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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610108287.9 (22)申请日 2016.02.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105648030 A (43)申请公布日 2016.06.08 (73)专利权人 云南省热带作物科学研究所 地址 666100 云南省西双版纳傣族自治州 景洪市宣慰大道99号 (72)发明人 高锋张春霞何明霞曹旸 刘静方艺伟许欣景王文兵 王云 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (51)Int.Cl. C12Q 1/。
2、04(2006.01) (56)对比文件 CN 102080120 A,2011.06.01, CN 101775433 A,2010.07.14, 李晓等.黑木耳母种继代培养次数与菌种退 化关系研究. 黑龙江农业科学 .2015, (第4期), 138-139. 李红等.食用菌菌种退化原因分析及复壮方 法的探讨. 辽宁农业科学 .2010, (第4期),53- 55. Kai-Ping Ji等.Cultivation of Phlebopus portentosus in southern China. Mycologiacl Progress .2010,第10卷(第3 期),293-30。
3、0. 审查员 刘超 (54)发明名称 一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法 (57)摘要 本发明公开了一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰 退的判定方法， 通过观察菌落形态、 测定生长速 率、 测定菌落淀粉酶分泌能力、 可溶性蛋白分析、 酯酶同工酶分析等步骤， 对暗褐网柄牛肝菌菌种 活性作出预判， 找到可以表征暗褐网柄牛肝菌菌 种随继代次数增多发生衰退的生理生化特征， 为 菌种活力鉴定提供了快速有效的判定方法， 该方 法为暗褐网柄牛肝菌的菌种衰退提供了有效的 判定依据， 大大降低了误用衰退菌株的风险， 有 利于暗褐网柄牛肝菌栽培技术的推广。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 105648030 。
4、B 2018.12.11 CN 105648030 B 1.暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法， 其特征在于， 包括如下步骤： （1） 观察菌落形态、 测定生长速率： 菌株30避光培养， 分别于至少5个不同时间点十字 交叉法测量菌落半径， 计算平均菌落生长速率； 同时于菌丝体长满培养皿时观察菌落形态 特征； 与菌株第一代原种相比， 菌落吐水少， 菌核小， 平均菌落生长速率变化率10%； 所述平均菌落生长速率变化率= （ 菌株平均菌落生长速率第一代原种平均菌落生长 速率 ） /第一代原种平均菌落生长速率100%； 所述平均菌落生长速率为： 以不同时间点为横坐标， 不同时间点对应的平均菌落半径 。
5、为纵坐标， 获取的直线斜率即为菌株平均菌落生长速率； （2） 测定菌落淀粉酶分泌能力： 菌株培养15天后用刚果红法或卢戈氏碘液法获得淀粉 变色圈， 然后采用十字交叉法测定平均菌落直径和平均变色圈直径， 并与菌株第一代原种 对应结果数据进行比较， 采用刚果红法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度10%， 采用卢戈氏碘液法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度5%； （3） 可溶性蛋白分析： 菌株150 rpm、 30避光振荡培养7天， 过滤， 滤渣清洗， 除水， 液氮 研磨至粉碎， 取粉碎物用pH为7.2 的磷酸盐缓冲液混匀， 12000 rpm离心10min， 吸取上清液 即为可溶性蛋白样品。
6、， 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行可溶性蛋白分析， 与菌株第一代 原种相比， 相对分子量为40.0kDa的可溶性蛋白条带变弱， 而相对分子量为22.0 kDa的可溶 性蛋白条带增强； （4） 酯酶同工酶分析： 菌株150 rpm、 30避光振荡培养7天， 过滤， 滤渣清洗， 除水， 液氮 研磨至粉碎， 取粉碎物用pH为5.6的磷酸盐缓冲液混匀， 12000 rpm离心10min， 吸取上清液 即为酯酶同工酶样品， 使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酯酶同工酶分析， 与菌株第一 代原种相比， 相对分子量为37.0 kDa的酯酶同工酶活性增强。 2.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判。
7、定方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所用培养基为M1固体培养基，（3） 和 （4） 中所用培养基为M1液体培养基。 3.根据权利要求2所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法， 其特征在于， 按重 量份计， 所述M1液体培养基的成分组成为： 去皮马铃薯200.0份， 葡萄糖20.0份， 酵母膏2.0份， MgSO47H2O 1.0 份， KH2 PO4 1.0 份， 水1000.0 份； M1固体培养基另加15.0份琼脂粉。 4.根据权利要求2所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中卢戈氏碘液法测定淀粉变色圈直径使用的菌种培养基为M1淀粉固体培养基， 按。
8、重量 份计， 所述M1淀粉固体培养基的成分组成为： 去皮马铃薯200.0份， 葡萄糖10.0份， 酵母膏2.0份， MgSO47H2O 1.0 份， KH2 PO4 1.0 份， 水1000.0 份， 可溶性淀粉2.0份， 琼脂粉15.0份； 刚果红法测定淀粉变色圈直径使用的菌种培养基为M1淀粉固体培养基另加2份刚果 红。 5.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法， 其特征在于， 菌株 在培养前先进行菌种活化， 所述菌种活化条件为将菌株在M1固体培养基上活化， 30避光 培养20天。 6.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法， 其特征在于， 步骤 （3）。
9、 中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶中丙烯酰胺质量体积浓度为5%， 分离胶中丙烯酰 权利要求书 1/2 页 2 CN 105648030 B 2 胺质量体积浓度为10%， SDS质量体积浓度为0.1%， 电泳电压为浓缩胶80V、 分离胶150V。 7.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶中丙烯酰胺质量体积浓度为5%， 分离胶中丙烯 酰胺质量体积浓度为8%， 电泳电压为浓缩胶80V， 分离胶150V。 8.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法， 其特征在于， 所述 步骤 （1） 中测量菌落半径。
10、的时间点分别在菌株培养的第3、 6、 9、 12、 15和18 天。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105648030 B 3 一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法 技术领域 0001 本发明属于农业技术领域， 具体涉及一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法。 背景技术 0002 暗褐网柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)属于牛肝菌目(Boletales)小牛肝菌 科(Boletinelaceae)网柄牛肝菌属(Phlebopus)， 是云南省西双版纳地区每年雨季市场上 常见的食用菌， 暗褐网柄牛肝菌也是目前唯一能实现菇房周年栽培的牛肝菌。 目前对于暗 褐网柄牛肝菌的栽培主。
11、要通过野生菌株或者菇房栽培菌株组织分离获得母种， 母种进一步 扩繁后进行栽培测产来选育优良菌株。 目前栽培模式下， 优良菌株在继代一定次数后就会 发生衰退， 只能通过不断地分离、 筛选优良菌株来保证生产的延续性。 为了防止勿用衰退菌 株造成不可挽回的经济损失， 在进入生产之前有效辨别菌株活力显得极其重要。 发明内容 0003 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法， 通 过本发明所述方法能够及时对暗褐网柄牛肝菌菌种活性作出预判， 进而有效防止栽培衰退 菌株造成的经济损失。 0004 本发明采取的技术方案如下： 0005 1、 暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，。
12、 包括如下步骤： 0006 (1)观察菌落形态、 测定生长速率： 菌株30避光培养， 分别于至少5个不同时间点 十字交叉法测量菌落半径， 计算平均菌落生长速率； 同时于菌丝体长满培养皿时观察菌落 形态特征； 与菌株第一代原种相比， 菌落吐水少， 菌核小， 平均菌落生长速率变化率10； 0007 所述平均菌落生长速率变化率(|菌株平均菌落生长速率第一代原种平均菌 落生长速率|)/第一代原种平均菌落生长速率100； 0008 所述平均菌落生长速率为： 以不同时间点为横坐标， 不同时间点对应的平均菌落 半径为纵坐标， 获取的直线斜率即为菌株平均菌落生长速率； 0009 (2)测定菌落淀粉酶分泌能力：。
13、 菌株培养15天后用刚果红法或卢戈氏碘液法获得 淀粉变色圈， 然后采用十字交叉法测定平均菌落直径和平均变色圈直径， 并与菌株第一代 原种对应结果数据进行比较， 采用刚果红法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度 10， 采用卢戈氏碘液法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度5； 0010 (3)可溶性蛋白分析： 菌株150rpm、 30避光振荡培养7天， 过滤， 滤渣清洗， 除水， 液氮研磨至粉碎， 取粉碎物用pH为7.2的磷酸盐缓冲液混匀， 12000rpm离心10min， 吸取上清 液即为可溶性蛋白样品， 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行可溶性蛋白分析， 与菌株第一 代原种相比， 相对分子量。
14、为40.0kDa的可溶性蛋白条带变弱， 而相对分子量为22.0kDa的可 溶性蛋白条带增强； 0011 (4)酯酶同工酶分析： 菌株150rpm、 30避光振荡培养7天， 过滤， 滤渣清洗， 除水， 液氮研磨至粉碎， 取粉碎物用pH为5.6的磷酸盐缓冲液混匀， 12000rpm离心10min， 吸取上清 说明书 1/6 页 4 CN 105648030 B 4 液即为酯酶同工酶样品， 使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酯酶同工酶分析， 与菌株第 一代原种相比， 相对分子量为37.0kDa的酯酶同工酶活性增强。 0012 优选的， 步骤(1)所用培养基为M1固体培养基， (3)和(4)中所用培养基。
15、为M1液体培 养基。 0013 优选的， 按重量份计， 所述M1液体培养基的成分组成为： 0014 去皮马铃薯200.0份， 葡萄糖20.0份， 酵母膏2.0份， MgSO47H2O 1.0份， KH2PO41.0 份， 水1000.0份； M1固体培养基在液体培养基的基础上加15.0份琼脂粉。 0015 优选的， 步骤(2)中卢戈氏碘液法测定淀粉变色圈直径使用的菌种培养基为M1淀 粉固体培养基， 按重量份计， 所述M1淀粉固体培养基的成分组成为： 0016 去皮马铃薯200.0份， 葡萄糖10.0份， 酵母膏2.0份， MgSO47H2O 1.0份， KH2PO41.0 份， 水1000.0。
16、份， 可溶性淀粉2.0份， 琼脂粉15.0份； 0017 刚果红法测定淀粉变色圈直径使用的菌种培养基在M1淀粉固体培养基基础上加2 份刚果红。 0018 优选的， 菌株在培养前先进行菌种活化， 所述菌种活化条件为将菌株在M1固体培 养基上活化， 30避光培养20天。 0019 优选的， 步骤(3)中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶中丙烯酰胺质量体积浓度 为5， 分离胶中丙烯酰胺质量体积浓度为10， SDS质量体积浓度为0.1， 电泳电压为浓 缩胶80V、 分离胶150V。 0020 优选的， 步骤(3)中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶中丙烯酰胺质量体积浓 度为5， 分离胶中丙烯酰胺质量体积浓度。
17、为8， 浓缩胶80V， 分离胶150V。 0021 优选的， 所述步骤(1)中测量菌落半径的时间点分别在菌株培养的第3、 6、 9、 12、 15 和18天。 0022 本发明的有益效果在于： 本发明通过分析不同继代次数下暗褐网柄牛肝菌菌落生 长速率， 菌落形态特征， 淀粉酶活性， 可溶性蛋白图谱， 酯酶同工酶图谱以及出菇测产各个 角度变化规律， 找到可以表征暗褐网柄牛肝菌菌种随继代次数增多发生衰退的生理生化特 征， 为菌种活力鉴定提供了有效的判定方法， 该方法为暗褐网柄牛肝菌的菌种衰退提供了 有效的判定依据， 大大降低了误用衰退菌株的风险， 有利于暗褐网柄牛肝菌栽培技术的推 广。 附图说明 。
18、0023 为了使本发明的目的、 技术方案和有益效果更加清楚， 本发明提供如下附图： 0024 图1菌株菌落形态图。 0025 图2可溶性蛋白电泳图谱， M:预染蛋白Marker， 相对分子量大小从上到下分别是 150， 100， 70， 50， 35,25,20kDa。 0026 图3酯酶同工酶电泳图谱， M:预染蛋白Marker， 相对分子量大小从上到下分别是 100， 70， 50， 35,25kDa； 其中， 11023、 13013上样蛋白含量为A,B,C的一半。 0027 以上附图为原始图片大小。 具体实施方式 说明书 2/6 页 5 CN 105648030 B 5 0028 下面。
19、对本发明的优选实施例进行详细的描述。 实施例中未注明具体条件的实验方 法， 通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。 0029 一、 材料与设备 0030 1.1供试菌株 0031 暗褐网柄牛肝菌11023菌株； 13013菌株； 11023菌株栽培子实体组织分离菌株 11023-1372次继代菌株(以下简称A)， 5次继代菌株(以下简称B)， 8次继代菌株(以下简称 C)。 0032 1.2试剂、 仪器设备与培养基 0033 1.2.1试剂 0034 葡萄糖， 酵母膏， 刚果红， 碘， 碘化钾， 乙酸-1-萘酯， 乙酸-2-萘酯， 固蓝RR盐， KH2PO4， MgSO47H2O均为分析。
20、纯， 均购自生工生物工程(上海)股份有限公司； 琼脂粉为日本 进口分装。 0035 1.2.2仪器设备 0036 BIC-250型人工气候箱， 上海博讯公司； DYCE-25E型P4垂直电泳仪， 北京六一公司； SK-100B恒温摇床， 上海苏坤公司。 0037 1.2.2培养基 0038 M1培养基： 去皮马铃薯200.0g(煮汁)， 葡萄糖20.0g， 酵母膏2.0g， MgSO47H2O 1.0g， KH2PO41.0g， 水1000.0ml， M1固体培养基另加15.0g琼脂粉(暗褐网柄牛肝菌母种培养 基的筛选， 西南农业学报,2009,P209-211； 暗褐网柄牛肝菌菌丝体培养基的。
21、碳源、 氮源及无机 盐的筛选研究， 云南农业大学学报,2009,P145-149； 暗褐网柄牛肝菌菌种的培养方法， CN101491195A)。 0039 M1淀粉固体培养基： 去皮马铃薯200 .0g(煮汁)， 葡萄糖10 .0g， 酵母膏2.0g， MgSO47H2O1.0g， KH2PO41.0g， 水1000ml， 琼脂粉15g， 可溶性淀粉2g。 0040 M1淀粉刚果红固体培养基： 去皮马铃薯200.0g(煮汁)， 葡萄糖10.0g， 酵母膏2.0g， MgSO47H2O 1.0g， KH2PO41.0g， 水1000.0ml， 琼脂粉15.0g， 可溶性淀粉2.0g， 刚果红2.。
22、0g。 0041 二、 菌落生长实验 0042 将测试菌株在M1固体培养基上活化， 30避光培养20天， 用直径为1cm的无菌打孔 器在生长旺盛的菌丝前缘打孔取菌饼， 接种于M1培养基中央， 30避光培养。 每个培养皿中 央只接种一个菌饼， 每种处理至少做5个平行处理。 分别于培养后第3、 6、 9、 12、 15和18天利 用十字交叉法测量菌落直径， 观察菌落形态特征(吐水情况， 菌核情况)。 利用Microsoft EXCEL中的SLOPE函数求出菌落生长速率(v)： v1/2*SLOPE(菌落平均直径集合， 测量时 间集合)， 其中菌落半径单位为mm， 测量时间单位为d， 则生长速率单位。
23、为mm/d。 例如， 第t1 天测量菌落直径为d1,第t2天测量菌落直径为d2,第t3天测量菌落直径为d3,第t4天测量菌 落直径为d4,， 则v1/2*SLOPE(d1,d2,d3,d4,， t1,t2,t3,t4,)。 具体以 某次测量结果为例： t13， t26， t39， t412， t515； d110.41,d216.62,d3 23.93,d432.21,d541.39； 则v1/2*SLOPE(10.41,16.62,23.93,32.21,41.39， 3， 6， 9， 12， 15)1/2*2.591.29(mm/d)。 5次及以上平行实验的菌落生长速率的算数平均值 标准差。
24、表示平均生长速率， 例如某菌株某次试验中， 5个平行实验菌落生长速率分别为： 2.31， 2.94， 2.81， 2.90， 3.15(mm/d),则该菌株该次实验平均生长速率2.820.28(mm/ 说明书 3/6 页 6 CN 105648030 B 6 d)。 0043 菌落形态相关结果见表1和图1。 0044 表1菌落生长实验结果 0045 0046 不同小写字母表示处理间的差异达到极显著水平(p0.01),吐水及菌核情况为 菌丝接近长满平板时观察结果。 0047 由表1和图1可知， 菌种随着继代次数的增多， 其菌落的吐水和菌核形成能力均减 弱。 栽培优良菌株11023、 13013平。
25、均菌落生长速率与其他3个菌株有极显著性差异。 菌株A、 B 菌落生长速率极显著差异于菌株C。 随着继代次数增多， 菌落生长速率变化率10。 如与 菌株第一代原种相比， 传代5次后的菌株B， 生长速率变化率为(1.83-1.60)/1.8312。 0048 三、 淀粉变色圈实验 0049 刚果红法： 按上述接种方法将菌饼接种于M1淀粉刚果红固体培养基中， 30避光 培养。 第15天用十字交叉法测量菌落直径和变色圈直径。 数据五个及以上平行试验的平均 值标准差表示。 0050 卢戈氏碘液法： 按上述接种方法将菌饼接种于M1淀粉固体培养基中， 30避光培 养。 第15天用十字交叉法测量菌落直径， 然。
26、后用卢戈氏碘液染色(5.0g碘和10.0g碘化钾溶 于85.0ml蒸馏水中， 碘的总浓度为150mg/ml)用喷壶喷洒于培养基表面， 测量未被染成蓝色 区域的直径。 数据以五个及以上平行试验的平均值标准差表示。 0051 相关实验结果见表2。 0052 表2淀粉变色圈实验结果 0053 0054 不同小写字母表示处理间的差异达到显著水平(p0.05)。 说明书 4/6 页 7 CN 105648030 B 7 0055 淀粉变色圈实验结果如表2所示， 结果表明暗褐网柄牛肝菌分泌了淀粉酶， 且随着 继代次数增加， 变色圈直径与菌落直径之比下降， 即相同面积的菌落分泌淀粉酶能力降低， 淀粉酶分泌能。
27、力发生了退化。 与第一代原种相比， 刚果红法测定变色圈直径/菌落直径的比 值降低幅度10， 卢戈氏碘液法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度5。 0056 四、 可溶性蛋白分析 0057 用直径为1cm无菌打孔器在生长旺盛的菌丝前缘打孔取菌饼四个， 接种于装有 200ml M1液体培养基的500ml三角瓶中， 150rpm， 30避光振荡培养7d， 无菌纱布过滤， 蒸馏 水清洗3遍， 用纱布挤去水分， 液氮研磨至粉碎， 立即称取100mg研磨物至pH为7.2的磷酸盐 缓冲液中振荡混匀， 12000rpm离心10min， 小心吸取上清液即为蛋白样品。 用改良型 Bradford法蛋白浓度测定试。
28、剂盒对蛋白样品进行定量， 通过浓缩或者稀释使得不同样品 (测试菌种以及该菌种对应的第一代原种)蛋白浓度保持一致。 0058 使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行可溶性蛋白分析： 浓缩胶浓度为 5， 分离胶浓度为10， SDS浓度为0.1， 测试样品以及该菌株对应第一代原种的蛋白样 品以相同体积相同蛋白质浓度在同一块胶上样， 上样量为20 l， 电泳电压为浓缩胶80V、 分 离胶150V； 溴酚蓝迁移至离下端边缘1cm左右停止电泳。 按常规方法进行考马斯亮蓝染色。 根据所得电泳图谱， 计算有差异蛋白条带的相对迁移率， 计算公式为相对迁移率(Rf)目 标蛋白条带迁移距离/溴酚蓝迁移距。
29、。 根据蛋白Marker的相对分子量以及各个条带的相对 迁移率， Excel数据拟合获得相对迁移率和蛋白质相对分子质量标准曲线。 获得标准曲线 为： M-44.540ln(Rf)+14.124,R20.998； lgM-0.871Rf+2.093， R20.993。 M相对分子 量， 单位kDa。 0059 实验结果见图2。 结果表明菌株C可溶性蛋白在相对迁移率Rf0.56， 相对分子量 为40.0kDa的蛋白条带相对于菌株A和B亮度降低， 菌株B,C可溶性蛋白在Rf0.84分子量为 22.0kDa， 条带相对于菌株A亮度增强。 0060 五、 酯酶同工酶分析 0061 用直径为1cm无菌打孔。
30、器在生长旺盛的菌丝前缘打孔取菌饼四个， 接种于装有 200ml M1液体培养基的500ml三角瓶中， 150rpm， 30避光振荡培养7d， 无菌纱布过滤， 蒸馏 水清洗3遍， 用纱布挤去水分， 液氮研磨至粉碎， 立即称取100mg研磨物至pH为5.6的磷酸盐 缓冲液中振荡混匀， 12000rpm离心10min， 小心吸取上清液即为样品。 使用非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳(Native-PAGE)， 浓缩胶浓度为5， 分离胶浓度为8， 测试样品以及该菌株对 应第一代原种的蛋白样品以相同体积相同蛋白质浓度在同一块胶上样， 上样量为20 l， 浓 缩胶80V， 分离胶150V， 溴酚蓝迁移至距端边缘。
31、1cm左右时停止电泳。 电泳结束前半小时进行 染色液、 固定液和保存液的配制(郭晓霞.蝴蝶酯酶同工酶的系统学研究(鳞翅目、 蝶亚目) D:陕西师范大学,2000)。 电泳结束后将胶取出， 去掉浓缩胶， 用蒸馏水清洗后， 放入染色 液， 37染色， 观察着色情况， 有清晰条带出现时停止染色。 取出凝胶， 蒸馏水漂洗干净后置 于固定液中过夜， 第二天拍照并放入保存液中保存。 0062 根据所得图谱， 计算相对迁移率(Rf)， 计算方法同可溶性蛋白分析的相对迁移率 计算方法。 根据蛋白Marker的相对分子量以及各个条带的相对迁移率， Excel数据拟合获得 相对迁移率和蛋白质相对分子质量标准曲线。。
32、 获得标准曲线为： M-69.164ln(Rf)+ 13.980， R20.998； lgM-1.044Rf+2.307， R20.999。 M为相对分子量， 单位kDa。 说明书 5/6 页 8 CN 105648030 B 8 0063 酯酶同工酶电泳结果如图3所示， 结果表明， 所测试菌种共出现4条的酯酶同工酶 条带， 其中Rf0.01， 0.40和0.55三个条带(对应相对分子量为： 332.0， 77.0， 55.0kDa)在所 有菌株中出现， 而Rf0.80(相对分子量为37.0kDa)这条同工酶调带只在A,B,C中出现， 并 且同工酶条带随继代次数增加颜色变深， 酶活性增强。 0。
33、064 六、 栽培出菇 0065 按照菌落生长实验中所述方法活化菌株， 每个菌株打取直径为1cm的菌饼四个， 接 种于300ml液体培养基进行种子培养基发酵， 培养7天后按照常规方法(Kai-Ping Ji， Yang Cao， Chun-Xia Zhang et al.Cultivation of Phlebopus Portentosus in Southern ChinaJ.Mycological Progress,2011,10(3):293-300)接栽培种进行出菇培养。 接种工 作由同一个操作娴熟工人完成， 每个菌株培养90袋。 统计污染情况， 统计出菇率， 单菇重。 0066 表。
34、3栽培出菇结果 0067 0068 不同小写字母表示处理间的差异达到显著水平(p0.05)； -表示未测试。 0069 栽培出菇结果如表3所示， 随着继代次数增加， 平均单菇重减少， 标准差增大。 随着 继代次数增加， 抗杂能力逐渐减弱， 污染率增加。 与优良菌株11023,13013相比， A,B,C单菇 重标准差偏大， 出菇不整齐， 菇型不一致， 抗杂能力弱。 0070 综合上述研究发现， 随着继代次数的增加， 暗褐网柄牛肝菌菌丝体在菌落形态特 征， 菌落生长速率， 胞外酶， 可溶性蛋白， 酯酶同工酶以及出菇性状上均出现不同程度的变 化。 淀粉酶是暗褐网柄牛肝菌人工栽培条件下基质利用相关的。
35、最主要的胞外酶， 因此监测 淀粉酶活性能较好地表征菌种活力。 可溶性蛋白以及酯酶同工酶图谱的变化是基因表达水 平的差异的一种直观体现。 暗褐网柄牛肝菌随着继代次数增加， 某些蛋白条带或者酯酶同 工酶条带有表达升高的趋势， 而有些表达量则降低。 蛋白质是基因表达的产物， 其种类和表 达量随着培养时间、 培养基种类、 培养条件、 取样部位的改变有所差异， 因此在进行测试中， 条件需要保持一致。 随着菌种继代次数的增加发生菌株退化， 最终的后果就是产量锐减， 出 菇个体之间变异增大， 出菇不整齐， 直接造成经济损失。 因此在菌种管理过程中， 定期监测 上述生理生化特性可以作为一项菌株退化评估的有效手段。 0071 最后说明的是， 以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述， 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说明书 6/6 页 9 CN 105648030 B 9 图1 图2 说明书附图 1/2 页 10 CN 105648030 B 10 图3 说明书附图 2/2 页 11 CN 105648030 B 11 。