13-己基黄藤素的制备及其抗病毒和抗菌作用 [1]概述
1.13-己基黄藤素(其盐酸盐见化学式〔I〕)是以黄藤素为原料，经结构改造而得的黄藤素衍生物。黄藤素收载于1977年版中华人民共和国药典，又名氯化巴马汀，原是一种抑菌抗炎药，据报道在70年代临床已应用15万例以上。黄藤素有季铵盐结构(化学式〔II〕)，与小檗碱的结构十分接近，它能作用和影响病毒和细菌的DNA、蛋白质、酶，因而在临床上具有相对广谱的抗菌活性。但是季铵盐的亲脂性较差，难以通过组织的脂质膜，因此影响其吸收利用和作用强度。本发明采用正交优化的新型衍生制备方法，制备了13-己基黄藤素(盐酸盐)。体外抗菌试验表明，本品抗葡萄菌的作用最高可比黄藤素强32倍以上。药理动物模型试验首创发现，13-己基黄藤素还具有很强的抗病毒作用。抗病毒所需剂量很低，对感染流感病毒小鼠腹腔给药，只需0.2mg/kg剂量就有显著的保护效果。而测定13-己基黄藤素盐酸盐的静注急性毒性，与黄藤素的毒性十分接近，LD50＞30mg/kg，说明衍生物的毒性并无增加。因此，13-己基黄藤素作为一种新的抗病毒和抗生药物，具有巨大潜力，是十分有前途的。
13-己基黄藤素(盐酸盐)
黄藤素(盐酸盐) 二氢黄藤素
[2]工艺方法
1.13-己基黄藤素合成路线
2.二氢黄藤素(盐酸盐)制备
将20.0g黄藤素溶解于400mL0.3～5％氢氧化钠或氢氧化钾溶液。另取0.5～3.0g硼氢化钠溶于200mL0.3～5％氢氧化钠或氢氧化钾溶液，得到稳定化的硼氢化钠溶液。将经碱稳定化处理的硼氢化钠溶液滴入黄藤素溶液，室温下搅拌反应2～4小时。抽滤，将滤上物水洗至滤液呈中性，得到二氢黄藤素粗品；将二氢黄藤素粗品以10～40％乙醇和60～95％乙醇精制，在50％丙酮中析出二氢黄藤素盐粉状晶体，产率约80％。
3.13-己基黄藤素盐酸盐的合成
取二氢黄藤素10.0g，以800mL50～100％乙醇溶液溶解，加150～300mL冰醋酸，正己醛10～200mL，摇匀后80～95℃水浴加热回流1～8小时，减压浓缩后加入1～10％盐酸溶液(v/v)500mL，搅匀后静置，将析出物过滤并用水充分洗涤，得到13-己基黄藤素粗品；将13-己基黄藤素粗品溶于5～20％乙醇——盐酸混合溶液，以非极性(或弱极性)大孔吸附树脂吸附，依次用盐酸溶液及不同浓度的乙醇——盐酸混合溶液洗脱，解吸液浓缩至无醇，静置后析出13-己基黄藤素(盐酸盐)晶体。产率＞55％。
[3]13C-NMR测定
1.13-己基黄藤素(盐酸盐)的13C-NMR测定
13C-NMR(CD3OD，AV-500)，测定图谱见说明书附图。
δ：31.37(1’C)，32.86(2’C)，31.37(3’C)，24.15(4’C)，33.17(5’C)，14.81(6’C)，29.41(C-5)，59.68(C-6)，57.27(C(3)-Ome)，57.83(C(2)-Ome)，58.15(C(10)-Ome)，63.19(C(9)-Ome)，112.95(C-4)，115.59(C-1)，122.58(C-12)，127.95(C-11)，121.36(C-1a)，123.68(C-8a)，135.20(C-12a)，134.31(C-4a)，136.53(C-13)，138.51(C-13a)，145.76(C-8)，146.98(C-9)，150.15(C-2)，153.80(C-3)，152.21(C-10).
[4]药理和毒理
1.13-己基黄藤素的药理试验
对感染致死剂量甲型流感病毒的小鼠，腹腔给予0.4mg/kg地13-己基黄藤素，5日内给药3次，即可显著降低流感小鼠的肺病变指数并显著降低死亡率。而对照阳性药利巴韦林在相同条件下则需剂量50mg/kg方才有类似的效果。此外，体外抗菌试验表明，13-己基黄藤素对于抗性金黄色葡萄球菌(氨苄青霉素抗性+帕那沙星抗性+头孢霉素抗性)及对常规金葡菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为8μg/ml和16μg/ml，作用强度比黄藤素强16倍至32倍以上。而毒性试验(LD50)则表明，13-己基黄藤素血管给药的急性毒性与黄藤素十分接近，LD50＞30mg/kg，毒性无明显增加。由此说明，13-己基黄藤素盐酸盐作为黄藤素的衍生改造产品是十分成功的，它将成为一种新的抗病毒药和抗菌药，具有良好前途。
实施例1：二氢黄藤素的制备
将20.0g黄藤素溶解于400mL0.5％氢氧化钠溶液。另取1.6g硼氢化钠溶于200mL0.5％氢氧化钠溶液，得到稳定化的硼氢化钠溶液。将经碱稳定化处理的硼氢化钠溶液滴入黄藤素溶液，室温下搅拌反应3.0小时。抽滤，将滤上物水洗至滤液呈中性，得到二氢黄藤素粗品；将二氢黄藤素粗品以100mL温热的30％乙醇溶液溶解，冷却后抽滤，滤上物以100mL70％乙醇溶液溶解，迅速抽滤，滤上物以200ml盐酸的丙酮温热溶解，加等体积水，搅匀后静置，将析出物抽滤并用水充分洗涤至滤液呈中性，经干燥后得到二氢黄藤素粉末状晶体17.0g，产率为85.0％。
实施例2：13-己基黄藤素盐酸盐的合成
取二氢黄藤素10.0g，以800mL80％乙醇溶液溶解，加200mL冰醋酸，正己醛30mL，摇匀后95℃水浴加热回流3小时，减压浓缩后加入2％盐酸溶液500mL，搅匀后静置，将析出物过滤并用水充分洗涤，得到13-己基黄藤素粗品：将13-己基黄藤素粗品溶于5～20％乙醇——0.5～2％盐酸混合溶液，以D-101(或AB-8或D-130或其它类似非极性或弱极性)大孔吸附树脂吸附，依次用盐酸溶液及20％、40％、60％、95％乙醇——1％盐酸溶液洗脱，收集60％乙醇——1％盐酸溶液的洗脱液，浓缩至无醇，冷却、静置，抽滤析出物，得到13-己基黄藤素(盐酸盐)晶体5.2g，纯度99.6％，产率为52.0％。
实施例3：13-己基黄藤素的抗病毒试验
1.材料
病毒：甲型流感病毒A/PR/8/34(中国预防医科院病毒所)，制备成鸡胚尿囊液，血凝滴度640以上。
小鼠：ICR鼠，13-16g，雌雄各半。
2.方法 小鼠先分组，各组用乙醚轻度麻醉，以病毒尿囊液(20倍半致死量)滴鼻感染小鼠。1日后按设定剂量腹腔给受试药，对照给生理盐水。隔日给药一次，5日共给药3次，首次给药量加倍，5天后介剖测定病变肺指数(下表1)。另批小鼠在给药后14天后作死亡率统计(下表2)。
3.结果
表1：13-己基黄藤素(简称13-HP)对甲型流感病毒感染小鼠肺指数的影响( x±s)
组别 剂量 动物数 肺指数值 肺指数抑制率
(mg/kg) (只) (g/10g) (％)
病毒对照组 - 10 0.180±0.088
利巴韦林组 50.0 10 0.103±0.014* 42.8
13-HP1组 0.1 10 0.160±0.062 11
13-HP2组 0.2 10 0.140±0.038 22
13-HP3组 0.4 10 0.120±0.034 33
13-HP4组 0.8 10 0.101±0.046* 44
与病毒对照组比较*p＜0.05；肺指数＝小鼠肺重/小鼠体重。
表2：13-己基黄藤素(13-HB)对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
组别 动物数 剂量 死亡数 保护率 存活天数
(只) (mg/kg) (只) (％) (x±s)
正常对照组 16 -- 0 100.0 14.0
病毒对照组 16 - 14 12.5 7.13±3.45
利巴韦林组 16 50.0 6 50.0* 10.30±3.40*
13-HPI组 16 0.1 4 61.5** 10.63±3.26*
13-HPII组 16 0.2 3 68.8** 11.67±3.40**
13-HPIII组 16 0.4 2 75.0** 12.20±3.41**
与病毒对照组比较*p＜0.05 **p＜0.01
表1和表2结果表明，13-己基黄藤素具有减轻甲型流感病毒感染小鼠肺部病变的作用，延长感毒小鼠存活天数降低死亡数。
实施例4：13-己基黄的抗菌试验
1.材料与方法
菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC25925)、金黄色葡萄球菌(氨苄青霉素抗性+帕那沙星抗性)、金黄色葡萄球菌(氨苄青霉素抗性+帕那沙星抗性+头孢霉素抗性)、表皮葡萄球菌的肉汤培养物以及白色念球菌(ATCC10231)标准菌株的查氏培养基培养物。
培养基：M-H(Mueller-Hinton Agar)培养基，白念菌用查氏培养基。平板培养，用多点接种仪接种。37℃培养18小时。
2.结果
1、13-己基黄藤素抗菌活性 菌名 药物浓度(μg/ml) MIC 128 64 321684210.50 金黄色葡萄球菌① - - ---+++++ 8 金黄色葡萄球菌② - - -+++++++ 32 金黄色葡萄球菌③ - - -+++++++ 32 表皮葡萄球菌 - - -+++++++ 32 白色念球菌 - - --++++++ 16
①ATCC25925；②氨苄青霉素抗性+帕那沙星抗性：③氨苄青霉素抗性+帕那沙星抗性+头孢霉素抗性。
2、黄藤素抗菌活性 菌名 药物浓度(μg/ml) MIC128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0 金黄色葡萄球菌①+ + + + + + + + + + ＞128 金黄色葡萄球菌②- - + + + + + + + + 64 金黄色葡萄球菌③+ + + + + + + + + + ＞128 表皮葡萄球菌- - - + + + + + + + 32 白色念球菌+ + + + + + + + + + ＞128
①②③菌种特性如前。
3、链霉素抗菌活性 菌名 药物浓度(μg/ml) MIC 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0 金黄色葡萄球菌① - - - - - - - + + + 2 金黄色葡萄球菌② - - - - - - - + + + 2 金黄色葡萄球菌③ - - - - - - + + + + 4 表皮葡萄球菌 - - - - - - + + + + 4 白色念球菌 + + + + + + + + + + ＞128
①②③菌种特性如前。
以上1.2.3.表表明，13-己基黄藤素对金黄色葡萄球菌的标准株及抗药性株都有较强的抗菌作用，其作用比黄藤素增强8倍至32倍以上。13-己基黄藤素在16μg/ml以上浓度表现有抗白色念珠菌的作用，具有一般抗菌素所不多见的特色。