水中， 40下搅拌10min， 过滤， 滤液备用； （2） 色谱柱的准备： 100g 型号为 MCIGEL CHP20P 反相色谱填料， 加入200 mL 甲醇浸 泡15min后倾倒出甲醇， 再加入200mL二次。
4、蒸馏水浸泡15min， 倒出水溶液后加适量二次蒸馏 水使固定相呈浆状， 将固定相倒入直径为3cm, 高度为50cm 的玻璃柱中， 1000mL二次蒸馏 水冲洗后备用； （3） 将上述准备好的30 mL 七元瓜环水溶液用滴管沿着玻璃柱的管壁缓慢地加入到色 谱柱的顶端， 同时打开柱子下端的阀门使溶液流出， 保持流速在1滴/ 秒， 待样品溶液全部 浸入到固定相中后， 关闭活塞； 塞入适量棉花于固定相的顶端并压入一些玻璃块以免在用 流动相冲洗时破坏固定相的层面影响分离效果； 用二次蒸馏水作为流动相进行冲洗， 保持 流速在1滴/ 秒， 每10mL 为一馏分进行收集， 大约收集80馏分即可； 硅胶薄层板点。
5、板追踪七 元瓜环， 单质碘为显色剂； （4） 合并步骤 （3） 中点板显示为纯七元瓜环的馏分， 65旋蒸浓缩至体积为20 mL, 冷 却至室温； （5） 沉淀： 将200 mL甲醇加入步骤 （4） 的浓缩液中得白色沉淀， 抽滤， 沉淀用20 mL 甲 醇， 20 mL 丙酮洗涤后置于真空干燥器中； （6） 烘干： 将步骤 （5） 的产品70干燥12h 即得七元瓜环的纯品； 上述样品用量改变， 其余试剂、 色谱柱固定相用量也随之按比例改变。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104860952 B 2 一种高纯度七元瓜环的提取分离方法 技术领域 0001 本发明属于化学领域中的色谱分离方法。 具。
6、体的说就是用反相色谱法分离纯化常 规分离方法得到的含五、 六元瓜环及少量其他杂质的七元瓜环， 使七元瓜环纯度达到99%或 99%以上。 背景技术 0002 瓜环化学是超分子化学领域中的一门新兴学科， 发展至今不过几十年的时间， 但 其优良的物理化学性质使其在超分子催化、 超分子组装、 分子识别、 离子通道、 超分子生物、 纳米科学、 超分子药物学等领域显现出广阔的应用前景。 同时其应用也渗透到环境科学、 生 命科学、 材料科学、 能源科学、 医药学等21世纪的热点领域。 0003 瓜环 （Qn） 是由苷脲、 甲醛在酸催化下经脱水缩合生成的一类超分子主体化合 物。 从瓜环结构来看 （见说明书附图。
7、1） ， 瓜环是具有类似于南瓜外形的环状化合物， 具有两 端开口的空腔， 其两端口大小相同， 端口直径小于空腔直径。 瓜环两端口分别分布着与其结 构单元数相同的羰基氧原子， 同时瓜环壁上分布着相当于结构单元数四倍的氮原子。 环绕 在端口极性较强的氧原子形成了良好的键结合位点， 所以能与亲水性的物质、 金属离子等 相互作用； 而其空腔是非极性、 疏水性的， 不仅可以包结有机分子， 还可以根据其空腔的大 小， 选择性的容纳尺寸、 形状相匹配的客体分子。 目前为止， 常见的瓜环 （Qn） 主要有五、 六、 七、 八元瓜环， 其结构参数列于下表1-1。 0004 表1-1 常见几种瓜环 （Qn） 的结。
8、构参数 0005 0006 瓜环不溶于有机溶剂， 难溶于水， 易溶于硫酸、 盐酸等， 酸度越大， 瓜环的溶解性越 大。 常见的几种瓜环中， 除五元瓜环 （Q5） 、 七元瓜环 （Q7） 在水中有中等强度的溶解度 （2 310 -2 molL-1） 之外， 其它瓜环成员的溶解度 （10-5molL-1） 都不好。 其次， 瓜环和冠 醚、 环糊精、 杯环烃相比具有更强的结构刚性。 既瓜环不能改变形状与不匹配的客体分子作 用， 因此瓜环具有强且专一的配位作用， 所得包合物的包合常数也会很高。 再者瓜环具有高 度对称性， 所以它的物理性质和化学性质都相当稳定， 呈现出很高的热稳定性和动力学稳 定性。 。
9、0007 从上面的分析可以看出， 在普通瓜环中无疑七元瓜环的应用价值最高。 因为它拥 说明书 1/4 页 3 CN 104860952 B 3 有良好的水溶性， 合适的空腔大小， 对大多数的有机客体分子有较好的分子识别能力， 因此 其在环境分离、 药物载体， 纳米材料等很多领域有很大的潜在应用价值。 可是七元瓜环的分 离又是最困难的。 现有的文献报道方法有酸-水分步法， 甘油分离法， 阳离子交换树脂法， 但 用这些方法分离得到的七元瓜环纯度不是很高， 只有90%-93%左右， 见说明书附图2， 附图4 所示， 七元瓜环里面总是混有微量的六元瓜环和五元瓜环不能除去。 不纯的七元瓜环将导 致七元瓜。
10、环的溶解度降低 （110-3mol/L， 热稳定性也降低， 极大地制约了七元瓜环的深入 研究。 如果用这些方法反复分离纯化七元瓜环， 可使瓜环的纯度达到95%以上， 但是劳动强 度很大， 有机试剂消耗量大而且产率只有10%左右。 因此我们发明了用MCI GEL CHP 20P （美 国色谱科公司） 反相色谱填料为固定相， 水为流动相的反相色谱进一步纯化七元瓜环的方 法， 可使七元瓜环的纯度达到99%以上(见说明书附图3， 附图5)， 产率52% 左右， 除去了五 元、 六元瓜环和其他少量的杂质。 重要的是该方法非常环保， 是绿色化学， 没有用到任何有 机试剂， 分离得到的不纯七元瓜环部分经处理。
11、后可再次上柱分离， 循环使用。 发明内容 0008 本发明的目的在于得到一种纯度极高的达99%以上的七元瓜环， 具体分离方法如 下： 0009 本发明一种高纯度七元瓜环的提取分离方法， 在于用MCI GEL CHP20P反相色谱填 料为固定相， 水为流动相的反相色谱法分离纯化常规分离方法得到的， 含五、 六元瓜环及少 量其他杂质的七元瓜环， 使七元瓜环纯度达到99%或99%以上。 0010 本发明一种高纯度七元瓜环的提取分离方法， 其提取分离方法按下列步骤进行： 0011 （1） 样品准备： 将常规分离方法得到的含五、 六元瓜环及少量其他杂质的七元瓜环 500 mg溶于30mL 水中， 40下。
12、搅拌10min， 过滤， 滤液备用； 0012 （2） 色谱柱的准备： 100g 型号为 MCI GEL CHP20P 反相色谱填料 （美国色谱科公 司） 加入200 mL 甲醇浸泡15min后倾倒出甲醇， 再加入200mL二次蒸馏水浸泡15min， 倒出水 溶液后加适量二次蒸馏水使固定相呈浆状， 将固定相倒入直径为3cm, 高度为50cm 的玻璃 柱中， 1000mL二次蒸馏水冲洗后备用； 0013 （3） 将上述准备好的30 mL 七元瓜环水溶液用滴管沿着玻璃柱的管壁缓慢地加入 到色谱柱的顶端， 同时打开柱子下端的阀门使溶液流出， 保持流速在1滴/ 秒， 待样品溶液 全部浸入到固定相中后，。
13、 关闭活塞， 塞入适量棉花于固定相的顶端并压入一些小玻璃块以 免在用流动相冲洗时破坏固定相的层面影响分离效果， 用二次蒸馏水作为流动相进行冲 洗， 保持流速在1滴/ 秒， 每10mL 为一馏分进行收集， 大约收集80馏分即可。 硅胶薄层板点 板追踪七元瓜环， 单质碘为显色剂； 0014 （4） 合并步骤 （3） 中的点板显示为纯的七元瓜环的馏分， 65旋蒸浓缩至体积为20 mL, 冷却至室温； 0015 （5） 沉淀： 将200 mL甲醇加入步骤 （4） 的浓缩液中得白色沉淀， 抽滤， 沉淀用20 mL 甲醇， 20 mL 丙酮洗涤后置于真空干燥器中； 0016 （6） 烘干： 将步骤 （5）。
14、 的产品70干燥12h， 即得七元瓜环纯品。 0017 上述样品用量改变， 其余试剂、 色谱柱固定相用量也随之按比例改变。 0018 上述不纯七元瓜环馏分循环使用的方法是： 合并步骤 （3） 中点板显示为不纯七元 说明书 2/4 页 4 CN 104860952 B 4 瓜环的馏分, 65旋蒸浓缩至体积为20 mL, 冷却至室温后加入200 mL 甲醇得白色沉淀， 抽滤， 沉淀用20 mL 甲醇， 20mL 丙酮洗涤后置于真空干燥器中， 70干燥12h 即得不纯的 七元瓜环产品， 里面主要含有五、 六元瓜环。 称取该样品4克， 加入500mL 二次蒸馏水搅拌30 min 后过滤除去沉淀， 滤液。
15、在65旋蒸浓缩至体积为20mL, 冷却至室温后加入200mL 甲醇 得白色沉淀， 抽滤， 沉淀用20mL甲醇， 20mL 丙酮分别洗涤后置于真空干燥器中， 70干燥 12h 即得七元瓜环第一次纯化产品， 再称取经一次纯化后的样品2克， 加入15mL 2.5mol/L HCl， 过滤， 滤液静置过夜后会有沉淀产生， 过滤除去沉淀， 滤液中加入150mL 甲醇产生白色 沉淀， 抽滤， 沉淀用20mL 甲醇， 20mL丙酮分别洗涤后置于真空干燥器中， 70干燥12h 既得 七元瓜环二次纯化产品， 纯度大约在90%左右， 该产品就可作为色谱分离的原料， 经色谱分 离纯化后得到更高纯度 （99%） 的七。
16、元瓜环。 0019 上述色谱柱的再生方法是： 以1mL/min的流速， 体积比为20% 的乙酸水溶液600mL 冲洗色谱柱后， 再用二次蒸馏水2000mL 冲洗即可使色谱柱再生， 进行下一次的分离。 当色 谱柱的使用超过6次时， 必须进行彻底的清洗， 再生， 保证色谱固定相填料孔径的恢复， 具体 方法如下： 固定冲洗流速为1mL/min， 依次用体积比20% 的乙酸水溶液600mL， 二次蒸馏水 2000mL， 体积比 20% 的甲醇水溶液400mL， 体积比50% 的甲醇水溶液400mL， 体积比 80% 的 甲醇水溶液400mL， 纯甲醇400mL， 体积比50% 的甲醇水溶液400mL，。
17、 1000mL 二次蒸馏水冲洗 色谱柱后， 即可使色谱柱再生。 0020 效果： 分离方法快速， 不使用有机溶剂做流动相， 环保绿色, 得到的七元瓜环产品 纯度高 （99%） ， 产率好 （52%） 。 分离得到的不纯七元瓜环可回收处理后循环使用， 同样地色 谱柱经处理后也可再生循环使用， 节约了成本。 附图说明 0021 图1： 瓜环的结构。 其中左图表示瓜环的结构， 右图中瓜环结构中的a表示瓜环的外 径， b表示瓜环空腔的内径， c表示瓜环端口直径， d表示瓜环的高度。 0022 图2： 不纯七元瓜环 （Q7） 的核磁氢谱图。 图中七元瓜环的1H NMR谱显示出三组共 振峰， 即其单元结构。
18、中亚甲基上Ha、 Hc的两组双重峰和次甲基上Hb的一组单峰， 在 =5.5 位 移附近有小峰， 表明七元瓜环里混有五元或六元瓜环， 而且基线不够平直 。 从其面积积分 比值可得到七元瓜环用常规方法处理后得到的纯度大约在90%左右。 0023 图3： 高纯度七元瓜环 （Q7） 的核磁氢谱图。 图中七元瓜环的1H NMR谱显示出三组 共振峰， 即其单元结构中亚甲基上Ha、 Hc的两组双重峰和次甲基上Hb的一组单峰， 无其它杂 质峰， 基线平直， 表明分离的七元瓜环其纯度可达到99% 以上。 0024 图4： 不纯七元瓜环 （Q7） 的质谱图。 七元瓜环的分子离子峰： 1185.4 （Q7+Na+）。
19、 ， 五元瓜环853.4 （Q5+Na+） 和六元瓜环1019.5 （ （Q6+Na+） 的分子离子峰。 0025 图5： 高纯度七元瓜环 （Q7） 的质谱图。 七元瓜环的分子离子峰： 1805 （Q7+Na+） 。 0026 具体实施方式： 0027 实施例1 高纯度七元瓜环的提取分离。 0028 （1） 样品准备： 将常规分离方法得到的含五、 六元瓜环及少量其他杂质的七元瓜环 500mg溶于30mL 水中， 40下搅拌10min， 过滤， 滤液备用； 0029 （2） 色谱柱的准备： 100g 型号为 MCIGEL CHP20P 反相色谱填料 （美国色谱科公 说明书 3/4 页 5 CN 。
20、104860952 B 5 司） 加入200 mL 甲醇浸泡15min后倾倒出甲醇， 再加入200mL二次蒸馏水浸泡15min， 倒出水 溶液后加适量二次蒸馏水使固定相呈浆状， 将固定相倒入直径为3cm, 高度为50cm 的玻璃 柱中， 1000mL二次蒸馏水冲洗后备用； 0030 （3） 将上述准备好的30 mL 七元瓜环水溶液用滴管沿着玻璃柱的管壁缓慢地加入 到色谱柱的顶端， 同时打开柱子下端的阀门使溶液流出， 保持流速在1滴/ 秒， 待样品溶液 全部浸入到固定相中后， 关闭活塞。 塞入适量棉花于固定相的顶端并压入一些玻璃块以免 在用流动相冲洗时破坏固定相的层面影响分离效果。 用二次蒸馏水。
21、作为流动相进行冲洗， 保持流速在1滴/ 秒， 每10mL 为一馏分进行收集， 大约收集80馏分即可。 硅胶薄层板点板追 踪七元瓜环， 单质碘为显色剂； 0031 （4） 根据点板显示纯七元瓜环的馏分为第8到第20馏分， 合并第8到第20馏分共计 130mL溶液， 65旋蒸浓缩至体积为20 mL, 冷却至室温； 0032 （5） 沉淀： 将200 mL甲醇加入步骤 （4） 的浓缩液中得白色沉淀， 抽滤， 沉淀用20 mL 甲醇， 20 mL 丙酮洗涤后置于真空干燥器中； 0033 （6） 烘干： 将步骤 （5） 的产品70干燥12h后得到七元瓜环纯品260mg， 产率为52%， 经1H NMR和。
22、质谱测定， 纯度为99%， 见说明书附图3和5。 0034 实施例2 不纯七元瓜环的循环使用。 0035 多次合并实施例1中分离点板检测为不纯七元瓜环的馏分共计2000mL， 65旋蒸 浓缩至体积为50 mL, 冷却至室温后加入400 mL 甲醇得白色沉淀， 抽滤， 沉淀用20 mL 甲 醇， 20mL 丙酮洗涤后置于真空干燥器中， 70干燥12h 即得不纯的七元瓜环产品， 里面主 要含有五、 六元瓜环。 称取该样品4g， 加入500mL 二次蒸馏水搅拌30 min 后过滤除去沉淀， 滤液在65旋蒸浓缩至体积为20mL, 冷却至室温后加入200mL 甲醇得白色沉淀， 抽滤， 沉 淀用20mL甲。
23、醇， 20mL 丙酮分别洗涤后置于真空干燥器中， 70干燥12h 即得七元瓜环第一 次纯化产品。 再称取一次纯化后的样品2g， 加入15mL 2.5mol/L HCl， 过滤， 滤液静置过夜后 会有沉淀产生， 过滤除去沉淀， 滤液中加入150mL 甲醇产生白色沉淀， 抽滤， 沉淀用20mL 甲 醇， 20mL丙酮分别洗涤后置于真空干燥器中， 70干燥12h 既得七元瓜环二次纯化产品， 纯 度大约在90%左右， 该产品就可作为色谱分离的原料， 经色谱分离纯化后得到更高纯度 （99%） 的七元瓜环。 0036 实施例3 色谱柱的再生 0037 色谱柱的再生： 以1mL/min的流速， 体积比为20。
24、% 的乙酸水溶液600mL冲洗色谱柱 后， 再用二次蒸馏水2000mL 冲洗即可使色谱柱再生， 进行下一次的分离， 当色谱柱的使用 超过6次时， 必须进行彻底的清洗， 再生， 保证色谱固定相填料孔径的恢复， 具体方法如下： 固定冲洗流速为1mL/min， 依次用体积比20%的乙酸水溶液600mL， 二次蒸馏水2000mL， 体积 比 20% 的甲醇水溶液400mL， 体积比50% 的甲醇水溶液400mL， 体积比 80% 的甲醇水溶液 400mL， 纯甲醇400mL， 体积比50% 的甲醇水溶液400mL， 1000mL 二次蒸馏水冲洗色谱柱后， 即可使色谱柱再生。 说明书 4/4 页 6 CN 104860952 B 6 图1 图2 说明书附图 1/4 页 7 CN 104860952 B 7 图3 说明书附图 2/4 页 8 CN 104860952 B 8 图4 说明书附图 3/4 页 9 CN 104860952 B 9 图5 说明书附图 4/4 页 10 CN 104860952 B 10 。