利用离体植株组织生产紫杉醇的方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200410060963.7

申请日:

2004.10.15

公开号:

CN1628506A

公开日:

2005.06.22

当前法律状态:

终止

有效性:

无权

法律详情:

未缴年费专利权终止IPC(主分类):C07D 305/14申请日:20041015授权公告日:20070404终止日期:20131015|||授权|||实质审查的生效|||公开

IPC分类号:

A01H3/04; A01H4/00; C07D305/14

主分类号:

A01H3/04; A01H4/00; C07D305/14

申请人:

华中科技大学;

发明人:

余龙江; 刘智; 赵春芳; 付春华; 杨英; 杨秦; 李丽琴

地址:

430074湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号

优先权:

专利代理机构:

华中科技大学专利中心

代理人:

方放

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内容摘要

利用离体植株组织生产紫杉醇的方法,属于生产药物的生物方法,具体涉及利用红豆杉科植株枝叶生产紫杉醇的方法,解决目前红豆杉枝叶采摘后直接提取的缺点,目的是提高采摘红豆杉枝叶中紫杉醇含量。本发明依序包括下述步骤:(1)选择季节采摘当年生红豆杉新鲜枝叶;(2)清洗、晾干并合理裁剪;(3)在黑暗、荫凉和外加营养条件下通过扦插或枝叶剪碎后组织培养;(4)培养的同时对外植体诱导处理;(5)培养过程的同时在培养基中添加紫杉醇生物合成的前体物质;(6)采用常规方法低温粉碎、有机溶剂浸提,得到紫杉醇浸提物。本发明大大提高紫杉醇的产量,降低前体物的含量,产品易于回收,无污染物排放。

权利要求书

1: 利用离体植株组织生产紫杉醇的方法,依序包括下述步骤:(1)选择 春秋季节,采摘当年生红豆杉新鲜枝叶;(2)预处理:清洗去除新鲜枝 叶中杂质,晾干,裁剪其长度至20-40cm;(3)将裁剪后的红豆杉枝叶 扦插于无菌固体改良MS培养基上、或者将剪碎后的红豆杉枝叶培养于无 菌液体改良MS培养基中,外加营养,保持外植体活性,培养基中添加药 剂抑制杂菌污染,培养环境条件黑暗、荫凉、干净;(4)上述步骤(3) 培养过程的同时诱导处理:分别采用真菌诱导子,稀土元素或化学诱导 剂对外植体诱导,扦插培养3-6天,剪碎培养1-3天;(5)上述步骤 (3)培养过程的同时在培养基中添加紫杉醇生物合成的前体物质;(6) 对经过前述培养、诱导、前体添加的红豆杉枝叶采用常规方法低温粉碎、 有机溶剂浸提,得到紫杉醇浸提物。
2: 如权利要求1所述生产紫杉醇的方法,其特征是所述步骤(3)中, 培养条件为:黑暗,温度15-30℃,紫外灭菌保持环境干净,培养基中 添加50mg/L重铬酸钾或50mg/L卡那霉素以防止防止杂菌污染。
3: 如权利要求1或2所述生产紫杉醇的方法,其特征是所述步骤(4) 中,真菌诱导子为红豆杉树皮中分离得到内生的黑曲霉、青霉菌、链霉 菌、酵母或赤霉菌的细胞壁多糖提取物,浓度为50mg/L;稀土元素包括 硝酸镧、硫酸铈铵、硝酸亚铈,浓度为2mg/L;化学诱导剂包括茉莉酸 甲酯、浓度为100μmol/L,茉莉酸、浓度为100μmol/L,水杨酸、浓度 为80mg/L,矮壮素、浓度为10mg/L,乙烯利、浓度为1-5mg/L。
4: 如权利要求1或2所述生产紫杉醇的方法,其特征是在所述步骤(5) 中,添加的前体物质分别为:苯丙氨酸、浓度为2mmol/L,苯甲酸钠、 浓度为0.5mmol/L,醋酸钠、浓度为2mmol/L,甘氨酸、浓度为0.1 mmol/L。
5: 如权利要求3所述生产紫杉醇的方法,其特征是在所述步骤(5)中, 添加的前体物质分别为:苯丙氨酸、浓度为2mmol/L,苯甲酸钠、浓度 为0.5mmol/L,醋酸钠、浓度为2mmol/L,甘氨酸、浓度为0.1mmol/L。

说明书


利用离体植株组织生产紫杉醇的方法

    【技术领域】

    本发明属于生产药物的生物方法,具体涉及利用红豆杉科植株枝叶生产紫杉醇的方法。

    背景技术

    目前,紫杉醇由于其独特的抑瘤机理和显著的抗癌活性,雄踞抗癌药物市场份额的首位,占世界尚主要抗癌药物市场份额的22%。2000年,BMS公司报道,年紫杉醇针剂(TaxolTM)销售额为159.2亿美元,平均每天销售额大于430万美元。天然紫杉醇主要来源于红豆杉属(Taxus)植株,为常绿乔木或灌木,全世界约有11种,我国是红豆杉原生地之一,有其中的4种和1个变种,即西藏红豆杉(T.wallichiana)、东北红豆杉(T.cuspidata)、云南红豆杉(T.yunnanensis)、中国红豆杉(T.chinensis)和南方红豆杉(T.chinensis var mairei)。天然紫杉醇的含量很低,大约只有红豆杉树皮干重的0.01%,每治疗一个癌症患者需要3-6棵60-100年生的红豆杉主干树皮,而且由于红豆杉植株生长缓慢,定量砍伐已经造成了红豆杉资源的极度缺乏,见刘本叶,叶和春利用生物技术生产紫杉醇的研究进展.生物学通报,1999,34:5~8。化学全合成生产紫杉醇虽然已经完成,但需要的步骤复杂,耗费巨大,不具备大规范商业化生产的价值,见Nicolaou K.C.,Yang Z.,Liu J.J.,Ueno H.,Nantermet P.G.,GuyK.K.,Guy R.K.,Claiborne C.F.,Renaud J.,Couladouros E.A.Paulvannan K.,Sorensen E.J.Total synthesis of taxol.Nature,1994,367:630~634。生物方法生产紫杉醇被认为是解决紫杉醇来源问题最具前景的途径,目前许多公司采用半合成的办法来生产紫杉醇,即从红豆杉枝叶中提取紫杉醇的前体物,然后通过化学修饰,合成紫杉醇及其类似物,见周忠强,梅兴国,常俊丽,陈菁,柯铁,紫杉醇化学半合成进展,广州化学,2000,26(3):52~60。采摘回来地红豆杉枝叶一般通过杀青处理,然后粉碎,烘干,进一步采用化学药剂浸提,获得浸膏,然后通过分离纯化,得到紫杉醇和各种紫杉烷的纯品,见阎家麟,范金城,王九一,紫杉醇提取纯化工艺,中国医药工业杂志,1996,27(12):531~534。以上生产工艺中,植物材料没有经过合理的采后加工处理,不仅枝叶中的紫杉醇含量低,而且在上述生产过程中,紫杉醇及其前体物降解严重,带来目标化合物得率低和产量不稳定等问题。

    【发明内容】

    本发明提供一种利用离体植株组织生产紫杉醇的方法,建立了合理的采摘工艺和采后加工技术,解决目前红豆杉枝叶采摘后直接提取的缺点,目的是提高采摘红豆杉枝叶中紫杉醇含量。

    本发明的一种利用离体植株组织生产紫杉醇的方法,依序包括下述步骤:(1)选择春秋季节,采摘当年生红豆杉新鲜枝叶;(2)预处理:清洗去除新鲜枝叶中杂质,晾干,裁剪其长度至20-40cm;(3)将裁剪后的红豆杉枝叶扦插于无菌固体改良MS培养基上、或者将剪碎后的红豆杉枝叶培养于无菌液体改良MS培养基中,外加营养,保持外植体活性,培养基中添加药剂抑制杂菌污染,培养环境条件黑暗、荫凉、干净;(4)上述步骤(3)培养过程的同时诱导处理:分别采用真菌诱导子,稀土元素或化学诱导剂对外植体诱导,扦插培养3-6天,剪碎培养1-3天;(5)上述步骤(3)培养过程的同时在培养基中添加紫杉醇生物合成的前体物质;(6)对经过前述培养、诱导、前体添加的红豆杉枝叶采用常规方法低温粉碎、有机溶剂浸提,得到紫杉醇浸提物。

    上述的生产紫杉醇的方法,其特征是所述步骤(3)中,培养条件为:黑暗,温度15-30℃,紫外灭菌保持环境干净,培养基中添加50mg/L重铬酸钾或50mg/L卡那霉素以防止防止杂菌污染。

    上述生产紫杉醇的方法,所述步骤(4)中,真菌诱导子为红豆杉树皮中分离得到内生的黑曲霉、青霉菌、链霉菌、酵母或赤霉菌的细胞壁多糖提取物,浓度为50mg/L;稀土元素包括硝酸镧、硫酸铈铵、硝酸亚铈,浓度为2mg/L;化学诱导剂包括茉莉酸甲酯、浓度为100μmol/L,茉莉酸、浓度为100μmol/L,水杨酸、浓度为80mg/L,矮壮素、浓度为10mg/L,乙烯利、浓度为1-5mg/L。

    上述生产紫杉醇的方法,在所述步骤(5)中,添加的前体物质分别为:苯丙氨酸、浓度为2mmol/L,苯甲酸钠、浓度为0.5mmol/L,醋酸钠、浓度为2mmol/L,甘氨酸、浓度为0.1mmol/L。

    本发明方法的反应原理是:有选择的采摘生理活性高的红豆杉枝叶,利用植物体内固有的紫杉醇合成酶系,选择合的诱导和反应条件,添加诱导子促进红豆杉枝叶中固有的酶系活性,将其中高含量的前体物质转化为附加值高的紫杉醇,紫杉醇含量提高了67%左右,并添加前体物质,使红豆杉枝叶中的紫杉醇代谢前体物质朝合成紫杉醇的方向转化,提高枝叶中紫杉醇的得率。

    本发明的优点在于:

    1.利用红豆杉植株的可再生的当年生枝叶,代替传统紫杉醇提取工艺中采用的红豆杉主干树皮,不仅不会对红豆杉资源造成破坏,而且可以进行有效的开发利用。

    2.对采集的红豆杉枝叶进行有效的诱导和调控,使枝叶中的次生代谢前体物质转化为紫杉醇,代替传统工业中采用的直接提取前体,然后进行体外半合成的方法,有效的利用了枝叶中丰富的酶系,催化前体物质合成具有药用价值的紫杉醇,工艺更简单。

    3.传统工艺中,红豆杉枝叶在存放过程中常会发生紫杉醇和前体物质降解,导致提取得率低下和不稳定;本发明中,采用合适的采后条件,包括温度、光照、营养、外加前体物质和诱导等,充分保持红豆杉枝叶的生理活性,并促使枝叶中的前体物质向紫杉醇合成的方向转化。

    4.传统工业中,红豆杉枝叶中紫杉醇含量低,代谢前体成分复杂,含量各异,因此提取和纯化需要大量的步骤和费用;本发明中,通过体外培养,将红豆杉枝叶中大量的前体物质转化为紫杉醇,提高了外植体中有用成分的含量,使提取成分单一,效率更高。

    5.整个反应,无需外加酶系,生产成本低。

    6.产品易于回收,生产工艺简单,无污染物排放。

    【具体实施方式】

    实施例1

    春季采集红豆杉当年生枝叶,裁剪至20cm左右,无菌条件下取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,100μmol.L-1茉莉酸甲酯(MJ)诱导紫杉醇及其前体物质的产生。培养环境紫外灭菌,25±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高67%。

    实施例2

    秋天采集红豆杉当年生枝叶,裁剪至40cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于200mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L真菌诱导子黑曲霉细胞壁多糖诱导紫杉醇及其前体物质的产生。25±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高60%。

    实施例3

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1卡那霉素,抑制污染,2mg/L硝酸亚铈诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第3天取样分析,紫杉醇含量提高37%。

    实施例4

    春季采样,无菌条件下分别剪碎约5g针叶+5g树皮组织(2×4mm左右大小),接种于100mL液体改良MS培养基中,同上添加50mg.L-1重铬酸钾和100uM茉莉酸甲酯。25±1℃,120r/mL暗培养,于接种后第1d取样分析,紫杉醇含量提高40%。

    实施例5

    秋季采样,流水冲洗干净,无菌条件下分别剪碎约5g针叶+5g树皮组织(2×4mm左右大小),接种于100mL液体改良MS培养基中,同上添加50mg.L-1卡那霉素和50mg/L真菌诱导子黑曲霉多糖。25±1℃,120r/mL暗培养,于接种后第3d取样分析,紫杉醇含量提高41%。

    实施例6

    秋季采样,无菌条件下分别剪碎约5g针叶+5g树皮组织(2×4mm左右大小),接种于100mL液体改良MS培养基中,同上添加50mg.L-1重铬酸钾和2mg/L硝酸亚铈。培养环境紫外灭菌,30±1℃,120r/mL暗培养,于接种后第1d取样分析,紫杉醇含量提高43%。

    实施例7

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制霉污染,100uM茉莉酸诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第3天取样分析,紫杉醇含量提高43%。

    实施例8

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,80mg/L水杨酸诱导紫杉醇及其前体物质的产生。15℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高30%。

    实施例9

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,10mg/L矮壮素诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高38%。

    实施例10

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L青霉菌细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高18%。

    实施例11

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L链霉菌细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高27%。

    实施例12

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L根霉细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高27%。

    实施例13

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L酵母细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高41%。

    实施例14

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L赤霉菌细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高43%

    实施例15

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,2mg/L硝酸镧诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高14%。

    实施例16

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,2mg/L硫酸铈铵诱导紫杉醇及其前体物质的产生。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高17%。

    实施例17

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,2mg/L硝酸亚铈诱导紫杉醇及其前体物质的产生,同时添加2mmol/L苯丙氨酸。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高48%。

    实施例18

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,100μmol/L茉莉酸甲酯和5mg/L乙烯利诱导紫杉醇及其前体物质的产生,同时添加0.5mmol/L苯甲酸钠前体物质。30±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高61%。

    实施例19

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L黑曲霉细胞壁多糖提取物诱导紫杉醇及其前体物质的产生,同时添加2mmol/L醋酸钠前体物质。25±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高57%。

    实施例20

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,无菌条件下分别剪取25g枝叶扦插于100mL固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,80mg/L水杨酸诱导和1mg/L乙烯利紫杉醇及其前体物质的产生,同时添加0.1mmol/L甘氨酸。25±1℃暗培养,于接种后第6天取样分析,紫杉醇含量提高48%。

    实施例21

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,剪取5000g枝叶扦插于固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1重铬酸钾,抑制污染,50mg/L黑曲霉细胞壁多糖诱导紫杉醇及其前体物质的产生,同时添加0.1mmol/L甘氨酸。25℃暗培养,于接种后第6天,提取红豆杉枝叶,获得紫杉醇及其前体物质地浸膏,经分析,紫杉醇含量提高48%。

    实施例22

    春季采样,枝叶裁剪至30cm左右,剪取5000g枝叶扦插于固体改良MS培养基中,添加50mg.L-1卡那霉素,抑制污染,100μmol/L茉莉酸甲酯和5mg/L乙烯利诱导紫杉醇及其前体物质的产生,同时添加2mmol/L苯丙氨酸。25℃暗培养,于接种后第6天,制备紫杉醇及其前体浸膏,经分析,紫杉醇含量提高56%。

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利用离体植株组织生产紫杉醇的方法,属于生产药物的生物方法,具体涉及利用红豆杉科植株枝叶生产紫杉醇的方法,解决目前红豆杉枝叶采摘后直接提取的缺点,目的是提高采摘红豆杉枝叶中紫杉醇含量。本发明依序包括下述步骤:(1)选择季节采摘当年生红豆杉新鲜枝叶;(2)清洗、晾干并合理裁剪;(3)在黑暗、荫凉和外加营养条件下通过扦插或枝叶剪碎后组织培养;(4)培养的同时对外植体诱导处理;(5)培养过程的同时在培养基。

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