技术领域
本发明涉及一种调控根系发育的苹果多肽激素基因MdCEP7及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
生长素在植物根系发育过程中发挥重要作用，生长素极性运输存在于植物的茎、根和叶中，其极性运输由定位于质膜上的生长素运输载体负责。生长素运输载体，包括生长素输入载体(AUX1)和生长素输出载体(PINs)，它们通过调节生长素的运输和分布影响植物生长发育的各个方面。生长素的合成过程由多种酶的参与，其中TAA1与YUC基因起到关键作用，生长素的合成与转运影响到植物根系发育过程。
近年来的研究结果表明植物体内的多肽分子在调控植物萌发、生长、分化、发育、信号转导等各个方面同样发挥着重要作用，因此也被称为多肽激素。包括CLAVATA3(CLV3)、CLV3/EMBRYO SURROUNDING REGIONRELATED(CLE)、TRACHEARY ELEMENT DIFFERENTIATION INHIBITORY FACTOR(TDIF)、PHYTOSULFOKINE(PSK)、PLANT PEPTIDE CONTAINING SULFATED TYROSINE1(PSY1)、C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1(CEP7)等。CEP基因编码一个小肽肽前体，由N-端分泌信号肽、可变域、一个或多个CEP结构域和一个短的C-末端延伸组成，CEPs参与了植物根发育过程，并且影响到株高、穗粒数表型；AtCEPs通过与下游激酶受体AtCEPR1结合，调控拟南芥根系发育；在苜蓿中，MtCEP7作用与下游肽受体MtCAR2，减少了侧根数目并促进根瘤形成。
苹果是世界上重要的水果作物，对果树生长素合成、转运以及根系发育调控的研究有助于调节植株形态结构和根系生长。在多年生木本植物中，多肽合成基因CEP的研究还未有报道。在本研究中，我们克隆了一个具有CEP结构的MdCEP7蛋白，在拟南芥中异位表达MdCEP7能够调控植株根系发育。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种调控根系发育的苹果多肽激素基因MdCEP7。本发明的申请人从苹果中分离并鉴定的一个新型的调控根系生长素合成、运输以及根系发育的多肽编码基因MdCEP7。实验发现MdCEP7超量表达拟南芥表现出主根长度与侧根数目受到抑制的表型；揭示该基因在调控生长素合成、转运与根系发育中发挥重要作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种调控根系发育的苹果多肽激素基因MdCEP7，所述MdCEP7的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
本发明的申请人从嘎啦苹果组培苗中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的拟南芥中AtCEPs的保守氨基酸序列，设计引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。将合适大小的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认，最后得到cDNA全长序列。
该基因开放阅读框(open reading frame,ORF)为366bp。由此推得，该基因编码121个氨基酸，基因序列号为MDP0000886459，位于第15号染色体，包括22个外显子和21个内含子。将其氨基酸序列在国际基因库中检索，发现与已公布的拟南芥相关基因AtCEP7有较高的同源性，所以本发明的申请人将该基因命名为MdCEP7。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述苹果多肽激素基因MdCEP7来自嘎啦苹果。
进一步，所述MdCEP7的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
本发明的目的之二，是提供一种调控根系发育的苹果多肽激素基因MdCEP7在调节植株根系发育中的应用。本发明的苹果多肽激素基因MdCEP7能够直接优化根系结构，主根变短能够抑制地上部茎干伸长，尤其是在果树中，可应用于乔化砧木的遗传改良。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种调控根系发育的苹果多肽激素基因MdCEP7在调节植株根系发育中的应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述应用为降低主根长度并抑制侧根数目。
采用上述进一步的有益效果是：抑制根系的发育，能够减少光合能耗，进一步将光合产物应用到碳物质积累中。同时，通过优化根系，能够调节地上部形态，尤其是在果树中，可应用于乔化砧木的遗传改良。
由实验结果可知，苹果MdCEP7基因影响生长素合成和运输，并抑制了主根和侧根的发育。
本发明的目的之三，是提供一种核酸构建体。本发明利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdCEP7基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因植株。MdCEP7超量表达拟南芥表现出主根长度受到抑制，侧根数目减少的表型，说明MdCEP7基因在植株生长素合成、运输和根系发育中发挥重要作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种核酸构建体，包含处于强启动子控制下的如上所述苹果多肽激素编码基因MdCEP7。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述强启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子。
本发明的有益效果是：
1.本发明的申请人首次从苹果中分离并鉴定的一个新型的调控根系生长素合成、运输以及根系发育的多肽编码基因MdCEP7。实验发现MdCEP7超量表达拟南芥表现出主根长度与侧根数目受到抑制的表型；揭示该基因在调控生长素合成、转运与根系发育中发挥重要作用。
2.本发明的苹果多肽激素基因MdCEP7能够直接优化根系结构，主根变短能够抑制地上部茎干伸长，尤其是在果树中，可应用于乔化砧木的遗传改良。
3.本发明利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdCEP7基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因植株。MdCEP7超量表达拟南芥表现出主根长度受到抑制，侧根数目减少的表型，说明MdCEP7基因在植株生长素合成、运输和根系发育中发挥重要作用。
附图说明
图1为载体的构建及转基因拟南芥的获得。其中，A为苹果MdCEP7基因PCR扩增产物电泳MdCEP7:MdCEP7基因扩增产物，Mark:分子量标记DM2000；B为RT-PCR分析MdCEP7基因在转基因拟南芥L1、L2、L3株系中的表达水平。
图2为MdCEP7对植株生长素合成、运输相关基因表达的影响，如图2所示，AtTAA1、AtYUC1/2/3为生长素合成相关基因，AtAUX1、AtPIN1/2/3为生长素转运相关基因在MdCEP7转基因拟南芥中表达)。
图3为MdCEP7调节根系发育。如图3,所示，生长10天的野生型拟南芥(Col-0)和转基因拟南芥(L1、L2、L3)根系系统观察。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1嘎啦苹果MdCEP7基因的克隆
1.嘎啦苹果组培叶片RNA提取
通过CTAB法提取嘎啦苹果组培叶片的总RNA，包括以下步骤：
1)取1.5g经200mM NaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50mL离心管中；
2)迅速加入10mL预热到65℃的提取缓冲液(CTAB 20％w/v、Tris-HCl0.1mol/l、EDTA 25mol/l、NaCl 2mol/l、巯基乙醇2％w/v、PVP 2％w/v、无RNA酶的双蒸水定容，其中PVP和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65℃水浴中0.5小时；
3)加入与上步离心管液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡0.5小时，4℃、12,000rpm离心20分钟；将上清液转移到新的50mL离心管中；
4)加入1/3上清液体积的10mol/L预冷LiCl，-20℃放置3小时，12,000rpm离心30分钟，弃上清液；
5)加入500μL SSTE缓冲液(NaCl 1mol/l、SDS 0.5％w/v、EDTA 10mol/l、无RNA酶的双蒸水定容)充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5mL离心管中；
6)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5mL离心管；
7)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5mL离心管；
8)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2小时；
9)于4℃、12,000rpm离心20分钟，70％乙醇洗2次；
10)于4℃、14,000rpm离心10分钟，超净台上风干沉淀；加入20μL DEPC水溶解RNA；
11)置-80℃储藏备用，或立即进行以下反转录实验。
2.将总RNA反转录得到cDNA
总RNA的反转录使用市售的反转录试剂盒，获得反转录cDNA。
3.MdCEP7全长DNA序列的扩增
设计引物(MdCEP7-F/MdCEP7-R)，以上述反转录cDNA为模板进行PCR扩增。
MdCEP7-F：5’-GATTGCGATTCAGCTCAAT-3’(SEQ.ID.NO.3)；
MdCEP7-R：5’-GTGCTCAAAGATGTGATGTCCT-3’(SEQ.ID.NO.4)。
PCR扩增体系：纯化的cDNA产物25μL、5×TdT缓冲液10μL、0.1％BSA5μL、10mM dCTP 2.5μL、TdT 15U、双蒸水定容至50μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，进行32个循环；72℃充分延伸10分钟。
PCR反应结束后，回收PCR产物并将其连接到pMD-18T载体上，获得pMD18-T-MdCEP7质粒。测序(北京六合华大基因科技股份有限公司)结果显示，MdCEP7基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。测序正确的单克隆，碱法提取pMD18-T-MdCEP7的质粒DNA，-20℃保存，用于后续功能验证实验(图1-A)。
实施例2MdCEP7基因载体的构建
为进一步研究MdCEP7基因的功能，将包含有MdCEP7基因编码区在内的共1863bp片段正确插入表达载体pRI上。
1.利用DNAMAN软件，分析MdCEP7基因的酶切位点，将实施例1保存的pMD18-T-MdCEP7的质粒DNA进行酶切反应，并连接到pRI载体上，构建正确的重组子pRI-MdCEP7。
2.用构建好的重组子pRI-MdCEP7转化农杆菌LB4404感受态细胞。进行PCR鉴定，挑取阳性菌落进行测序。测序正确的重组子pRI-MdCEP7单克隆用于后面拟南芥的转化。
实施例3获得转基因拟南芥
将获得的拟南芥种子，分别用70％酒精消毒3min，4％次氯酸钠消毒8-10min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，吸干水。播种于种子萌发培养基上(直接铺于表面)，光培养(25-28℃，16h长日照/8h短日照，10d)，至小苗长出。移栽到基质培养到开花。
挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基(含50mg/L潮霉素)中，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为0.6-0.8(约48h)；取其中1mL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为0.6-0.8(约5h)。离心收集菌体，用侵染液(含0.05g/mL蔗糖、0.03-0.05％Silweet)悬浮稀释20倍，备用。
将拟南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果荚，50mg/L卡那霉素抗性筛选后，PCR检测得到阳性转基因植株，经过连续3代筛选得到T3代纯合体，收取种子，进行表型分析。
利用筛选培养基(含50mg/L卡那霉素)筛选抗卡那霉素阳性的候选转基因株系，共获得3个35S:MdCEP7阳性株系(L1、L2、L3)；为进一步鉴定转基因株系，在进行继代培养时，每株系各取0.1g左右的组培苗，提取相应的RNA，反转录并进行半定量PCR检测，以确定这些株系中MdCEP7的表达水平。结果显示，MdCEP7基因在L1、L2及L3中过量表达(图1-B)。
实施例4MdCEP7调控生长素合成、运输相关基因表达
定量PCR检测野生型与转基因拟南芥中生长素合成基因(AtAUX1,AtPIN1,AtPIN2,AtPIN3,AtYUC1，AtYUC2，AtYUC6，AtTAA1)表达量。结果显示，拟南芥与转基因拟南芥中生长素合成和转运相关基因均有显著差异，暗示MdCEP7基因调控生长素的合成和转运(图2)。
实例6MdCEP7调控根系发育
为进一步确定转基因植株的功能，将拟南芥播种在竖直的MS培养基上，观察拟南芥根系发育表型。
(1)种子处理。将获得的拟南芥种子(Col-0，L1，L2，L3)，分别用70％酒精消毒3min，4％次氯酸钠消毒8-10min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，吸干水。播种于种子萌发培养基上。4℃层积处理4天后至光下培养(21-24℃，16h长日照/8h短日照)。
(2)选择萌发后4天左右、根系发育一致的野生型拟南芥(Col-0)和转基因拟南芥(L1、L2、L3)，转移到MS培养基上竖直培养(21-24℃，16h长日照/8h短日照)。继续培养6天后，观察拟南芥根系表型并拍照。
结果发现，与野生型拟南芥相比，超量表达MdCEP7的转基因拟南芥主根长度和侧根数目明显受到抑制(图3)。
综上所述，MdCEP7基因不仅影响生长素合成、转运，对根系发育也有显著影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉山东农业大学
〈120〉一种调控根系发育的苹果多肽激素基因MdCEP7及其应用
〈160〉2
〈170〉PatentIn version 3.5
〈210〉1
〈211〉366
〈212〉DNA
〈213〉苹果
〈400〉1
ATGGCCTTGA ACAAGTTAAC CCTTATTGCT TGCTCATTCC TAGTTTCCCT ACTCATCTCA
ACCTGGGAAA TTCAGTCCAT TGATGCAAGG CCTTTGAAAT CAAGGAGTAA AAATGAACTC
CAAAACCTCC CAATTCACAC CAAAACCCAC AAAAACAAAT CGGAGGATAA TGCAGGTCAC
AAAAGGGACT TGCATGGTAA GAGCACAACT GAAGCGTCAT CAGTTGTTGT ATCTCCACCC
CCACCACAAA GTGATCAGGT TGATGGTGCA GCACAGCTGC CGCCACCACC AGCGCATGCC
GTAGATGACT TCAGGCCCAC AGCTCCAGGT CACAGCCCCG GCGTTGGACA TTCTCTACAG
AACTAG 366
〈210〉2
〈211〉121
〈212〉PRT
〈213〉苹果
〈400〉1
MALNKLTLIACSFLVSLLISTWEIQSIDARPLKSRSKNELQNLPIHTKTHKNKSEDNAGHKRDLH
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