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1、(10)授权公告号 CN 101962349 B (45)授权公告日 2012.08.22 CN 101962349 B *CN101962349B* (21)申请号 201010283537.5 (22)申请日 2010.09.15 C07C 271/22(2006.01) C07C 269/04(2006.01) C07K 5/103(2006.01) A61K 31/27(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 37/06(2006.01) A61P 33/02(2006.01) A。
2、61P 37/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 北京欧凯纳斯科技有限公司 地址 100094 北京市海淀区北清路 103 号 (72)发明人 许峰 高源 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王加岭 张庆敏 CN 101448512 A,2009.06.03, 全文 . WO 2010039668 A2,2010.04.08,说明书附图 9. WO 2008040934 A1,2008.04.10, 全文 . ACS.RN778605-99-5. STN-Registry .2004,1. ACS.RN7731。
3、26-10-6. STN-Registry .2004,1. (54) 发明名称 3-Boc 胺基 -3-（3- 硝基 -4- 氟苯基） 丙酸及 其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及下述式 (I) 化合物及其制备方 法， 所述方法包括下述步骤 ： 1) 使 4- 氟苯甲醛在 浓硫酸和浓硝酸作用下反应生成 3- 硝基 -4- 氟 苯甲醛 ； 2) 将 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛、 丙二酸和 乙酸铵在醇类溶剂中回流 6-8 小时得到 3- 氨 基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 ； 3) 将 3- 氨 基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸、 质量百分比浓 度为 8-1。
4、2的碳酸钠溶液和二氧六环混合， 形成 悬浮液后向其中加入 Boc2O 和二氧六环的溶液， 反应生成 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 ； 本发明的 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟 苯基 ) 丙酸与其它的氨基酸合成得到的一系列 多肽化合物对组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 具有一定 的抑制活性， 制备方法简单， 原料易得， 收率高 ； (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 楼兴隆 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 下述式 (I。
5、) 化合物 ： 2. 制备权利要求 1 所述的化合物的方法， 包括下述步骤 ： 1) 使 4- 氟苯甲醛在浓硫酸 和浓硝酸作用下反应生成 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 ； 2) 将 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛、 丙二酸和乙 酸铵在醇类溶剂中回流 6-8 小时得到 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 ； 3) 将 3- 氨 基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸、 质量百分比浓度为 8-12的碳酸钠溶液和二氧六环混 合， 形成悬浮液后向其中加入 Boc2O 和二氧六环的溶液， 反应生成 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝 基 -4- 氟苯基 ) 丙酸。 3. 根。
6、据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 1) 中所加浓硫酸的量为 2-4 毫 升 / 克 4- 氟苯甲醛， 所加浓硝酸的量为 0.4-0.6 毫升 / 克 4- 氟苯甲醛。 4. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 2) 中所述 3- 硝基 -4- 氟苯甲 醛、 丙二酸和乙酸铵的摩尔比为 1 1 2。 5.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤2)中所述醇类溶剂为甲醇、 乙醇 或异丙醇。 6. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 3) 中， 将 c 摩尔 3- 氨 基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸、 (2-2.5。
7、)c 升 8-12的碳酸钠溶液和 (1.0-1.2)c 升的二 氧六环混合， 剧烈搅拌形成悬浮液 ； 将此悬浮液冷却至 0-5， 缓慢滴加 (1.05-1.10)c 摩尔 Boc2O 和 (1.5-2.0)c 升二氧六环的溶液 ； 滴加完毕后， 反应体系在 0-5下搅拌 1-2 小时后 逐渐升至室温， 室温下搅拌 12-24 小时。 7. 权利要求 1 所述化合物作为中间体制备得到的多肽化合物， 其特征在于， 所述多肽 化合物为 N 端到 C 端的序列为亮氨酸 - 苏氨酸 - 色氨酸 -3- 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸。 8. 权利要求 7 所述的多肽化合物在用于制备治。
8、疗或预防糖尿病、 糖尿病并发症、 炎性 疾病、 原虫感染、 自身免疫性疾病或肿瘤的药物中的应用。 9. 权利要求 7 的多肽化合物在用于制备治疗或预防急性早幼粒细胞白血病或器官移 植排斥的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101962349 B 2 1/6 页 3 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及有机合成领域， 特别是， 涉及一种3-Boc胺基-3-(3-硝基-4-氟苯基) 丙酸及其制备方法。 背景技术 0002 非天然氨基酸是非蛋白基因编码的氨基酸， 在基因组学、 蛋白质组学等前沿生物 技术研究中有重要的应用。。
9、例如， - 非天然氨基酸在蛋白质、 核苷和核酸的研究中得到了 广泛应用 ： 它们能限制多肽构象的灵活性、 提供具有稳定二级结构的脱氧核糖核酸或核糖 核酸分子、 增强多肽对酶的稳定性以及提高药代动力学和生物活性 ； - 非天然氨基酸是 - 内酰胺的前体和很多潜在酶抑制剂的关键成分， 具有相当有趣的药理活性。- 非天然 氨基酸在组合化合物库的构建和药物研究中已经成为越来越重要的合成模块。此外， 将非 天然氨基酸掺入蛋白序列是合成生物学设计新蛋白的一个策略。 这种策略对研究天然蛋白 质的折叠和功能有重要作用。现在已有大约超过 30 种非天然氨基酸被人工插入到生物体 合成的天然蛋白质中。 0003 同。
10、时， 非天然氨基酸在以重组蛋白质为主的基因工程药物， 如重组细胞因子、 蛋白 质激素、 重组血浆蛋白、 重组溶血栓药物、 可溶性受体、 治疗性抗体、 重组药用动植物蛋白等 以及预防或治疗用疫苗、 核酸药物、 小分子多肽药物等生物药物和疫苗方面有重要的应用。 非天然氨基酸自身可以是重要的药物， 它们也是很多市售药物的重要结构单元。 目前， 世界 上最著名的医药公司， 都在研究含有非天然氨基酸骨架的多肽类药物， 这些药物多用于抗 菌、 消炎、 抗惊厥、 抑制细胞生长和抗肿瘤等方面。很多药物已经进入临床研究阶段。对于 制药公司而言， 在新药的研发过程中， 已经没有人敢忽视非天然氨基酸的作用。 发明内。
11、容 0004 本发明的目的是提供 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸及其制备方法。 0005 本发明提供下述式 (I) 化合物 ： 0006 0007 本发明的式 (I) 化合物 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸的合成路线如 下式所示 ： 0008 说 明 书 CN 101962349 B 3 2/6 页 4 0009 其中， 1) 为浓硫酸， 浓硝酸 ； 2) 为丙二酸， 乙酸铵 ； 3) 为 Boc2O， 碳酸钠。 0010 本发明进一步提供制备上述化合物的方法， 包括下述步骤 ： 1) 使 4- 氟苯甲醛在 浓硫酸和浓硝酸作用下反。
12、应生成 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 ； 2) 将 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛、 丙二 酸和乙酸铵在醇类溶剂中回流 6-8 小时得到 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 ； 3) 将 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸、 质量百分比浓度为 8-12的碳酸钠溶液和二氧六 环混合， 形成悬浮液后向其中加入Boc2O和二氧六环的溶液， 反应生成3-Boc胺基-3-(3-硝 基 -4- 氟苯基 ) 丙酸。 0011 其中， 步骤 1) 中所加浓硫酸的量为 2-4 毫升 / 克 4- 氟苯甲醛， 所加浓硝酸的量为 0.4-0.6 毫升 / 克 4- 氟苯甲醛。
13、。 0012 步骤 2) 中所述 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛、 丙二酸和乙酸铵的摩尔比为 1 1 2。 0013 步骤 2) 中所述醇类溶剂为甲醇、 乙醇或异丙醇。 0014 步骤 3) 中， 将 c 摩尔 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸、 (2-2.5)c 升 8-12 的碳酸钠溶液和 (1.0-1.2)c 升的二氧六环混合， 剧烈搅拌形成悬浮液 ； 将此悬浮液冷却至 0-5， 缓慢滴加 (1.05-1.10)c 摩尔 Boc2O 和 (1.5-2.0)c 升二氧六环的溶液 ； 滴加完毕后， 反应体系在 0-5下搅拌 1-2 小时后逐渐升至室温， 室温下搅拌 12。
14、-24 小时。 0015 本发明还提供包含上述式 (I) 化合物的药剂。 0016 本发明还提供式 (I) 化合物在用于制备治疗或预防糖尿病、 糖尿病并发症、 急性 早幼粒细胞白血病 (APL)、 炎性疾病、 器官移植排斥、 原虫感染、 自身免疫性疾病或肿瘤的药 物中的应用。 0017 具体而言， 本发明提供制备 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸的方法， 包 括下述步骤 ： 0018 将 a 摩尔 4- 氟苯甲醛 ( 化合物 4) 于 -5至 0下缓慢滴加至浓硫酸 (2-4 毫升 / 克 4- 氟苯甲醛 ) 和浓硝酸 (0.4-0.6 毫升 / 克 4- 氟苯甲醛。
15、 ) 的混合溶液中。滴加速度为 2-4 滴 4- 氟苯甲醛 / 秒。滴加完毕后， 将反应体系逐渐升至室温。室温反应 1-3 小时后， 将 反应体系倒入冰块中 (20-25 克冰 / 克 4- 氟苯甲醛 )， 生成大量固体。待冰块完全融化成 水后， 抽滤反应体系得到固体产物。水相用低极性有机溶剂萃取 2-4 次， 抽滤得到的固体产 物用同样的低极性有机溶剂溶解。合并所有的有机相， 先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至 pH 值 为 7-8， 再用饱和食盐水洗涤， 然后用干燥剂干燥。过滤后， 浓缩除去有机溶剂， 得到 b 摩尔 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 ( 化合物 3)。 0019 所述的低极性有机溶剂。
16、为乙酸乙酯、 二氯甲烷、 甲基叔丁基醚或二氧六环。 萃取水 相的低极性有机溶剂的用量为 0.3-0.5 毫升 / 毫升水相。溶解抽滤得到的固体产物的低极 性有机溶剂的用量为 5-10 毫升 / 固体产物。 0020 所述的饱和食盐水的用量为 0.2-0.4 毫升 / 毫升有机相。 0021 所述的干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁 ； 用量为 0.5-1 克 /50 毫升有机相。 0022 将 b 摩尔 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛、 b 摩尔丙二酸和 2b 摩尔乙酸铵在醇类溶剂中回 流 6-8 小时。冷却以后， 将反应体系过滤， 得到 c 摩尔 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 )。
17、 丙 酸 ( 化合物 2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。 0023 所述的醇类溶剂为甲醇、 乙醇或异丙醇。 0024 将 c 摩尔 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸、 (2-2.5)c 升 8-12的碳酸钠溶 说 明 书 CN 101962349 B 4 3/6 页 5 液和(1.0-1.2)c升的二氧六环混合， 剧烈搅拌形成悬浮液。 将此悬浮液冷却至0-5， 缓慢 滴加(1.05-1.10)c摩尔Boc2O和(1.5-2.0)c升二氧六环的溶液。 滴加完毕后， 反应体系在 0-5下搅拌 1-2 小时后逐渐升至室温， 室温下搅拌 12-24 小时。将反应体系倒入。
18、 (20-30) c 升的冰水中。用 (8-12)c 升的有机溶剂萃取两次。水相用 (2.0-2.5)N 的稀盐酸调节 pH 值至 1-2。大量固体沉淀出。过滤， 将固体真空干燥， 得到 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯 基 ) 丙酸 ( 化合物 1)。 0025 所述的有机溶剂为乙酸乙酯、 二氯甲烷、 甲基叔丁基醚或二氧六环。 0026 氟化学研究表明 ： 在分子中引入氟元素后， 分子的生物活性将发生显著的改变。 因 此， 氟元素的引入将有可能导致新药的诞生。 在很多药物分子中， 硝基是非常重要的活性基 团。基于上述认识， 本发明人设计并合成了一种含氟元素和硝基的 - 非天。
19、然氨基酸。初 步的实验研究表明， 用此非天然氨基酸合成的多肽化合物具有较好的生理活性。 0027 本发明具有如下有益效果 ： 0028 1) 本发明提供的 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸与其它的氨基酸合成 得到的一系列多肽化合物对组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 具有一定的抑制活性， 可能成为治疗 或预防糖尿病、 糖尿病并发症、 急性早幼粒细胞白血病 (APL)、 炎性疾病、 器官移植排斥、 原 虫感染、 自身免疫性疾病或肿瘤等的药用组合物。 0029 2)本发明提供的3-Boc胺基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸的合成方法， 能够从简 单易得的原料出发， 以 4。
20、6-52的三步反应总收率得到目标产物。 具体实施方式 0030 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0031 实施例 1 0032 将 18 克 4- 氟苯甲醛 (15.6 毫升， 0.145 摩尔， 1 当量， 化合物 4) 于 -5至 0下 缓慢滴加至 72 毫升浓硫酸 ( 市售浓硫酸， 浓度为 98 ) 和 10.8 毫升浓硝酸 ( 市售浓硝酸， 浓度为 68 ) 的混合溶液中。滴加速度为 2 滴 4- 氟苯甲醛 / 秒。滴加完毕后， 将反应体系 逐渐升至室温。室温反应 1 小时后， 将反应体系倒入 450 克冰块中， 生成大量固体。待冰块 完全融化成水后， 抽滤反应。
21、体系得到固体产物。水相用 250 毫升二氯甲烷萃取 2 次， 抽滤得 到的固体产物用 100 毫升二氯甲烷溶解。合并所有的有机相， 先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤 至 pH 值为 7-8， 再用 140 毫升饱和食盐水洗涤， 然后用 7 克无水硫酸钠干燥。过滤后， 浓缩 除去二氯甲烷， 得到 14.5 克 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 (0.087 摩尔， 产率 60 )。 0033 核磁共振氢谱 (1H NMR， 300MHz， CDCl3)10.04(s， 1H)， 8.60(dd， J 7.0， 2.0Hz， 1H)， 8.20(oct， J 2.0Hz， 1H)， 7.50(t， J 9.0。
22、Hz， 1H)。 0034 质谱 (EI) ： 170(M+1， 7.2)， 169(M， 25)， 123(100)。 0035 将 14.5 克 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 (0.087 摩尔， 1 当量， 化合物 3)、 9.0 克丙二酸 (0.087 摩尔， 1 当量 ) 和 13.4 克乙酸铵 (0.174 摩尔， 2 当量 ) 在乙醇中回流 6 小时。冷却 以后， 将反应体系过滤， 得到 17.5 克 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 (0.076 摩尔， 产率 88， 化合物 2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。 0036 将17.5克3-氨基-3。
23、-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸(0.076摩尔， 1当量， 化合物2)、 190 毫升 12的碳酸钠溶液和 90 毫升的二氧六环混合， 剧烈搅拌形成悬浮液。将此悬浮液 说 明 书 CN 101962349 B 5 4/6 页 6 冷却至0-5， 缓慢滴加17.5克Boc2O(0.08摩尔， 1.05当量)和152毫升二氧六环的溶液。 滴加完毕后， 反应体系在0-5下搅拌1小时后逐渐升至室温， 室温下搅拌12小时。 将反应 体系倒入 2280 毫升的冰水中。用 912 毫升乙酸乙酯萃取两次。水相用 2.5N 的稀盐酸调节 pH 值至 1-2。大量固体沉淀出。过滤， 将固体真空干燥， 得到 24.。
24、5 克 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝 基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 ( 产率 98， 化合物 1)。 0037 核磁共振氢谱 (1H NMR， 300MHz， DMSO)12.20(s， 1H)， 8.16(s， 1H)， 7.66(d， J 7.5Hz， 1H)， 7.45(d， J 7.5Hz， 1H)， 4.90(m， 1H)， 2.87(dd， J 6.6， 1.8Hz， 1H)， 2.62(dd， J 6.6， 1.8Hz， 1H)， 1.38(s， 9H)。 0038 质谱 (ESI) ： 329(M+H+， 100)， 351(M+Na+， 23.5)， 367(M+K+，。
25、 7.2)。 0039 实施例 2 0040 将 62 克 4- 氟苯甲醛 (53.7 毫升， 0.5 摩尔， 1 当量， 化合物 4) 于 -5至 0下缓 慢滴加至 186 毫升浓硫酸和 18.6 毫升浓硝酸的混合溶液中。滴加速度为 3 滴 4- 氟苯甲醛 / 秒。滴加完毕后， 将反应体系逐渐升至室温。室温反应 2 小时后， 将反应体系倒入 1395 克 冰块中， 生成大量固体。待冰块完全融化成水后， 抽滤反应体系得到固体产物。水相用 480 毫升乙酸乙酯萃取 3 次， 抽滤得到的固体产物用 300 毫升乙酸乙酯溶解。合并所有的有机 相， 先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至pH值为7-8， 再用35。
26、0毫升饱和食盐水洗涤， 然后用35克 无水硫酸镁干燥。过滤后， 浓缩除去乙酸乙酯， 得到 55.0 克 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 (0.325 摩尔， 产率 65 )。 0041 核磁共振氢谱 (1H NMR， 300MHz， CDCl3)10.02(s， 1H)， 8.63(dd， J 7.0， 2.0Hz， 1H)， 8.22(oct， J 2.0Hz， 1H)， 7.53(t， J 9.0Hz， 1H)。 0042 质谱 (EI) ： 170(M+1， 6.8)， 169(M， 27)， 123(100)。 0043 将 55 克 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 (0.325 摩尔， 。
27、1 当量， 化合物 3)、 33.8 克丙二酸 (0.325 摩尔， 1 当量 ) 和 50 克乙酸铵 (0.65 摩尔， 2 当量 ) 在甲醇中回流 8 小时。冷却以 后， 将反应体系过滤， 得到 54.9 克 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 (0.24 摩尔， 产率 74， 化合物 2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。 0044 将 54.9 克 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 (0.24 摩尔， 1 当量， 化合物 2)、 480毫升10的碳酸钠溶液和240毫升的二氧六环混合， 剧烈搅拌形成悬浮液。 将此悬浮液 冷却至 0-5， 。
28、缓慢滴加 56.8 克 Boc2O(0.26 摩尔， 1.1 当量 ) 和 360 毫升二氧六环的溶液。 滴加完毕后， 反应体系在0-5下搅拌2小时后逐渐升至室温， 室温下搅拌24小时。 将反应 体系倒入4800毫升的冰水中。 用1920毫升二氯甲烷萃取两次。 水相用2.5N的稀盐酸调节 pH 值至 1-2。大量固体沉淀出。过滤， 将固体真空干燥， 得到 75.6 克 3-Boc 胺基 -3-(3- 硝 基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 ( 产率 96， 化合物 1)。 0045 核 磁 共 振 氢 谱 (1H NMR， 300MHz， DMSO)(1H NMR， 300MHz， DMSO)12.。
29、18(s， 1H)， 8.13(s， 1H)， 7.64(d， J 7.5Hz， 1H)， 7.43(d， J 7.5Hz， 1H)， 4.87(m， 1H)， 2.85(dd， J 6.6， 1.8Hz， 1H)， 2.60(dd， J 6.6， 1.8Hz， 1H)， 1.36(s， 9H)。 0046 质谱 (ESI) ： 329(M+H+， 100)， 351(M+Na+， 28.5)， 367(M+K+， 6.5)。 0047 实施例 3 0048 将 93 克 4- 氟苯甲醛 (80.6 毫升， 0.75 摩尔， 1 当量， 化合物 4) 于 -5至 0下缓 慢滴加至 186 毫升。
30、浓硫酸和 18.6 毫升浓硝酸的混合溶液中。滴加速度为 4 滴 4- 氟苯甲醛 说 明 书 CN 101962349 B 6 5/6 页 7 / 秒。滴加完毕后， 将反应体系逐渐升至室温。室温反应 2 小时后， 将反应体系倒入 1860 克 冰块中， 生成大量固体。待冰块完全融化成水后， 抽滤反应体系得到固体产物。水相用 826 毫升甲基叔丁基醚萃取 2 次， 抽滤得到的固体产物用 400 毫升甲基叔丁基醚溶解。合并所 有的有机相， 先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至 pH 值为 7-8， 再用 615 毫升饱和食盐水洗涤， 然 后用 41 克无水硫酸镁干燥。过滤后， 浓缩除去甲基叔丁基醚， 得到 8。
31、3.7 克 3- 硝基 -4- 氟 苯甲醛 (0.495 摩尔， 产率 66 )。 0049 核磁共振氢谱 (1H NMR， 300MHz， CDCl3)10.06(s， 1H)， 8.66(dd， J 7.0， 2.0Hz， 1H)， 8.25(oct， J 2.0Hz， 1H)， 7.55(t， J 9.0Hz， 1H)。 0050 质谱 (EI) ： 170(M+1， 7.5)， 169(M， 22.5)， 123(100)。 0051 将 83.7 克 3- 硝基 -4- 氟苯甲醛 (0.495 摩尔， 1 当量， 化合物 3)、 51.5 克丙二酸 (0.495 摩尔， 1 当量 )。
32、 和 76.2 克乙酸铵 (0.99 摩尔， 2 当量 ) 在异丙醇中回流 8 小时。冷却 以后， 将反应体系过滤， 得到 90.4 克 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 (0.396 摩尔， 产率 80， 化合物 2)。产物不经纯化可以直接用于下一步反应。 0052 将 90.4 克 3- 氨基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 (0.396 摩尔， 1 当量， 化合物 2)、 790 毫升 8的碳酸钠溶液和 396 毫升的二氧六环混合， 剧烈搅拌形成悬浮液。将此悬 浮液冷却至 0-5， 缓慢滴加 91.7 克 Boc2O(0.42 摩尔， 1.05 当量。
33、 ) 和 594 毫升二氧六环的 溶液。滴加完毕后， 反应体系在 0-5下搅拌 2 小时后逐渐升至室温， 室温下搅拌 24 小时。 将反应体系倒入 7920 毫升的冰水中。用 3170 毫升二氧六环萃取两次。水相用 2.5N 的稀 盐酸调节 pH 值至 1-2。大量固体沉淀出。过滤， 将固体真空干燥， 得到 127.4 克 3-Boc 胺 基 -3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 ( 产率 98， 化合物 1)。 0053 核磁共振氢谱 (1H NMR， 300MHz， DMSO)12.22(s， 1H)， 8.18(s， 1H)， 7.68(d， J 7.5Hz， 1H)， 7.46。
34、(d， J 7.5Hz， 1H)， 4.90(m， 1H)， 2.89(dd， J 6.6， 1.8Hz， 1H)， 2.65(dd， J 6.6， 1.8Hz， 1H)， 1.40(s， 9H)。 0054 质谱 (ESI) ： 329(M+H+， 100)， 351(M+Na+， 31.5)， 367(M+K+， 10.3)。 0055 实验例 0056 将本发明得到的3-Boc胺基-3-(3-硝基-4-氟苯基)丙酸与亮氨酸(Leucine)、 苏 氨酸 (Threonine) 和色氨酸 (Tryptophan) 反应制备得到多肽化合物 ： 亮氨酸 - 苏氨酸 - 色 氨酸 -3- 胺基 。
35、-3-(3- 硝基 -4- 氟苯基 ) 丙酸 (N 端到 C 端 )。测定该多肽化合物对组蛋白 脱乙酰酶 (HDAC) 的抑制活性。 0057 组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 的抑制作用的活体外测定法 ： 0058 使用 Biomol(cat.No ： AK-500-0001) 的 HDAC FluorescentActivity Assay/Drug Discovery Kit。所述 HDAC 荧光活性测定法基于 Fluor de Lys( 荧光组蛋白脱乙酰基酶 Lvsyl) 基质和展开剂的联用。所述 Fluor de Lys 基质含有乙酰化的赖氨酸侧链。基质的 脱乙酰作用使得基质具有感光性，。
36、 从而在第二步骤中用Fluor de Lys显像剂进行的处理可 以产生荧光基团。 0059 HeLa 核提取物 (Biomol 供应 ) 在 60 微克 / 毫升与 75 微摩尔基质下进行培养。将 Fluor de Lys 基质加入到 pH 值为 7.4 的含有 25mMTris、 137mM NaCl、 1mM MgCl26H2O 的 缓冲液中。30 分钟后， 将 1 体积的显像剂加入其中。用 355nm 光线对荧光基团进行激发并 且在荧光板读数器上对激发光线 (450nm) 进行检测。 说 明 书 CN 101962349 B 7 6/6 页 8 0060 对于各次实验， 对照实验 ( 含。
37、有 HeLa 核提取物和缓冲液 )、 空白培养 ( 含有缓冲 液， 但不含有HeLa核提取物)和样品(含有溶于DMSO中的上述多肽化合物并且进一步在缓 冲液中进行稀释， 和含有 HeLa 核提取物 ) 平行进行。在第一种情形中， 多肽化合物在 10-5M 的浓度下进行实验。当多肽化合物在 10-5M 显示活性时， 构造浓度 - 反应曲线， 其中多肽化 合物在 10-5M 10-9M 的浓度下进行实验。所有的样品都实验 4 次。在各次实验中， 从对照 实验值和样品值中减去空白值。 对照样品表示100的基质脱乙酰化作用。 对于各个样品， 其荧光值由对照平均值的百分比表示。适当时， 采用分级数据的概率分析对 IC50值 ( 使代 谢产物的量降低至对照组的50时所需要的药物浓度)进行计算。 在此将实验化合物的效 果表示为 pIC50(IC50值的负对数值 )。 0061 实验结果表明上述多肽化合物的 pIC50值为 6.87， 对组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 具有 抑制活性。 说 明 书 CN 101962349 B 8 。