对相关申请的交叉引用
本申请要求2007年12月24日提交的美国临时申请号61/016,524和2008年 5月27日提交的美国临时申请号61/056,206的较早提交日期的权益，通过提及 而将其公开内容收入本文。
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发明背景
本公开内容关注免疫学领域。更具体而言，本公开内容涉及用于引发对 呼吸道合胞病毒(RSV)特异性的免疫应答的组合物和方法。
人呼吸道合胞病毒(RSV)是小于6个月龄的婴儿和怀孕期小于或等于35 周的早产儿中下呼吸道感染(LRI)的最常见的全球性原因。RSV疾病谱包括从 鼻炎(rhinitis)和耳炎(otitis)至肺炎(pneumonia)和细支气管炎(bronchiolitis)的 一大批呼吸症状，后两种疾病与相当高的发病率和死亡率有关。人是RSV唯 一已知的贮主。自受污染的鼻分泌物扩散病毒经由大的呼吸飞沫发生，因此 传播需要与受感染个体或受污染表面紧密接触。RSV能在玩具或其它物体上 持续数小时，这解释了医院RSV感染的高比率，特别是在儿科病房中。
估计全球每年的RSV感染和死亡数字分别是6400万和16万。仅在美国， 估计RSV每年造成18,000至75,000例住院和90至1900例死亡。在温带气候， RSV被较好地证明为急性LRI(包括细支气管炎和肺炎)的每年冬季流行病 的一个原因。在美国，几乎所有儿童到两岁时都感染过RSV。RSV相关LRI 在其它方面健康的儿童中的发生率计算为生命前两年中37/1000名儿童-年 (小于6个月龄的婴儿中45/1000名儿童-年)，而住院风险为6/1000名儿童-年 (生命前6个月中每1000名儿童-年)。发生率在患有心肺疾病的儿童和早产 儿中较高，在美国这些儿童构成几乎半数的RSV相关医院收治。经受由RSV 引起的更严重的LRI的儿童以后具有升高的儿童哮喘发生率。这些研究表明 患有严重LRI及其后遗症的患者的护理花费巨大的工业化国家普遍需要RSV 疫苗及其使用。RSV还日益被公认为老年人中流感样病的发病率的一个重要 原因。
已经尝试了多种办法来努力产生安全且有效的RSV疫苗，其在健康的和 有风险的群体中产生持久的且保护性的免疫应答。然而，迄今所评估的候选 物无一证明作为疫苗用于预防RSV感染和/或减轻或预防RSV疾病(包括下呼 吸道感染(LRI))是安全且有效的。
发明概述
本公开内容关注重组呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。更具体而言，本公开 内容关注包含已经进行过修饰以稳定三聚体融合前构象的重组F蛋白的抗 原。所公开的重组抗原展现出卓越的免疫原性，而且作为针对RSV感染和/ 或疾病提供保护的免疫原性组合物(例如疫苗)的成分而被采用是特别有利 的。还公开了编码重组抗原的核酸、含有所述抗原的免疫原性组合物、及用 于生成和使用所述抗原的方法。
附图简述
图1A是突出显示RSVF蛋白的结构特征的示意图。图1B是例示性RSV融 合前F(PreF)抗原的示意图。
图2是一幅线图，其显示了对PreF的不对称场流分级(asymmetricalfield flowfractionation，AFF-MALS)分析的代表性结果。
图3是一幅柱形图，其显示了PreF抗原对人血清的中和抑制。
图4A和图4B是柱形图，其显示了小鼠中响应PreF抗原而引发的血清IgG 滴度。
图5A和图5B是柱形图，其显示了由PreF抗原引发的对RSV特异性的中和 性抗体的滴度。
图6A和图6B是显示在小鼠中由RSVPreF抗原提供的针对攻击的保护的 图。
图7是免疫和攻击后评估BAL白细胞的图。
发明详述
导言
由于宿主免疫应答表现出在疾病的发病机制中起作用的实情而使开发 疫苗来预防RSV感染变得复杂。二十世纪60年代的早期研究显示了，与未接 种疫苗的对照受试者相比，接种用福尔马林灭活的RSV疫苗的儿童在随后暴 露于病毒后遭受更严重的疾病。这些早期试验导致80％的接种疫苗者住院和 2例死亡。增强的疾病严重性已经在动物模型中得到再现，而且认为其源自 血清中和性抗体的水平不足、缺乏局部免疫、和2型辅助T细胞样(Th2)免疫 应答的诱导过量，其伴有肺嗜酸粒细胞增多及IL-4和IL-5细胞因子的生成增 加。比较而言，针对RSV感染提供保护的成功疫苗诱导Th1偏爱性免疫应答， 其特点在于IL-2和γ-干扰素(IFN)的生成。
本公开内容关注重组呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，其解决先前在疫苗中 使用RSV抗原遇到的问题，而且改善抗原的免疫学特性以及制备特性。本文 所公开的重组RSV抗原牵涉一种融合(F)蛋白类似物，其包含可溶性F蛋白多 肽，该可溶性F蛋白多肽已经进行过修饰以稳定F蛋白的融合前构象，即成熟 的装配好的F蛋白在与宿主细胞膜融合前的构象。为了清晰和简单，这些F 蛋白类似物称作“PreF”或“PreF抗原”。本文所公开的PreF抗原以如下未预 见到的发现为基础，即已经通过掺入异源三聚化域来修饰的可溶性F蛋白类 似物展现出改良的免疫原性特征，而且在对受试者体内施用时是安全且高度 保护性的。
本文参照本领域中广泛接受的术语和名称来提供RSVF蛋白结构的详 情，并在图1A中示意性显示。图1B中提供了例示性PreF抗原的示意图。本领 域技术人员会了解，依照本文所提供的教导，可以修饰任何RSVF蛋白来稳 定融合前构象。因此，为了便于理解指导PreF抗原生成的原则，各个结构构 件会参照例示性F蛋白来指明，所述例示性F蛋白的多核苷酸和氨基酸序列分 别在SEQIDNO：1和2中提供。类似地，在可适用的情况中，G蛋白抗原参照 例示性G蛋白来描述，所述例示性G蛋白的多核苷酸和氨基酸序列分别在 SEQIDNO：3和4中提供。
参照F蛋白多肽的一级氨基酸序列(图1A)，利用下列术语来描述PreF 抗原的结构特征。
术语F0指全长翻译的F蛋白前体。F0多肽可以细分成由称作pep27的居间 肽分开的F2域和F1域。成熟过程中，F0多肽在位于F2和F1之间且在pep27侧 翼的两个弗林蛋白酶位点处经历蛋白水解切割。为了随后的讨论，F2域包含 F蛋白氨基酸1-109的至少一部分，并且多达所有，而F1域的可溶性部分包含 F蛋白氨基酸137-526的至少一部分，并且多达所有。如上文所指明的，这些 氨基酸位置(和本文指明的所有随后的氨基酸位置)参照例示性F蛋白前体 多肽(F0)SEQIDNO：2给出。
融合前F(或“PreF”)抗原是一种可溶性(即不是膜结合的)F蛋白类 似物，其包含至少一处稳定F蛋白的融合前构象的修饰，从而RSV抗原保留F 蛋白的融合前构象的至少一个免疫优势表位。可溶性F蛋白多肽包含RSVF 蛋白的F2域和F1域(但是不包含RSVF蛋白的跨膜域)。在例示性的实施方 案中，F2域包含F蛋白的氨基酸26-105，而F1域包含F蛋白的氨基酸137-516。 然而，也可以使用更小的部分，只要稳定化的PreF抗原的三维构象得到维持。 类似地，也可以使用包含额外结构构件的多肽(例如融合多肽)来替换例示 性F2和F1域，只要所述额外构件不破坏三维构象，或者在其它方面不会不利 地影响稳定性、生成或加工，或者降低抗原的免疫原性。F2和F1域以N端至 C端取向定位，设计成复制F蛋白类似物折叠和装配成成熟的融合前构象。为 了增强生成，F2域之前可以有分泌信号肽，诸如天然F蛋白信号肽或异源信 号肽，其选择用于在要表达重组PreF抗原的宿主细胞中增强生成和分泌。
通过引入一处或多处修饰，诸如一个或多个氨基酸的添加、删除或替代 来稳定PreF抗原(处于三聚体融合前构象)。一种此类稳定化修饰是添加包 含异源稳定化域的氨基酸序列。在例示性的实施方案中，所述异源稳定化域 是蛋白质多聚化域。此类蛋白质多聚化域的一个特别有利的例子是卷曲螺旋 域，诸如异亮氨酸拉链域，其促进多个具有此类域的多肽的三聚化。SEQID NO：11中描述了一种例示性异亮氨酸拉链域。典型地，所述异源稳定化域定 位于F1域的C端。
任选地，经由短的氨基酸接头序列(诸如序列GG)将多聚化域连接至 F1域。所述接头也可以是更长的接头(例如包括序列GG，诸如氨基酸序列： GGSGGSGGS；SEQIDNO：14)。许多构象中性接头是本领域中已知的，其 可以在这种背景中使用而不破坏PreF抗原的构象。
另一种稳定化修饰是消除弗林蛋白酶识别和切割位点，其位于天然F0 蛋白中F2和F1域之间。可以通过删除或替代弗林蛋白酶识别位点的一个或多 个氨基酸来消除一个或两个弗林蛋白酶识别位点(位于第105位-第109位和 第133位-第136位)，从而该蛋白酶不能将PreF多肽切割成其构成域。任选地， 也可以除去或用例如接头肽替代居间pep27肽。另外，或任选地，可以除去 或替代接近融合肽的非弗林蛋白酶切割位点(例如第112位-第113位的金属蛋 白酶位点)。
稳定化突变的另一个例子是将亲水性氨基酸添加或替代入F蛋白的疏水 域中。典型地，会在疏水区中添加带电荷的氨基酸诸如赖氨酸或者用其替代 中性残基诸如亮氨酸。例如，可以将/用亲水性氨基酸添加至或替代F蛋白胞 外域的HRB卷曲螺旋域内的疏水性或中性氨基酸。举例而言，可以用带电荷 的氨基酸残基诸如赖氨酸替代F蛋白的第512位处存在的亮氨酸。或者/另外， 可以将/用亲水性氨基酸添加至或替代F蛋白的HRA域内的疏水性或中性氨 基酸。例如，可以在PreF抗原的第105位-第106位处或者接近第105位-第106 位处(例如在与参照SEQIDNO：2的残基105对应的氨基酸后，诸如在氨基酸 105和106之间)插入一个或多个带电荷的氨基酸诸如赖氨酸。任选地，可以 在HRA和HRB域两者中添加亲水性氨基酸或者用亲水性氨基酸替代。或者， 可以删除一个或多个疏水性残基，只要PreF抗原的总体构象没有受到不利影 响。
可以个别地和/或与本文所公开的任何其它稳定化修饰组合地使用任何 和/或所有稳定化修饰来生成PreF抗原。在例示性的实施方案中，PreF蛋白包 含如下多肽，其包含F2域和F1域，F2域与F1域之间没有居间弗林蛋白酶切割 位点，并且有位于F1域C端的异源稳定化域(例如三聚化域)。在某些实施方 案中，PreF抗原还包括一处或多处将/用亲水性残基添加和/或替代入疏水性 HRA和/或HRB域中。任选地，PreF抗原具有至少一个非弗林蛋白酶切割位 点(诸如金属蛋白酶位点)的修饰。
任选地，PreF抗原可以包括额外的多肽构件，其至少包含RSVG蛋白的 免疫原性部分。也就是说，在某些实施方案中，PreF抗原是包含F蛋白和G 蛋白构件两者的嵌合蛋白。F蛋白构件可以是上文所描述的任何PreF抗原， 而G蛋白构件选择为RSVG蛋白的免疫学活性部分(多至和/或包括全长G蛋 白)。在例示性的实施方案中，G蛋白多肽包含G蛋白的氨基酸149-229(其中 氨基酸位置参照SEQIDNO：4中表示的G蛋白序列指明)。本领域技术人员会 领会，可以使用G蛋白的更小部分或片段，只要选定的部分保留较大G蛋白 片段的优势免疫学特征。具体地，选定的片段保留在约氨基酸位置184-198 (例如氨基酸180-200)之间的免疫学优势表位，而且长得足以折叠和装配 成展现出免疫优势表位的稳定构象。也可以使用更长的片段，例如自约氨基 酸128至约氨基酸229，多达全长G蛋白。只要选定的片段在嵌合蛋白的背景 中折叠成稳定的构象，并且在宿主细胞中重组生成时不干扰生成、加工或稳 定性。任选地，经由短的氨基酸接头序列诸如序列GG将G蛋白构件连接至F 蛋白构件。所述接头也可以是更长的接头(诸如氨基酸序列：GGSGGSGGS： SEQIDNO：14)。许多构象中性的接头是本领域中已知的，其可以在不破坏 PreF抗原构象的情况中在这种背景中使用。
任选地，G蛋白构件可以包括在RSV疾病的动物模型中减轻或预防增强 性病毒疾病的一处或多处氨基酸替代。也就是说，G蛋白可以包括如下氨基 酸替代，从而在对选自公认动物模型(例如RSV的小鼠模型)的受试者施用 包含PreF-G嵌合抗原的免疫原性组合物时，与接受疫苗(包括含有未修饰G 蛋白的疫苗)的对照动物相比，受试者展现出疫苗增强性病毒疾病(例如嗜 酸粒细胞增多、中性白细胞增多)的症状减轻或没有症状。疫苗增强性病毒 疾病的减轻和/或预防在没有佐剂的情况中施用免疫原性组合物时(而不是在 例如存在强烈的Th1诱导性佐剂的情况中施用抗原时)可以是明显的。另外， 在对人受试者施用时，氨基酸替代可以减轻或预防疫苗增强性病毒疾病。合 适氨基酸替代的一个例子是用丙氨酸替换第191位的天冬酰胺(氨基酸191处 Asn→Ala：N191A)。
任选地，上文所描述的任何PreF抗原可以包含起有助于纯化的作用的额 外序列。一个例子是多组氨酸标签。若想要的话，可以自最终产物除去此类 标签。
在表达时，PreF抗原经受分子内折叠，并装配成成熟蛋白，其包括多肽 的多聚体。有利地，PreF抗原多肽装配成三聚体，其类似于成熟的、加工过 的RSVF蛋白的融合前构象。
为了引发针对RSV的保护性免疫应答，可以在免疫原性组合物中有利地 使用本文所公开的任何PreF抗原(包括PreF-G抗原)。此类免疫原性组合物 通常包含药学可接受载体和/或赋形剂诸如缓冲剂。为了增强施用后产生的免 疫应答，免疫原性组合物通常还包含佐剂。在用于引发针对RSV的保护性免 疫应答的免疫原性组合物(例如疫苗)的情况中，有利的是，组合物包含主 要引发Th1免疫应答的佐剂(Th1偏爱性佐剂)。典型地，佐剂选择为适合于 对要施用组合物的目标群体施用。如此，根据应用，佐剂选择为适合于对例 如新生儿或老年人施用。
有利地，采用本文所描述的免疫原性组合物作为疫苗来减轻或预防感染 RSV，而在施用或暴露于RSV后不诱导病理学应答(诸如疫苗增强性病毒疾 病)。
在一些实施方案中，免疫原性组合物包含PreF抗原(诸如由SEQIDNO：6 显示的例示性实施方案)和包含G蛋白构件的第二多肽。G蛋白构件通常至 少包含G蛋白的氨基酸149-229。虽然可以使用G蛋白的更小部分，但是此类 片段应当最低限度包含氨基酸184-198的免疫学优势表位。或者，G蛋白可以 包含G蛋白的更大部分，诸如氨基酸128-229或130-230，任选地，作为更大 蛋白质诸如全长G蛋白或嵌合多肽的元件。
在其它实施方案中，免疫原性组合物包含作为嵌合蛋白的PreF抗原，所 述嵌合蛋白还包含G蛋白构件(诸如由SEQIDNO：8和10显示的例示性实施 方案)。此类嵌合PreF(或PreF-G)抗原的G蛋白构件通常至少包含G蛋白的 氨基酸149-229。如上文所指明的，也可以使用G蛋白的更小或更大片段(诸 如氨基酸129-229或130-230)，只要免疫优势表位得到保留，并且PreF-G抗原 的构象没有受到不利影响。
任选地，免疫原性组合物还可以包含与RSV不同的病原性生物体的至少 一种别的抗原。例如，病原性生物体是与RSV不同的病毒，诸如副流感病毒 (PIV)、麻疹、乙肝、脊髓灰质炎病毒、或流感病毒。或者，病原性生物体可 以是细菌，诸如白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血菌、和肺炎球菌。
编码任何PreF抗原(包括PreF-G抗原)的重组核酸也是本公开内容的特 征。在一些实施方案中，优化编码PreF抗原的核酸的多核苷酸序列以在选定 的宿主(诸如CHO细胞、其它哺乳动物细胞、或昆虫细胞)中表达。因而， 载体(包括表达载体，包括原核和真核表达载体)是本公开内容的特征。同 样地，包含此类核酸和载体的宿主细胞是本公开内容的特征。此类核酸也可 以在对受试者施用的免疫原性组合物的背景中使用以引发对RSV特异性的 免疫应答。
有利地，使用PreF抗原来预防和/或治疗RSV感染。如此，本公开内容的 另一方面关注一种用于引发针对RSV的免疫应答的方法。该方法牵涉对受试 者(诸如人或动物受试者)施用免疫学有效量的含有PreF抗原的组合物。施 用免疫学有效量的组合物引发对PreF抗原上存在的表位特异性的免疫应答。 此类免疫应答可以包括B细胞应答(例如中和性抗体的生成)和/或T细胞应 答(例如细胞因子的生成)。有利地，由PreF抗原引发的免疫应答包括对RSV F蛋白的融合前构象上存在的至少一个构象表位特异性的要件。可以对受试 者施用PreF抗原和组合物，而在与RSV接触后不增强病毒疾病。有利地，本 文所公开的PreF抗原和适当配制的免疫原性组合物引发Th1偏爱性免疫应 答，其减轻或预防感染RSV和/或减轻或预防感染RSV后的病理学应答。
可以经由多种路径来施用免疫原性组合物，包括直接将PreF抗原放置得 与上呼吸道的粘膜接触的路径，诸如鼻内的。或者，可以采用更传统的施用 路径，诸如肌内施用路径。
如此，还涵盖任何所公开的RSV抗原(或核酸)在制备用于治疗RSV感 染(例如预防性处理或预防RSV感染)的药物中的用途。因而，本公开内容 提供了在药物中使用的所公开重组RSV抗原或免疫原性组合物，以及其用于 预防或治疗RSV相关疾病的用途。
在下文描述和实施例中呈现了关于PreF抗原及其使用方法的其它详情。
术语
为了便于审阅本公开内容的各个实施方案，提供了术语的下列解释。可 以在本公开内容的语境中提供别的术语和解释。
除非另有解释，本文所使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领 域普通技术人员的通常理解具有相同含义。分子生物学中的常见术语的定义 可以参见BenjaminLewin，GenesV，由OxfordUniversityPress出版，1994 (ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，TheEncyclopediaofMolecular Biology，由BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(编)，MolecularBiologyandBiotechnology：aComprehensiveDesk Reference，由VCHPublishers，Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。
除非上下文另有明确指明，单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括 复数所指物。类似地，除非上下文另有明确指明，词语“或”意图包括“和”。 术语“多个/种”指两个/种或更多个/种。应当进一步理解的是，对核酸或多 肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子质量值是近似 的，并且为了描述而提供。另外，关于物质诸如抗原的浓度或水平给出的数 值限制意图为近似的。如此，若指明浓度是至少(例如)200pg，则意图该 浓度被理解为至少约(或“大约”或“～”)200pg。
虽然与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以在本公 开内容的实践或测试中使用，下文描述了合适的方法和材料。术语“包含” 意味着“包括”。如此，除非上下文另有要求，词语“包含”及其变化形式 应当理解为暗示包括规定的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步 骤，或者化合物或步骤的组，但是不排除任何其它化合物、组合物、步骤， 或其组。缩写“例如”(e.g.)衍生自拉丁语exemplifygratia，并且在本文中用 于指明非限制性例子。如此，缩写“例如”(e.g.)与术语“例如”(forexample) 是同义的。
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒亚科 (Pneumovirinae)、肺病毒属(Pneumovirus)的一种病原性病毒。RSV的基因组 是负义RNA分子，其编码11种蛋白质。RNA基因组与病毒N蛋白的紧密联合 形成包在病毒包膜内部的核壳。基于G糖蛋白的抗原性差异，已经描述了两 组人RSV毒株，即A和B组。迄今已经分离出多种RSV毒株。由GenBank和/ 或EMBL登录号指明的例示性毒株可以参见WO2008114149，通过提及而将 其收入本文，以便披露适合于在PreF抗原(包括嵌合PreF-G抗原)中使用， 和与PreF抗原联合使用的RSVF和G蛋白的核酸和多肽序列。别的RSV毒株可 能会得到分离，并且涵盖在RSV属内。类似地，RSV属涵盖通过遗传漂变、 或人工合成和/或重组，源于天然存在的变体(例如以前或以后鉴定的毒株)。
术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”指 具有RSV融合蛋白多肽的整个或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。类似地， 术语“G蛋白”或“G蛋白多肽”指具有RSV附着蛋白多肽的整个或部分氨 基酸序列的多肽或蛋白质。已经描述了许多RSV融合和附着蛋白，并且是本 领域技术人员已知的。WO2008114149列出了此公开内容提交日时公众可获 得的例示性F和G蛋白变体(例如天然存在的变体)。
“变体”在提及核酸或多肽(例如RSVF或G蛋白核酸或多肽，或PreF 核酸或多肽)时指与参照核酸或多肽不同的核酸或多肽。通常，变体与参照 核酸或多肽之间的差异构成与所指物相比小比例的差异。
多肽或蛋白质的“域”或“结构域”指多肽或蛋白质内结构限定的元件。 例如，“三聚化域”指多肽内促进多肽装配成三聚体的氨基酸序列。例如， 三聚化域能促进经由与(具有相同或不同氨基酸序列的别的多肽的)其它三 聚化域的联合而装配成三聚体。该术语也用于指编码此类肽或多肽的多核苷 酸。
术语“天然的”和“天然存在的”指以与其在自然界中相同状态存在的 元件，诸如蛋白质、多肽或核酸。也就是说，该元件没有进行过人工修饰。 应当理解的是，在本公开内容的语境中，RSV蛋白或多肽有许多天然的/天然 存在的变体，例如自不同的天然存在的RSV毒株或分离物获得的。
术语“多肽”指其中单体是经由酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合 物。如本文中所使用的，术语“多肽”或“蛋白质”意图涵盖任何氨基酸序 列，而且包括经修饰的序列诸如糖蛋白。术语“多肽”明确意图涵盖天然存 在蛋白质，以及重组或合成生成的蛋白质。术语“片段”提到多肽时指多肽 的一部分(即亚序列)。术语“免疫原性片段”指多肽的保留全长参照蛋白 质或多肽的至少一个优势免疫原性表位的所有片段。多肽内的取向一般以N 端至C端方向叙述，由各个氨基酸的氨基和羧基模块的取向限定。多肽从N 或氨基端朝向C或羧基端翻译。
“信号肽”是一种短的氨基酸序列(例如长度为约18-25个氨基酸)，其 将新合成的分泌性蛋白质或膜蛋白引导至膜及穿过膜，例如内质网的。信号 肽常常但不普遍位于多肽的N端，并且常常在蛋白质穿过膜后被信号肽酶切 去。信号序列通常含有三种常见的结构特征：N端极性碱性区(n区)、疏水 性核心、和亲水性c区。
术语“多核苷酸”和“核酸序列”指长度为至少10个碱基的核苷酸聚合 形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一核苷酸的经修饰 形式。该术语包括单一和双重形式DNA。“分离的多核苷酸”指与编码序列 两者均不紧密相邻的多核苷酸，它与所述编码序列在正是衍生其的生物体的 天然存在的基因组中紧密相邻(一个在5’端上，而一个在3’端上)。在一个实 施方案中，多核苷酸编码多肽。核酸的5’和3’方向通过参照各个核苷酸单元 的连接性来限定，并依照脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置来指派。以5’至 3’方向阅读多核苷酸序列的信息(编码)内容。
“重组”核酸指具有非天然存在序列或者具有通过人工组合两个在其它 情况中分开的序列区段生成的序列的核酸。可以通过化学合成或者，更常见 地，通过人工操作分离的核酸区段，例如通过遗传工程技术来实现此人工组 合。“重组”蛋白指由已经导入宿主细胞诸如细菌或真核细胞中的异源(例 如重组)核酸编码的蛋白质。可以在具有能够表达由所导入核酸编码的蛋白 质的信号的表达载体上导入核酸，或者可以将核酸整合入宿主细胞染色体 中。
术语“异源的”就核酸、多肽或其它细胞成分而言指明存在如下成分， 其在自然界中通常找不到和/或其源自不同来源或物种。
术语“纯化”(例如就病原体或含有病原体的组合物而言)指自组合物 除去成分(其存在不是想要的)的方法。纯化是一个相对术语，并且不要求 从组合物除去不想要的成分的所有痕迹。在疫苗生产的语境中，纯化包括诸 如离心、透析、离子交换层析、和大小排阻层析、亲和纯化或沉淀等工艺。 如此，术语“纯化的”并不要求绝对纯度；相反，其意图为一个相对术语。 如此，例如纯化的核酸制备物是指定蛋白质比该核酸在其生成环境中(例如 在细胞内或在生化反应室中)得到更多富集的核酸制备物。可以纯化基本上 纯的核酸或蛋白质的制备物，使得想要的核酸占制备物总核酸含量的至少 50％。在某些实施方案中，基本上纯的核酸会占制备物总核酸或蛋白质含量 的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％或更多。
“分离的”生物学成分(诸如核酸分子、蛋白质或细胞器)已经与该成 分天然存在的生物体的细胞中的其它生物学成分，诸如其它染色体和染色体 外DNA和RNA、蛋白质和细胞器基本上分开或已经基本上纯化除去与该成分 天然存在的生物体的细胞中的其它生物学成分，诸如其它染色体和染色体外 DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准 纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制 备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸和蛋白质。
“抗原”指能在动物中刺激抗体生成和/或T细胞应答的化合物、组合物、 或物质，包括注射、吸附、或别的方式导入动物中的组合物。术语“抗原” 包括所有相关抗原性表位。术语“表位”或“抗原决定簇”指抗原上由B和/ 或T细胞应答的位点。“优势抗原性表位”或“优势表位”指针对其产生功能 上显著的宿主免疫应答(例如抗体应答或T细胞应答)的那些表位。如此， 关于针对病原体的保护性免疫应答，优势抗原性表位指在被宿主免疫系统识 别时产生保护免于由该病原体引起的疾病的那些抗原性模块。术语“T细胞 表位”指在与合适的MHC分子结合时被T细胞特异性结合(经由T细胞受体) 的表位。“B细胞表位”指被抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。
“佐剂”指以非特异性方式增强免疫应答产生的药剂。常见的佐剂包括 将抗原吸附至其上的矿物(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬液液；乳剂，包 括油包水、和水包油(及其变体，包括双重乳剂和可逆乳剂)、脂糖、脂多 糖、免疫刺激性核酸(诸如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特 别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)，和此类成分的各种组合。
“免疫原性组合物”指适合于对人或动物受试者施用(例如在实验背景 中)的物质组合物，其能够引发特异性免疫应答，例如针对病原体诸如RSV。 因此，免疫原性组合物包含一种或多种抗原(例如多肽抗原)或抗原性表位。 免疫原性组合物还可以包含一种或多种能够引发或增强免疫应答的别的成 分，诸如赋形剂、载体、和/或佐剂。在某些例子中，施用免疫原性组合物来 引发保护受试者免于由病原体诱导的症状或状况的免疫应答。在一些情况 中，在受试者被暴露于病原体后通过抑制病原体(例如RSV)的复制来预防 (或减轻或改善)由病原体引起的症状或疾病。在本公开内容的语境中，术 语免疫原性组合物应当理解成涵盖意图用于对受试者或受试者群体施用以 引发针对RSV的保护性或姑息性免疫应答的组合物(即疫苗组合物或疫苗)。
“免疫应答”指免疫系统细胞诸如B细胞、T细胞、或单核细胞对刺激物 的应答。免疫应答可以是B细胞应答，其导致特异性抗体诸如抗原特异性中 和性抗体的生成。免疫应答也可以是T细胞应答，诸如CD4+应答或CD8+应 答。在一些情况中，应答对特定抗原是特异性的(即“抗原特异性应答”)。 若抗原衍生自病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性 免疫应答”指抑制病原体的有害功能或活性、减轻病原体感染、或减轻源于 病原体感染的症状(包括死亡)的免疫应答。可以例如通过在噬斑减少测定 法或ELISA中和测定法中抑制病毒复制或噬斑形成，或者通过在体内测量对 病原体攻击的抗性来测量保护性免疫应答。
“Th1”偏爱性免疫应答的特征在于存在生成IL-2和IFN-γ的CD4+T辅助 细胞，并且如此，特征在于分泌或存在IL-2和IFN-γ。比较而言，“Th2”偏爱 性免疫应答的特征在于生成IL-4、IL-5、和IL-13的CD4+辅助细胞占优势。
“免疫学有效量”是用于在受试者中引发针对组合物或针对组合物中抗 原的免疫应答的组合物(典型地，免疫原性组合物)数量。通常，想要的结 果是产生抗原(例如病原体)特异性免疫应答，其能够或促成保护受试者免 于所述病原体。然而，为了获得针对病原体的保护性免疫应答，可需要免疫 原性组合物的多次施用。如此，在本公开内容的语境中，术语免疫学有效量 涵盖与先前或随后施用联合促成获得保护性免疫应答的分数剂量。
形容词“药学可接受的”指明所指物适合于对受试者(例如人或动物受 试者)施用。Remington’sPharmaceuticalSciences，E.W.Martin，Mack PublishingCo.，Easton，PA，第15版(1975)描述了适合于治疗性和/或预防性 组合物(包括免疫原性组合物)的药学投递的组合物和配制剂(包括稀释剂)。
术语“调控”提到应答诸如免疫应答时指改变或变更应答的开始、幅度、 持续时间或特征。调控免疫应答的药剂在其施用后改变下列至少一项：免疫 应答的开始、幅度、持续时间或特征，或者与参照药剂相比改变下列至少一 项：开始、幅度、持续时间或特征。
术语“减轻”是一个相对术语，从而若应答或状况在施用药剂后得到定 量减弱，或者若与参照药剂相比，它在施用药剂后得到减弱，则所述药剂减 轻应答或状况。类似地，术语“预防”不必然意味着药剂完全消除应答或状 况，只要应答或状况的至少一项特征得到消除。如此，减轻或预防感染或应 答诸如病理学应答(例如疫苗增强性病毒疾病)的免疫原性组合物可以但不 必然完全消除此类感染或应答，只要所述感染或应答可测量地减弱例如至少 约50％，诸如至少约70％，或约80％，或甚至约90％(即减弱至10％或更小) 的感染或应答(在没有药剂的情况中，或者与参照药剂相比)。
“受试者”指活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开内容的语境中，受 试者可以是实验受试者，诸如非人动物，例如小鼠、棉鼠、或非人灵长类。 或者，受试者可以是人受试者。
PreF抗原
在自然界中，RSVF蛋白表达为长度为574个氨基酸的单一多肽前体，称 作F0。在体内，F0在内质网中寡聚化，并且在两种保守的弗林蛋白酶共有序 列(弗林蛋白酶切割位点)，即RARR109(SEQIDNO：15)和RKRR136(SEQID NO：16)处被弗林蛋白酶蛋白水解加工以产生由两个二硫化物连接的片段组 成的寡聚物。这些片段中较小者称作F2，并且源于F0前体的N端部分。本领 域技术人员应当认可的是，缩写F0、F1和F2在科学文献中通常称作F0、F1和 F2。较大的、C端F1片段经由疏水性氨基酸序列锚定膜中的F蛋白，所述疏水 性氨基酸与24个氨基酸的胞质尾部相邻。三个F2-F1二聚物结合以形成成熟 的F蛋白，其采用亚稳性融原前(prefusogenic)(“融合前”)构象，该构象在 与靶细胞膜接触后得到触发以经受构象变化。此构象变化暴露疏水性序列 (称为融合肽)，其与宿主细胞膜结合，并促进病毒或受感染细胞的膜与靶 细胞膜融合。
F1片段至少含有两种七价重复域，称作HRA和HRB，并且分别位于融合 肽和跨膜锚定域附近。处于融合前构象，F2-F1二聚物形成球状头部和茎结 构，其中HRA域在球状头部中处于分段的(延伸的)构象。比较而言，HRB 域形成自头部区域延伸的三链卷曲螺旋茎。从融合前向融合后构象转变期 间，HRA域倒塌(collapse)，并使其接近HRB域以形成反平行的六螺旋束。处 于融合后状态，融合肽和跨膜域并列以便于膜融合。
虽然上文所提供的构象描述基于晶体学数据的分子建模，但是可以在不 诉诸于晶体学的情况中监测融合前与融合后构象之间的结构差别。例如，可 以使用电子显微照相术来区别融合前和融合后(或者称作融原前和融原)构 象，如由Calder等，Virology，271：122-131(2000)和Morton等，Virology， 311：275-288所演示的，为了它们的技术教导，通过提及而将它们收入本文。 也可以通过脂质体结合测定法来区别融合前构象与融原(融合后)构象，如 由Connolly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：17903-17908(2006)所描述的， 为了其技术教导，也通过提及而将其收入本文。另外，可以使用如下抗体(例 如单克隆抗体)来区别融合前与融原构象，所述抗体特异性识别RSVF蛋白 的融合前或融原形式之一种或另一种上存在，而另一种形式上不存在的构象 表位。此类构象表位可以是由于分子表面上抗原决定簇的优先暴露。或者， 构象表位可以源于线性多肽中非连续氨基酸的并列。
将本文所公开的PreF抗原设计成稳定并维持RSVF蛋白的融合前构象， 从而在所表达蛋白质的群体中，实质部分的所表达蛋白质群体处于融原前 (融合前)构象(例如如通过结构和/或热力学建模所预测的或者如通过上文 所公开的一种或多种方法所评估的)。将稳定化修饰引入天然的(或合成的) F蛋白诸如SEQIDNO：2的例示性F蛋白中，使得F蛋白的融合前构象的主要 免疫原性表位在将PreF抗原导入细胞或细胞外环境中后(例如在体内，例如 在对受试者施用后)得到维持。
第一，可以在构建体的C端末端放置异源稳定化域以替换F0多肽的膜锚定域。预测此稳定化域补偿HRB不稳定性，有助于稳定融合前构象异构体。在例示性的实施方案中，异源稳定化域是蛋白质多聚化域。此类蛋白质多聚化域的一个特别有利的例子是三聚化域。例示性三聚化域折叠成卷曲螺旋，其促进装配成具有此类卷曲螺旋域的多个多肽的三聚体。三聚化域的一个有利的例子是异亮氨酸拉链。一种例示性异亮氨酸拉链域是由Harbury等Science262：1401-1407(1993)所描述的经工程化改造的酵母GCN4异亮氨酸变体。以SEQIDNO：11表示一种合适的异亮氨酸拉链域的序列，虽然保留形成卷曲螺旋稳定化域的能力的此序列变体是同样合适的。备选的稳定化卷曲螺旋三聚化域包括：TRAF2(登录号Q12933[gi：23503103]；氨基酸299-348)；血小板反应蛋白1(登录号PO7996[gi：135717]；氨基酸291-314)；胞外基质蛋白-4(登录号O95460[gi：14548117]；氨基酸594-618)；CMP(胞外基质蛋白-1)(登录号NP_002370[gi：4505111]；氨基酸463-496)；HSF1(登录号AAX42211[gi：61362386]；氨基酸165-191)；和Cubilin(登录号NP_001072[gi：4557503]；氨基酸104-138)。预期合适的三聚化域导致实质部分的所表达蛋白质装配成三聚体。例如，至少50％的具有三聚化域的重组PreF多肽会装配成三聚体(例如如通过AFF-MALS所评估的)。典型地，至少60％，更有利地，至少70％，并且最想要地，至少约75％或更多的所表达多肽以三聚体存在。
为了使HRB更稳定，可以用赖氨酸替代位于PreF的第512位(相对于天 然的F0蛋白)的亮氨酸残基(例示性PreF抗原多肽SEQIDNO：6的L482K)。 此替代改善卷曲螺旋疏水性残基周期性。类似地，可以在第105位氨基酸后 添加赖氨酸。
第二，可以除去pep27。对处于融合前状态的RSVF蛋白的结构模型的分 析提示pep27在F1和F2之间产生大的无约束环。此环并不促成融合前状态的 稳定化，并且在弗林蛋白酶切割天然蛋白质后被除去。
第三，可以删除两个弗林蛋白酶切割基序之一或两者。凭借此设计，不 从F2切割融合肽，这阻止从融合前构象异构体的球状头部释放和与邻近膜的 可接近性。预测融合肽与膜界面之间的相互作用是融合前状态不稳定性的主 要问题。融合过程期间，融合肽与靶膜之间的相互作用导致融合肽从球状头 部结构内暴露，增强融合前状态的不稳定性，并折叠成融合后构象异构体。 此构象变化实现膜融合过程。预测除去两个弗林蛋白酶切割位点之一或两者 阻止膜与融合肽N端部分的可接近性，这稳定融合前状态。
任选地，还可以通过例如替代一个或多个氨基酸来除去至少一个非弗林 蛋白酶切割位点。例如，实验证据提示，在有助于某些金属蛋白酶进行切割 的条件下，可以在氨基酸110-118附近切割PreF抗原(例如其中切割在PreF抗 原的氨基酸112和113之间；在参照F蛋白多肽SEQIDNO：2的第142位亮氨酸 和第143位甘氨酸之间发生)。因而，对此区域内的一个或多个氨基酸的修饰 能降低对PreF抗原的切割。例如，可以用不同氨基酸诸如异亮氨酸或色氨酸 替代第112位亮氨酸。或者/另外，可以用丝氨酸或丙氨酸替代第113位甘氨酸。
天然的F蛋白多肽可以选自RSVA或RSVB毒株的任何F蛋白，或者选自 其变体(如上文所定义的)。在某些例示性的实施方案中，F蛋白多肽是以SEQ IDNO：2表示的F蛋白。为了便于理解本公开内容，所有氨基酸残基位置(不 管毒株)相对于(即氨基酸残基位置对应于)例示性F蛋白的氨基酸位置给 出。本领域普通技术人员可以通过使用容易地可获得且公知的比对算法(诸 如BLAST，例如使用缺省参数)来比对选定RSV毒株的氨基酸序列与例示性 序列的氨基酸序列，从而容易地确定任何其它RSVA或B毒株的可比氨基酸 位置。WO2008114149中披露了来自不同RSV毒株的F蛋白多肽的许多别的例 子(为了提供RSVF和G蛋白序列的别的例子，通过提及而将其收入本文)。 别的变体可以经由遗传漂变生成，或者可以使用定点或随机诱变，或者通过 重组两种或更多种先前存在的变体来人工生成。此类别的变体在本文所公开 的PreF(和PreF-G)抗原的背景中也是合适的。
在选择F蛋白的F2和F1域时，本领域技术人员会认可，包含整个F2和/ 或F1域不是严格必要的。典型地，构象考虑在选择F2域的亚序列(或片段) 时是重要的。如此，F2域通常包含F2域中促进多肽装配和稳定性的部分。在 某些例示性的变体中，F2域包含氨基酸26-105。然而，在长度上具有微小修 饰(通过添加或删除一个或多个氨基酸)的变体也是有可能的。
典型地，至少选择F1域的亚序列(或片段)，并将其设计成维持包含F 蛋白的免疫优势表位的稳定构象。例如，一般想要选择F1多肽域中包含氨基 酸262-275(帕利珠单抗(palivizumab)中和)和423-436(Centocor的ch101F单 抗)的区域中由中和性抗体识别的表位的亚序列。另外，想要包含T细胞表 位，例如在氨基酸328-355的区域中。最常见地，作为F1亚基的单一连续部 分(例如跨越氨基酸262-436)，但是表位可以在包含作为以稳定构象装配的 不连续元件的这些免疫优势表位的合成序列中得到保留。如此，F1域多肽包 含RSVF蛋白多肽的至少约氨基酸262-436。在本文提供的一个非限制性例子 中，F1域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137至516。本领域技术人员会认可， 别的更短的亚序列可以任凭从业人员使用。
在选择F2或F1域的亚序列时(或者如会在下文就某些PreF-G抗原的G蛋 白构件进行讨论)，在构象考虑外，基于包含别的免疫原性表位来选择序列 (例如变体、亚序列等)可以是想要的。例如，可以使用本领域中已知的锚 基序或其它方法诸如神经网络或多项式确定来鉴定别的T细胞表位，参见例 如RANKPEP(在万维网上于：mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html可获 得)；ProPredI(在万维网上于：imtech.res.in/raghava/propredI/index.html可获 得)；Bimas(在万维网上于：www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html 可获得)；和SYFPEITH(在万维网上于： syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm可获得)。例如， 使用算法来测定肽的“结合阈值”，并选择那些具有给予它们MHC或抗体以 某种亲和力结合的高概率的得分的。算法或是基于对MHC结合特定位置处的 特定氨基酸的影响、对抗体结合特定位置处的特定氨基酸的影响、或是对结 合含有基序的肽中的特定替代的影响。在免疫原性肽的背景内，“保守残基” 指在肽中特定位置处以比通过随机分布会预期的频率显著更高的频率出现 的残基。锚残基是保守残基，其提供与MHC分子的接触点。由此类预测方法 鉴定出的T细胞表位可以通过测量它们对特定MHC蛋白的结合及通过其在 MHC蛋白的背景中呈递时刺激T细胞的能力来确认。
有利地，PreF抗原(包括PreF-G抗原，如下文所讨论的)包括与表达系 统对应的信号肽，例如哺乳动物或病毒信号肽，诸如RSVF0天然信号序列(例 如SEQIDNO：2的氨基酸1-25或SEQIDNO：6的氨基酸1-25)。典型地，信号 肽选择为与选择用于重组表达的细胞相容。例如，可以用信号肽(诸如杆状 病毒信号肽，或蜂毒肽信号肽)替代以在昆虫细胞中表达。合适的植物信号 肽是本领域中已知的，若植物表达系统是优选的话。许多例示性信号肽是本 领域中已知的(参见例如，参见Zhang和Henzel，ProteinSci.，13：2819-2824 (2004)，其描述了许多人信号肽)，并列入例如SPdb信号肽数据库，其包括古 细菌、原核生物和真核生物的信号序列(http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/)。任 选地，任何前述抗原可以包含别的序列或标签诸如His标签来促进纯化。
任选地，PreF抗原可以包含别的免疫原性构件。在某些特别有利的实施 方案中，PreF抗原包含RSVG蛋白抗原性构件。具有PreF和G构件的例示性 嵌合蛋白包括下列PreF_V1(以SEQIDNO：7和8表示)和PreF_V2(以SEQID NO：9和10表示)。
在PreF-G抗原中，在构建体的C端末端处添加G蛋白的抗原性部分(例 如截短的G蛋白，诸如氨基酸残基149-229)。典型地，经由柔性接头序列将G 蛋白构件连接至F蛋白构件。例如，在例示性PreF_V1设计中，通过 -GGSGGSGGS-接头(SEQIDNO：14)将G蛋白连接至PreF构件。在PreF_V2设 计中，接头较短。代替具有-GGSGGSGGS-接头(SEQIDNO：14)，PreF_V2 具有用于接头的2个甘氨酸(-GG-)。
在存在的情况中，G蛋白多肽域可以包含选自任何RSVA或RSVB毒株 的G蛋白的整个或部分。在某些例示性的实施方案中，G蛋白是以SEQID NO：4表示的G蛋白(或者与其95％相同)。合适的G蛋白序列的别的例子可以 参见WO2008114149(通过提及而将其收入本文)。
G蛋白多肽构件选择为至少包含G蛋白中保留免疫优势T细胞表位(例如 在氨基酸183-197的区域中)的亚序列(或片段)，诸如包含天然G蛋白的氨 基酸151-229、149-229、或128-229的G蛋白片段。在一个例示性的实施方案 中，G蛋白多肽是天然G蛋白多肽中包含天然G蛋白多肽氨基酸残基149至229 整个或部分的亚序列(或片段)。本领域技术人员会容易领会的是，也可以 使用更长或更短的G蛋白部分，只要选定的部分不在构象上使PreF-G抗原不 稳定或者破坏PreF-G抗原的表达、折叠或加工。任选地，G蛋白域包含第191 位的氨基酸替代，先前已经显示了其牵涉减轻和/或预防以与福尔马林灭活的 RSV疫苗有关的嗜酸粒细胞增多为特征的增强性疾病。天然存在的和替代的 (N191A)G蛋白的属性的全面描述可以参见例如美国专利公开文本No. 2005/0042230，通过提及而将其收入本文。
例如，关于选择与天然存在的毒株对应的序列，一个或多个域可以在序 列上对应于RSVA或B毒株，诸如称作A2或Long的常见实验室分离物，或任 何其它天然存在的毒株或分离物(如上述WO2008114149中所披露的)。在此 类天然存在的和分离的变体外，也可以在PreF(包括PreF-G)抗原的背景中 采用与上述序列共享序列相似性的经工程化改造的变体。本领域技术人员应 当理解的是，PreF抗原多肽(和多核苷酸序列，如下文所描述的)之间的相 似性就多肽(和一般而言，核苷酸序列)而言可以关于序列间的相似性(在 其它情况中称为序列同一性)表示。序列同一性常常关于百分比同一性(或 相似性)测量；百分比越高，两种序列的一级结构越相似。一般而言，两种 氨基酸(或多核苷酸)序列的一级结构越相似，源于折叠和装配的更高级结 构越相似。PreF多肽(和多核苷酸)序列的变体通常具有一处或少量氨基酸 删除、添加或替代，但是仍然会共享非常高百分比的其氨基酸，和一般而言 其多核苷酸序列。更重要的是，变体保留本文所公开的参照序列的结构属性 和如此，构象属性。
测定序列同一性的方法是本领域中公知的，并且可适用于PreF抗原多 肽，以及编码它们的核酸(例如如下文所描述的)。多种程序和比对算法记 载于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J. Mol.Biol.48：443，1970；Higgins和Sharp，Gene73：237，1988；Higgins和Sharp， CABIOS5：151，1989；Corpet等，NucleicAcidsResearch16：10881，1988；及 Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444，1988。Altschul等，Nature Genet.6：119，1994呈现了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本 的局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST)(Altschul等， J.Mol.Biol.215：403，1990)可获自数个来源，包括(美国)国家生物技术信 息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI，Bethesda，MD)及 在因特网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx组 合使用。如何使用此程序来测定序列同一性的描述在因特网上NCBI网站上 可获得。
在一些例子中，PreF抗原相对于衍生其的天然存在的毒株的氨基酸序列 具有一处或多处氨基酸修饰(例如在上述稳定化修饰外)。此类差异可以是 一个或多个氨基酸的添加、删除或替代。变体通常相差不超过约1％、或2％、 或5％、或10％、或15％、或20％的氨基酸残基。例如，与例示性PreF抗原多 肽序列SEQIDNO：6、8、和/或10相比，变体PreF抗原(包括PreF-G)多肽序 列可以包含1、或2、或多至5、或多至约10、或多至约15、或多至约50、或 多至约100处氨基酸的差异。如此，RSVF或G蛋白，或PreF抗原(包括PreF-G 抗原)背景中的变体通常与参照蛋白(例如SEQIDNO：2、4、6、8和/或10 中显示的参照序列，或本文所公开的任何例示性PreF抗原)共享至少80％、 或85％，更常见地，至少约90％或更多，诸如95％，或甚至98％或99％序列同 一性。作为本公开内容特征包括的别的变体是包含选自WO2008114149中所 披露的天然存在变体的核苷酸或氨基酸序列整个或部分的PreF抗原(包括 PreF-G抗原)。别的变体可以经由遗传漂变生成，或者可以使用定点或随机 诱变，或者通过重组两种或更多种先前存在的变体来人工生成。此类别的变 体在本文所公开的PreF(和PreF-G)抗原的背景中也是合适的。例如，修饰 可以是一个或多个氨基酸(诸如两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸、五 个氨基酸、多至约十个氨基酸，或更多个)的替代，其不改变所得PreF抗原 的构象或免疫原性表位。
或者/另外，修饰可以包括一个或多个氨基酸的删除和/或一个或多个氨 基酸的添加。确实，若想要的话，一个或多个多肽域可以是合成的多肽，其 不对应于任何单一毒株，但是包含来自多个毒株，或者甚至来自通过比对多 种RSV病毒株多肽推导的共有序列的构件亚序列。在某些实施方案中，通过 添加构成标签的氨基酸序列来修饰一个或多个多肽域，所述标签便于随后的 加工或纯化。此类标签可以是抗原性或表位标签、酶标签或多组氨酸标签。 通常，标签位于蛋白质的一端或另一端，诸如在抗原或融合蛋白的C端或N 端。
编码PreF抗原的核酸
本公开内容的另一方面关注编码如上文所描述的PreF抗原的重组核酸。 在某些实施方案中，对重组核酸进行密码子优化以在选定的原核或真核宿主 细胞中表达。例如，SEQIDNO：5和12是编码PreF抗原的序列的两种不同例 示性、非限制性例子，它们已经进行过密码子优化以在哺乳动物(例如CHO) 细胞中表达。为了便于复制和表达，可以将核酸掺入载体诸如原核或真核表 达载体中。包含重组PreF抗原编码核酸的宿主细胞也是本公开内容的特征。 有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)，以及 许多真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母)细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细 胞(诸如CHO、VERO和HEK293细胞)。
为了便于复制和表达，可以将核酸掺入载体诸如原核或真核表达载体 中。虽然本文所公开的核酸可以包含在许多载体(包括例如细菌质粒；噬菌 体DNA；杆状病毒；酵母质粒；自质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体； 病毒DNA诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病、腺病毒、腺伴随病毒、 逆转录病毒等)之任一种中，但是最常见地，载体会是适合于生成多肽表达 产物的表达载体。在表达载体中，编码PreF抗原的核酸通常以对于合适的转 录控制序列(启动子，和任选地，一种或多种增强子)的接近和取向排列以 指导mRNA合成。也就是说，感兴趣的多核苷酸序列可操作连接至合适的转 录控制序列。此类启动子的例子包括：CMV的立即早期启动子、LTR或SV40 启动子、杆状病毒的多角体蛋白启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体 T7和λPL启动子、和已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其它 启动子。表达载体通常还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止 子。任选地，载体包含适合于扩增表达的序列。另外，任选地，表达载体包 含一种或多种选择标志基因以提供供选择经转化的宿主细胞用的表型性状， 诸如供真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者诸如大肠杆菌 中的卡那霉素、四环素或氨苄青霉素抗性。
表达载体还可以含有别的表达元件，例如以改善翻译的效率。这些信号 可以包含例如ATG起始密码子和相邻序列。在一些情况中，例如与感兴趣的 多核苷酸序列(例如天然的起始密码子)同时将翻译起始密码子和相关序列 元件插入合适的表达载体中。在此类情况中，不需要别的翻译控制信号。然 而，在仅插入多肽编码序列或其部分的情况中，提供外源翻译控制信号(包 括ATG起始密码子)来翻译编码PreF抗原的核酸。以正确读码框的方式放置 起始密码子以确保翻译感兴趣的多核苷酸序列。外源转录元件和起始密码子 可以是多种起源的(天然的和合成的两者)。若想要的话，可以通过包含适 合于使用中的细胞系统的增强子来进一步提高表达效率(Scharf等(1994) ResultsProblCellDiffer20：125-62；Bitter等(1987)MethodsinEnzymol153：516-544)。
在一些例子中，编码PreF抗原的核酸(诸如载体)包含为了在导入宿主 细胞中时提高和/或优化PreF编码核酸的表达而选择的一种或多种别的序列 元件。例如，在某些实施方案中，编码PreF抗原的核酸包含内含子序列，诸 如人疱疹病毒5内含子序列(参见例如SEQIDNO：13)。已经反复证明了，内 含子在重组构建体中合适定位时增强同源和异源核酸的表达。另一类表达增 强序列包括外遗传元件诸如基质附着区(或MAR)，或类似的外遗传元件， 例如STAR元件(例如诸如Otte等，Biotechnol.Prog.23：801-807，2007中披露的 那些STAR元件)。不限于理论，认为MAR介导靶DNA序列锚定至细胞核基 质，产生染色质环域，其自异染色质核心向外延伸。虽然MAR不含任何明显 的共有或可识别序列，但是它们最一致的特征表现为总体上高的A/T含量， 和另一条链上占优势的C碱基。这些区域表现为形成弯曲的二级结构，其可 能倾向于链分开，而且可以包含能充当链分开的成核点的核心解旋元件 (CUE)。已经将数个简单的富含AT的序列基序与MAR序列联系起来：例如A 框、T框、DNA解链基序、SATB1结合位点(H框，A/T/C25)和脊椎动物或 果蝇属(Drosophila)的共有拓扑异构酶II位点。例示性MAR序列记载于已公布 的美国专利申请No.20070178469和国际专利申请No.WO02/074969(通过提 及而将其收入本文)。可以用于增强编码PreF抗原的核酸表达的别的MAR序 列包括鸡溶菌酶MAR、MARp1-42、MARp1-6、MARp1-68、和MARpx-29， 其记载于Girod等，NatureMethods，4：747-753，2007(分别以GenBank登录号 EA423306、DI107030、DI106196、DI107561、和DI106512披露)。技术人员 会领会，可以通过选择产生中间水平增强的MAR(如关于MAR1-9报告的) 来进一步调控表达。若想要的话，可以通过搜索序列数据库，例如使用诸如 MAR-Finder(在网络上于futuresoft.org/MarFinder可获得)、SMARTest(在网 络上于genomatix.de可获得)、或SMARScanI(Levitsky等，Bioinformatics 15：582-592，1999)等软件来鉴定用于提高PreF抗原表达的备选MAR序列。在 某些实施方案中，在与PreF抗原编码序列相同的核酸(例如载体)上将MAR 导入(例如转染)宿主细胞中。在一个备选的实施方案中，在不同的核酸上 (例如反式)将MAR导入，并且任选地，它可以与PreF抗原编码多核苷酸序 列共整合。
足以指导本领域普通技术人员完成重组PreF抗原核酸生成的例示性规 程可以参见Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版， ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989；Sambrook等，MolecularCloning：A LaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborPress，2001；Ausubel等，Current ProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates，1992(和至2003 年的增补)；及Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology：ACompendium ofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology，第4版，Wiley&Sons， 1999。
编码PreF抗原多肽的例示性核酸以SEQIDNO：5、7、9、12和13表示。 可以通过装配选自任何已知的(或随后)发现的RSV毒株的类似的F和G蛋白 多肽序列来生成别的变体，例如如WO2008114149中所披露的。本领域技术 人员可以生成与例示性变体共享序列同一性的别的序列变体。典型地，核酸 变体会编码相差不超过1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％的氨基 酸残基的多肽。也就是说，编码的多肽共享至少80％、或85％、更常见地， 至少约90％或更多，诸如95％，或者甚至98％或99％序列同一性。本领域技 术人员会立即理解的是，编码PreF多肽的多核苷酸序列本身可以由于遗传密 码冗余而共享较少的序列同一性。在一些例子中，PreF抗原相对于衍生其的 天然存在的毒株的氨基酸序列具有一处或多处氨基酸修饰(例如在上述稳定 化修饰外)。此类差异可以分别是一个或多个核苷酸或氨基酸的添加、删除 或替代。变体通常相差不超过约1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％ 的核苷酸残基。例如，与例示性PreF抗原核酸SEQIDNO：5、7、9、12和/ 或13相比，变体PreF抗原(包括PreF-G)核酸可以包含1、或2、或多至5、 或多至约10、或多至约15、或多至约50、或多至约100处核苷酸差异。如此， RSVF或G蛋白，或PreF抗原(包括PreF-G抗原)核酸背景中的变体通常与参 照序列(例如SEQIDNO：1、3、5、7、9、12或13中显示的参照序列，或本 文所公开的任何其它例示性PreF抗原核酸)共享至少80％、或85％，更常见 地，至少约90％或更多，诸如95％，或甚至98％或99％序列同一性。作为本 公开内容特征包括的别的变体是包含选自WO2008114149中所披露的天然存 在变体的核苷酸序列整个或部分的PreF抗原(包括PreF-G抗原)。别的变体 可以经由遗传漂变生成，或者可以使用定点或随机诱变，或者通过重组两种 或更多种先前存在的变体来人工生成。此类别的变体在本文所公开的PreF (和PreF-G)抗原的背景中也是合适的。
在先前所描述的变体核酸外，还可以使用与以SEQIDNO：1、3、5、7、 9、12和13表示的一种或多种例示性核酸杂交的核酸来编码PreF抗原。本领 域技术人员会领会，在上文所描述的％序列同一性测量外，两种核酸间的序 列相似性的另一项指示是杂交能力。两种核酸的序列越相似，它们会杂交的 条件越严格。杂交条件的严格性是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是 不同的。如此，产生特定程度的严格性的杂交条件会随选择的杂交方法的性 质和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。一般而言，杂交温度和杂交缓冲 液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)会决定杂交的严格性，虽然清洗 时间也影响严格性。一般而言，严格条件选择为比特定序列在规定离子强度 和pH的热解链温度(Tm)低约5℃至20℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探 针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。用于核酸杂交的条件和严格性 的计算可以参见例如Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual， ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，2001；Tijssen， HybridizationWithNucleicAcidProbes，PartI：TheoryandNucleicAcid Preparation，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology， ElsevierScienceLtd.，NY，NY，1993；和Ausubel等ShortProtocolsin MolecularBiology，第4版，JohnWiley&Sons，Inc.，1999。
出于本公开内容的目的，“严格条件”涵盖杂交仅会在杂交分子与靶序 列之间有小于25％的错配时发生的条件。为了更精确的定义，“严格条件” 可以分成特定的严格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等严格性”条 件指具有超过25％序列错配的分子不会杂交的条件；“中间严格性”条件指 错配超过15％的分子不会杂交的条件，而“高严格性”条件指错配超过10％ 的序列不会杂交的条件。“非常高的严格性”条件指错配超过6％的序列不会 杂交的条件。比较而言，在“低严格性条件”下杂交的核酸包括具有少得多 的序列同一性，或仅在核酸的短的亚序列里具有序列同一性的核酸。因此， 应当理解，由本公开内容所涵盖的核酸的各种变体能够在基本上其整个长度 里与SEQIDNO：1、3、5、7、9、和/或12的至少一项杂交。
生成RSV抗原性多肽的方法
使用用于表达和纯化重组蛋白的完善建立的规程来生成本文所公开的 PreF抗原(包括PreF-G抗原，和在可适用的情况中还包括G抗原)。足以指导 本领域技术人员的规程可以参见下列参考文献：Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Cold SpringHarbor，NY，200；及Ausubel等ShortProtocolsinMolecularBiology， 第4版，JohnWiley&Sons，Inc.，999。下文提供了另外的和具体的详情。
通过许多公知的规程之任一种，诸如电穿孔、脂质体介导的转染(例如 使用商品化脂质体转染试剂诸如LIPOFECTAMINETM2000或 TRANSFECTINTM)、磷酸钙沉淀、感染、转染等(这取决于载体和宿主细胞 的选择)来将编码PreF抗原的重组核酸导入宿主细胞中。SEQIDNO：5、7、 9、12和13中提供了编码PreF抗原(包括PreF-G抗原)的例示性核酸。本领 域技术人员会领会，SEQIDNO：5、7、9、12和13是例示性的，并不意图是 限制性的。例如，可以容易地使用与SEQIDNO：5、7和9编码相同蛋白质(例 如以SEQIDNO：6、8和10表示)，但是差别仅在于遗传密码冗余(诸如备选 密码子优化，如SEQIDNO：12中所显示)的多核苷酸序列来代替例示性序列 SEQIDNO：5、7、和9。类似地，可以采用包含表达增强元件诸如内部定位 的内含子(或者通过添加启动子、增强子、内含子或其它类似的元件)的多 核苷酸序列，如SEQIDNO：13中所显示。本领域普通技术人员会认可，此类 修饰的组合是同样合适的。类似地，也可以使用选自任何RSVA或RSVB毒 株的同源序列和/或共享实质的序列同一性的其它序列(如上文所讨论的)来 表达PreF抗原。确实，可以合适地将先前所公开的任何变体核酸导入宿主细 胞中，并用于生成PreF抗原(包括PreF-G抗原)和可适用情况中的G多肽。
如此，包含重组PreF抗原编码核酸的宿主细胞也是本公开内容的特征。 有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞诸如大肠杆菌，以及许多真核 宿主细胞，包括真菌(例如酵母诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴 斯德毕赤酵母(Picchiapastoris))细胞、昆虫细胞、植物细胞、和哺乳动物细 胞(诸如CHO和HEK293细胞)。将重组PreF抗原核酸导入(例如转导、转化 或转染)宿主细胞中，例如经由载体诸如表达载体。如上文所描述的，载体 最通常是质粒，但是此类载体也可以是例如病毒颗粒、噬菌体等。合适的表 达宿主的例子包括：细菌细胞诸如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、和鼠 伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；真菌细胞，诸如酿酒酵母、巴斯德 毕赤酵母、和粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；昆虫细胞诸如果蝇属和草地夜 蛾(Spodopterafrugiperda)；哺乳动物细胞诸如3T3、COS、CHO、BHK、HEK 293或Bowes黑素瘤；植物细胞，包括藻类细胞等。
可以在为了激活启动子、选择转化体、或者扩增所插入的多核苷酸序列 而酌情修饰的常规营养培养基中培养宿主细胞。培养条件诸如温度、pH等通 常是那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，而且对于本领域 技术人员会是显而易见的，并且在本文所引用的参考文献中，包括例如 Freshney(1994)CultureofAnimalCells，aManualofBasicTechnique，第三版， Wiley-Liss，NewYork及其中所引用的参考文献。也可以在非动物细胞诸如植 物、酵母、真菌、细菌等中生成与本发明的核酸对应的表达产物。在Sambrook， Berger和Ausubel外，关于细胞培养的详情可以参见Payne等(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons，Inc.NewYork，NY； Gamborg和Phillips(编)(1995)PlantCell，TissueandOrganCulture； FundamentalMethodsSpringerLabManual，Springer-Verlag(BerlinHeidelberg NewYork)及Atlas和Parks(编)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993) CRCPress，BocaRaton，FL。
在细菌系统中，可以根据所表达产物预期的用途来选择许多表达载体。 例如，当需要大量多肽或其片段来生成抗体时，有利地采用指导容易纯化的 融合蛋白高水平表达的载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和 表达载体诸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可以将感兴趣的编码序列(例 如如上文所描述的本发明的多核苷酸)与氨基端翻译起始甲硫氨酸和随后β- 半乳糖苷酶的7个残基的序列以符合读码框方式连接入载体中，生成有催化 活性的β-半乳糖苷酶融合蛋白；pIN载体(VanHeeke和Schuster(1989)JBiol Chem264：5503-5509)；pET载体(Novagen，MadisonWI)，其中将氨基端甲硫 氨酸以符合读码框方式与组氨酸标签连接；等。
类似地，在酵母诸如酿酒酵母中，可以使用许多含有组成性或诱导型启 动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的载体来生成想要的表达产物。关于综述， 参见Berger、Ausubel、和例如Grant等(1987；MethodsinEnzymology 153：516-544)。在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多表达系统，包括质粒 和基于病毒的系统两者。
任选地，对宿主细胞选择其调控所插入序列表达或者以想要的方式加工 所表达蛋白质的能力。对蛋白质的此类修饰包括但不限于糖基化(以及例如 乙酰化、羧基化、磷酸化、脂质化(lipidation)和酰化)。任选地，在宿主细胞 的背景中实施翻译后加工，例如其将前体形式切割成蛋白质的成熟形式(例 如通过弗林蛋白酶)。不同宿主细胞诸如3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、 MDCK、293、WI38等针对此类翻译后活性具有特定的细胞机器(machinery) 和特征性机制，并且可以进行选择以确保对所导入的、外来蛋白质的正确修 饰和加工。
为了本文所公开的重组PreF抗原的长期的、高产量生成，通常使用稳定 的表达系统。例如，使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标志基因 的表达载体来将稳定表达PreF抗原多肽的细胞系引入宿主细胞中。导入载体 后，容许细胞在滋养培养基中生长1-2天，之后将其转换至选择培养基。选 择标志的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在容许成功表达所导入序列的 细胞的生长和回收。例如，可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖 稳定转化细胞的抗性组或集落。任选地，在适合于自细胞培养物表达和回收 所编码蛋白质的条件下培养用编码PreF抗原的核酸转化的宿主细胞。
转导合适的宿主细胞系并将宿主细胞培养至合适的细胞密度后，通过合 适的手段(例如温度变动或化学诱导)来诱导选定的启动子，并将细胞再培 养一段时间。任选地，培养基包含降低蛋白酶降解所表达蛋白质的成分和/ 或添加剂。例如，用于培养细胞以生成PreF抗原的培养基可以包含蛋白酶抑 制剂，诸如螯合剂或小分子抑制剂(例如AZ11557272、AS111793等)以降 低或消除由细胞、或细胞外(例如基质)蛋白酶进行的不想要的切割。
然后自培养液回收所分泌的多肽产物。或者，可以通过离心来收获细胞， 通过物理或化学手段来破坏细胞，并保留所得的粗制提取物用于进一步纯 化。可以通过任何便利的方法来破坏蛋白质表达中所采用的真核或微生物细 胞，包括冷冻-融化循环、超声处理、机械破坏、或者使用细胞裂解剂、或 者其它方法，其对于本领域技术人员是公知的。
可以通过本领域公知的许多方法之任一种来从重组细胞培养物回收和 纯化所表达的PreF抗原，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离 心、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲 和层析(例如使用本文所记录的任何加标签系统)、羟磷灰石层析、和凝集 素层析。根据需要，可以在完成成熟蛋白质的构型中使用蛋白质重折叠步骤。 最后，可以在最终的纯化步骤中采用高效液相层析(HPLC)。在上文所记录的 参考文献外，多种纯化方法是本领域公知的，包括例如下列文献列出的： Sandana(1997)BioseparationofProteins，AcademicPress，Inc.；和Bollag等 (1996)ProteinMethods，第2版Wiley-Liss，NY；Walker(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress，NJ，Harris和Angal(1990)ProteinPurificationApplications：APracticalApproachIRLPressatOxford，Oxford， U.K.；Scopes(1993)ProteinPurification：PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag，NY；Janson和Ryden(1998)ProteinPurification：Principles，HighResolutionMethodsandApplications，第二版Wiley-VCH，NY；及 Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress，NJ。
在某些例子中，经由适合于在原核细胞(例如大肠杆菌细胞)中导入和 表达的载体来将核酸导入细胞中。例如，可以将包含编码PreF抗原的多核苷 酸序列的核酸导入多种商品化或专有载体诸如pET表达载体系列(例如 pET9b和pET2d)之任一种中。IPTG可诱导编码序列的表达，产生高水平的 蛋白质表达。在噬菌体T7启动子下转录编码PreF抗原的多核苷酸序列。备选 的载体诸如包含热诱导型λpL启动子的pURV22也是合适的。
将表达载体导入(例如通过电穿孔)合适的细菌宿主中。许多合适的大 肠杆菌菌株是可用的，并且可以由本领域技术人员进行选择(例如，已经证 明了Rosetta和BL21(DE3)菌株对于表达含有编码PreF抗原的多核苷酸序列 的重组载体是有利的)。
更典型地，将编码PreF抗原的多核苷酸掺入适合于在真核(例如昆虫或 哺乳动物细胞)中导入和表达的表达载体中。有利地，对此类核酸进行密码 子优化以在选定的载体/宿主细胞中表达(例如，对SEQIDNO：5、7、9和12 中显示的序列进行密码子优化以在CHO细胞中表达)。在一个例示性的实施 方案中，将编码PreF抗原的多核苷酸序列导入载体中，诸如由Lonza Biologicals公司开发的pEE14载体。在组成性启动子诸如立即早期CMV(巨 细胞病毒)启动子下表达多肽。基于经转染的细胞在没有谷氨酰胺来源的情 况中生长的能力来进行对表达多肽的经稳定转染的细胞的选择。已经成功整 合pEE14的细胞能够在没有外源谷氨酰胺的情况中生长，因为pEE14载体表 达GS(谷氨酰胺合成酶)酶。可以对选定的细胞进行克隆扩充，并表征想要 的PreF多肽的表达。
在另一个例子中，使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来将编码PreF抗原 的多核苷酸序列导入昆虫细胞中。可以使用商品化载体、试剂盒和/或系统， 诸如来自BDBioScience的BDBaculoGold系统来生成能够感染昆虫细胞的重 组杆状病毒。简言之，将编码抗原的多核苷酸序列插入pAcSG2转移载体中。 然后，通过pAcSG2嵌合质粒和BDBaculoGold(含有杆状病毒苜蓿银蚊夜蛾 核型多角体病毒(AcNPV)的线性化基因组DNA)共转染宿主细胞SF9(草地 夜蛾)。转染后，pACSG2质粒与杆状病毒基因组之间发生同源重组以生成重 组病毒。在一个例子中，在多角体蛋白启动子(pH)的调节控制下表达PreF抗 原。可以使用其它启动子诸如基本的(Ba)和p10启动子来生成类似的转移载 体。类似地，可以采用备选的昆虫细胞，诸如与Sf9紧密相关的SF21，和自 甘蓝尺蠖，即粉纹夜蛾(Trichoplusiani)衍生的HighFive细胞系。
转染和诱导表达(依照选定的启动子和/或增强子或其它调节元件)后， 将所表达的多肽回收(例如纯化或富集)，并复性以确保折叠成有抗原性活 性的融合前构象。
免疫原性组合物和方法
还提供了免疫原性组合物，其包含上文所公开的任何PreF抗原(诸如那 些以SEQIDNO：6、8和10例示的)和药学可接受载体或赋形剂。
在某些实施方案中，典型地，在PreF抗原不包含G蛋白构件(诸如SEQID NO：6)的实施方案中，免疫原性组合物可以包含分离的、重组的和/或纯化 的G蛋白。本领域中已经描述了许多合适的G蛋白，并且包括全长重组G蛋白 和由G蛋白的一部分(诸如氨基酸128-229或130-230)和融合配偶(诸如硫 氧还蛋白)、或信号和/或前导序列(其便于表达和/或纯化)构成的嵌合蛋白。 与PreF抗原混合使用的例示性G蛋白可以参见WO2008114149、美国专利No. 5,149,650、美国专利No.6,113,911、美国已公布的申请No.20080300382、和 美国专利No.7,368,537，通过提及而将每篇收入本文。如关于嵌合PreF-G蛋 白所指明的，可以在牵涉PreF(没有G)和G的混合物的背景中有利地采用G 蛋白的更小片段，诸如氨基酸149-229之间的部分，或约128至约229之间的 部分。如上文所讨论的，重要的考虑是免疫优势表位的存在，例如包含在氨 基酸183-197的区域内的。或者，可以在此类组合物中采用全长G蛋白。
药学可接受载体和赋形剂是公知的，并且可以由本领域技术人员进行选 择。例如，载体或赋形剂可以有利地包括缓冲剂。任选地，载体或赋形剂还 含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的成分。增溶剂/稳定剂的例子包括去 污剂，例如月桂树肌氨酸和/或Tween。备选的增溶剂/稳定剂包括精氨酸和玻 璃形成多元醇(诸如蔗糖、海藻糖等)。许多药学可接受载体和/或药学可接 受赋形剂是本领域已知的，并且记载于例如Remington’sPharmaceutical Sciences，E.W.Martin，MackPublishingCo.，Easton，PA，第5版(975)。
因而，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合于通过 选定的施用路径向受试者投递的配制剂。
合适的赋形剂包括但不限于：甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇、海藻 糖、N-月桂酰肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污剂磺基甜菜碱、盐酸胍、脲、 三甲胺氧化物、KCl、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+和其它二价阳离子相关盐、 二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇(Dithioerytrol)、和β-巯基乙醇。其它赋形剂可以 是去污剂(包括：Tween80、Tween20、TritonX-00、NP-40、EmpigenBB、 辛基葡糖苷、月桂酰麦芽糖苷、Zwittergent3-08、Zwittergent3-0、Zwittergent 3-2、Zwittergent3-4、Zwittergent3-6、CHAPS、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸 钠、溴化十六烷基三甲铵)。
任选地，免疫原性组合物还包含佐剂。在适合于对受试者施用以引发针 对RSV的保护性免疫应答的免疫原性组合物的背景中，对佐剂进行选择以引 发Th1偏爱性免疫应答。
通常对佐剂进行选择以在接受组合物施用的受试者或受试者群体中增 强Th1偏爱性免疫应答。例如，在要对RSV感染易感(或者有升高风险的) 的特定年龄组的受试者施用免疫原性组合物时，佐剂选择为在受试者或受试 者群体中是安全且有效的。如此，在配制含有RSVPreF抗原的免疫原性组合 物以在老年受试者(诸如年龄大于65岁的受试者)中施用时，佐剂选择为在 老年受试者中是安全且有效的。类似地，在含有RSVPreF抗原的免疫原性组 合物意图用于在新生儿或婴儿受试者(诸如在出生和年龄为两岁之间的受试 者)中施用时，佐剂选择为在新生儿和婴儿中是安全且有效的。
另外，通常对佐剂进行选择以在经由施用免疫原性组合物的施用路径施 用时增强Th1免疫应答。例如，在配制含有PreF抗原的免疫原性组合物用于 鼻施用时，蛋白体和Protollin是有利的Th1偏爱性佐剂。比较而言，在将免疫 原性组合物配制用于肌内施用时，有利地选择包括下列一项或多项的佐剂： 3D-MPL、鲨烯(例如QS21)、脂质体、和/或油和水乳剂。
一种适合于与PreF抗原组合使用的佐剂是非毒性细菌脂多糖衍生物。合 适的脂质A非毒性衍生物的例子是单磷酰脂质A或者更具体的是，3-脱酰单磷 酰(monophoshoryl)脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKlineBiologicals N.A.以名称MPL出售，并且贯穿整个文件称为MPL或3D-MPL。参见例如， 美国专利No.4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进 具有IFN-γ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。可以依照GB2220211A中所披露的 方法来生成3D-MPL。在化学上，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单 磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小 颗粒3D-MPL具有如下颗粒大小，使得其可以无菌过滤流过0.22μm滤器。此 类制备物记载于WO94/21292。
可以以每人剂量的免疫原性组合物1和50μg之间的量使用脂多糖诸如 3D-MPL。可以以约25μg，例如20-30μg之间，合适地21-29μg之间或22和28μg 之间或23和27μg之间或24和26μg之间，或25μg的水平使用此3D-MPL。在另 一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μg，例如5和15μg之 间，合适地6和14μg之间，例如7和13μg之间或8和12μg之间或9和11μg之间， 或10μg的水平的3D-MPL。在又一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物 包含在约5μg，例如1和9μg之间，或2和8μg之间或者合适地3和7μg之间或4 和μg之间，或5μg的3D-MPL。
在其它实施方案中，脂多糖可以是β(1-6)葡糖胺二糖，如记载于美国专 利No.6,005,099和EP专利No.0729473B1。基于这些参考文献的教导，本领 域技术人员会容易地能够生成各种脂多糖，诸如3D-MPL。尽管如此，通过 提及而将每篇这些参考文献收入本文。在前述免疫刺激物(其在结构上与LPS 或MPL或3D-MPL类似)外，作为上述MPL结构的亚部分的酰化单糖和二糖 衍生物也是合适的佐剂。在其它实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物， 其中一些被描述为TLR-4激动剂，并且包括但不限于：OM174(2-脱氧-6-o-[2- 脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰基氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖 基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯)(WO 95/14026)；OM294DP(3S，9R)-3--[(R)-十二烷酰基氧基四癸酰基氨基]-4-氧 -5-氮-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-二(磷酸二氢酯)(WO 99/64301和WO00/0462)；和OM197MP-AcDP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰基 氧基四-癸酰基氨基]-4-氧-5-氮-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1- 磷酸二氢酯10-(6-氨基己酸酯)(WO01/46127)。
可以使用的其它TLR4配体是烃基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)诸如那些在 WO98/50399或美国专利No.6,303,347(还披露了用于制备AGP的方法)中 披露的，合适地，RC527或RC529或AGP的药学可接受盐，如美国专利No. 6,764,840中所披露的。一些AGP是TLR4激动剂，而一些是TLR4拮抗剂。认 为两者作为佐剂都是有用的。
能够经由TLR-4引起信号传导应答(Sabroe等，JI2003p1630-5)的其它合 适的TLR-4配体是例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物，或其片段， 特别是LPS的非毒性衍生物(诸如3D-MPL)。其它合适的TLR激动剂是：热 休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性剂蛋白A、乙酰透明质 酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纤连蛋白片段、血纤蛋白原肽和b-防卫素-2、 和胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP60、70或90。 其它合适的TLR-4配体如记载于WO2003/011223和WO2003/099195，诸如 WO2003/011223的第4页-第5页上或WO2003/099195的第3页-第4页上披露的 化合物I、化合物II和化合物III和特别是WO2003/011223中披露为ER803022、 ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、 ER804442、ER804680、和ER804764的那些化合物。例如，一种合适的TLR-4 配体是ER804057。
别的TLR激动剂作为佐剂也是有用的。术语“TLR激动剂”指能够经由 TLR信号传导途径引起信号传导应答(或是作为直接的配体或是间接地经由 生成内源或外源配体)的药剂。可以使用此类天然的或合成的TLR激动剂作 为备选的或别的佐剂。Kaisho和Akira，BiochimicaetBiophysicaActa 1589：1-13，2002中提供了TLR作为佐剂受体的作用的简短综述。这些潜在佐 剂包括但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。因而，在一 个实施方案中，佐剂和免疫原性组合物进一步包含选自下组的佐剂：TLR-1 激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6 激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂、或其组合。
在本发明的一个实施方案中，使用能够经由TLR-1引起信号传导应答的 TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂选自： 三酰化脂肽(LP)；酚可溶性调控蛋白(modulin)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)LP；三盐酸S-(2，3-二(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰基 -(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH(Pam3Cys)LP(其模拟细菌脂蛋白的乙酰化氨 基端)和来自布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)的OspALP。
在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-2引起信号传导应答的 TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂是下 列一项或多项：来自结核分枝杆菌、布氏疏螺旋体或苍白密螺旋体(Tpallidum) 的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的物种的肽聚糖；脂磷壁酸质类、甘露糖醛酸类、奈瑟氏球菌(Neisseria) 孔蛋白、细菌菌毛、耶尔森氏菌(Yersina)毒力因子、CMV病毒体、麻疹血细 胞凝集素、和来自酵母的酵母聚糖。
在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-3引起信号传导应答的 TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂是双 链RNA(dsRNA)、或聚肌苷酸胞苷酸(PolyIC)，一种与病毒感染有关的分子 核酸样式。
在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-5引起信号传导应答的 TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂是细 菌鞭毛蛋白。
在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-6引起信号传导应答的 TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂是分 枝杆菌脂蛋白、二酰化LP、和酚可溶性调控蛋白。别的TLR6激动剂记载于 WO2003/043572。
在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-7引起信号传导应答的 TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂是单 链RNA(ssRNA)、洛索立宾(loxoribine)、在位置N7和C8的鸟苷类似物、或咪 唑喹啉化合物、或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特 (imiquimod)。别的TLR7激动剂记载于WO2002/085905。
在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-8引起信号传导应答的 TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂是单 链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德(resiquimod， R848)；瑞喹莫德也能够被TLR-7识别。可以使用的其它TLR-8激动剂包括记 载于WO2004/071459的。
在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-9引起信号传导应答的 TLR激动剂。在一个实施方案中，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR 激动剂是HSP90。或者，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂是 细菌或病毒DNA、含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，特别是称为CpG基序 的序列背景。含有CpG的寡核苷酸主要诱导Th1应答。此类寡核苷酸是公知 的，并且记载于例如WO96/02555、WO99/33488和美国专利No.6,008,200 和5,856,462。合适地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。在本发明的免疫原性组 合物中使用的合适的寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任选地，其含有由至 少三个，合适地，至少六个或更多个核苷酸分开的两个或更多个二核苷酸 CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后面跟着鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG 寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个具体的实施方案中，寡核苷酸中的核苷 酸间键是二硫代磷酸酯，或者合适的是硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其它 核苷酸间键在本发明的范围内。还包括在本发明的范围内的是具有混合的核 苷酸间连接的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方 法记载于美国专利No.5,666,153、5,278,302和WO95/26204。
可以在具有PreF抗原的免疫原性组合物中使用(例如单独地或者与 3D-MPL或本文所描述的其它佐剂组合地)的其它佐剂是皂苷类，诸如QS21。
皂苷类参见：Lacaille-Dubois，M和WagnerH.(1996.Areviewofthe biologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicine第2卷第 363页-第386页)。皂苷类是植物和海洋动物王国中广泛分布的类固醇或三萜 糖苷。皂苷类记录用于在水中形成胶体溶液(其在摇动时起泡沫)及用于沉 淀胆固醇。当皂苷类接近细胞膜时，它们在膜上产生引起膜爆裂的孔样结构。 红细胞溶血是此现象的一个例子，其是某些但不是所有皂苷类的特性。
已知皂苷类为供系统施用的疫苗中的佐剂。本领域中已经广泛研究了各 种皂苷的佐剂和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，见上文)。例如，Quil A(衍生自南美乔木皂皮树(QuillajaSaponariaMolina)的树皮)及其级分记载 于US5,057,540和“Saponinsasvaccineadjuvants”，Kensil，C.R.，CritRevTher DrugCarrierSyst，1996，12(1-2)：1-55；及EP0362279B1。包含QuilA级分的 颗粒结构(称作免疫刺激性复合物(ISCOMS))是溶血的，并且已经在疫苗 的制造中使用(Morein，B.，EP0109942B1；WO96/11711；WO96/33739)。溶 血性皂苷类QS21和QS17(HPLC纯化的QuilA级分)已经被描述为有力的系 统佐剂，并且其生产方法披露于美国专利No.5,057,540和EP0362279B1，通 过提及而将其收入本文。已经在系统疫苗接种研究中使用的其它皂苷类包括 衍生自其它植物物种诸如丝石竹(Gypsophila)和肥皂草(Saponaria)的 (Bomford等，Vaccine，10(9)：572-577，1992)。
QS21是自皂皮树树皮衍生的Hplc纯化的非毒性级分。美国专利No. 5,057,540中披露了用于生成QS21的方法。含有QS21的非反应原性佐剂配制 剂记载于WO96/33739。通过提及而将前述参考文献收入本文。可以以每人 剂量的免疫原性组合物1和50μg之间的量使用所述免疫学活性皂苷诸如 QS21。有利地，以约25μg，例如20-30μg之间，合适地，21-29μg之间或22-28μg 之间或23-27μg之间或24-26μg之间，或25μg的水平使用QS21。在另一个实施 方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μg，例如5和15μg之间，合适 地6-14μg之间，例如7-13μg之间或8-12μg之间或9-11μg之间，或10μg的水平 的QS21。在又一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约5μg，例 如1-9μg之间，或2-8μg之间或者合适地3-7μg之间或4-6μg之间，或5μg的 QS21。已经显示了包含QS21和胆固醇的此类配制剂在与抗原一起配制时是 成功的Th1刺激性佐剂。如此，例如，可以在具有佐剂的免疫原性组合物中 有利地采用PreF多肽，所述佐剂包含QS21和胆固醇的组合。
任选地，佐剂还可以包括矿物盐诸如铝或钙盐，特别是氢氧化铝、磷酸 铝和磷酸钙。例如，含有与铝盐(例如氢氧化铝或“明矾”)组合的3D-MPL 的佐剂适合于在含有PreF抗原的免疫原性组合物中配制用于对人受试者施 用。
另一类适合于在具有PreF抗原的配制剂中使用的Th1偏爱性佐剂包括基 于OMP的免疫刺激性组合物。基于OMP的免疫刺激性组合物作为粘膜佐剂 例如用于鼻内施用是特别合适的。基于OMP的免疫刺激性组合物是一类来自 革兰氏阴性细菌诸如但不限于奈瑟氏球菌物种的外膜蛋白(OMP，包括一些 孔蛋白)的制备物(参见例如Lowell等，J.Exp.Med.167：658，1988；Lowell等， Science240：800，1988；Lynch等，Biophys.J.45：104，1984；Lowell，于“New GenerationVaccines”第2版，MarcelDekker，Inc.，NewYork，Basil，HongKong， 第193页，1997；美国专利No.5,726,292；美国专利No.4,707,543)，其作为载 体或者在免疫原诸如细菌或病毒抗原的组合物中是有用的。一些基于OMP 的免疫刺激性组合物可以称为“蛋白体”，其是疏水性的，并且供人使用是 安全的。蛋白体具有自动装配成约20nm至约800nm的小囊泡或小囊泡样OMP 簇的能力，及非共价地与蛋白质抗原(Ag)，特别是具有疏水性模块的抗原合 并、协调、结合(例如静电地或疏水地)、或以其它方式协作的能力。产生 处于小囊泡或小囊泡样形式的外膜蛋白成分(包括一种或多种OMP的多分子 膜性结构或熔球样OMP组合物)的任何制备方法包括在蛋白体的定义内。可 以制备蛋白体，例如如本领域中所描述的(参见例如美国专利No.5,726,292 或美国专利No.5,985,284)。蛋白体还可以含有源于用于生成OMP孔蛋白的 细菌(例如奈瑟氏球菌物种)的内源脂多糖或脂寡糖(分别为LPS或LOS)， 其一般会小于2％的总OMP制备物。
蛋白体主要由通过去污剂维持在溶液中的来自脑膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseriamenigitidis)的化学提取外膜蛋白(OMP)(主要为孔蛋白A和B以及4 类OMP)组成(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal，Oral，orInjectable Vaccines.于：LevineMM，WoodrowGC，KaperJB，CobonGS编，New GenerationVaccines.NewYork：MarcelDekker，Inc.1997；193-206)。蛋白体可 以与多种抗原诸如自病毒来源衍生的纯化的或重组的蛋白质(包括本文所公 开的PreF多肽)(例如通过渗滤或传统的透析方法得到)一起配制。逐渐除 去去污剂容许直径约100-200nm的颗粒疏水性复合物的形成(LowellGH. ProteosomesforImprovedNasal，Oral，orInjectableVaccines.于：LevineMM， WoodrowGC，KaperJB，CobonGS编，NewGenerationVaccines.NewYork： MarcelDekker，Inc.1997；193-206)。
如本文中所使用的，“蛋白体：LPS或Protollin”指与至少一类脂多糖混合 (例如通过外源添加)以提供OMP-LPS组合物(其能发挥免疫刺激性组合物 的功能)的蛋白体制备物。如此，OMP-LPS组合物可以由Protollin基本成分 之两种构成，其包括(1)自革兰氏阴性细菌诸如脑膜炎奈瑟氏球菌制备的蛋白 体(例如Projuvant)的外膜蛋白制备物，和(2)一种或多种脂糖的制备物。脂 寡糖可以是内源的(例如与OMP蛋白体制备物天然包含在一起)，可以与来 自外源制备的脂寡糖(例如自与OMP制备物不同的培养物或微生物制备)的 OMP制备物混合或组合，或者可以是其组合。此类外源添加的LPS可以来自 制备OMP制备物的相同革兰氏阴性细菌或者来自不同革兰氏阴性细菌。还应 当理解，任选地，Protollin包含脂质、糖脂、糖蛋白、小分子等，及其组合。 可以制备Protollin，例如如记载于美国专利申请公开文本No.2003/0044425 的。
也可以在具有PreF抗原的组合物中使用不同佐剂诸如上文所提及的佐 剂的组合。例如，如已经记录的，可以将QS21与3D-MPL配制在一起。QS21∶ 3D-MPL的比率通常会是大约1∶10至10∶1；诸如1∶5至5∶1，和经常基本上为1∶1。 典型地，比率在2.5∶1至1∶13D-MPL∶QS21的范围中。另一种组合佐剂配制剂 包含3D-MPL和铝盐，诸如氢氧化铝。在组合配制时，此组合能增强抗原特 异性Th1免疫应答。
在一些例子中，佐剂配制剂包含水包油乳剂，或矿物盐诸如钙或铝盐， 例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝。
水包油乳剂的一个例子在水性载体中包含可代谢油，诸如鲨烯、母育酚 诸如生育酚(例如α-生育酚)，和表面活性剂诸如Polysorbate80或Tween80， 并且不含任何别的免疫刺激物，特别是它不含非毒性脂质A衍生物(诸如 3D-MPL)或皂苷(诸如QS21)。水性载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水。另 外，水包油乳剂可以含有Span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种疫苗组合物，其包含抗原或 抗原组合物和佐剂组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳剂和任选地，一种 或多种别的免疫刺激物，其中所述水包油乳剂包含0.5-10mg可代谢油(合适 的是鲨烯)、0.5-11mg母育酚(合适的是生育酚，诸如α-生育酚)和0.4-4mg 乳化剂。
在一个具体的实施方案中，佐剂配制剂包含以乳剂诸如水包油乳剂形式 制备的3D-MPL。在一些情况中，乳剂具有直径小于0.2μm的小颗粒大小，如 WO94/21292中所披露的。例如，3D-MPL颗粒可以小得足以无菌过滤流过 0.22微米膜(如记载于欧洲专利号0689454的)。或者，可以在脂质体配制剂 中制备3D-MPL。任选地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐剂还包含别的免 疫刺激性成分。
例如，在将具有PreF多肽抗原的免疫原性组合物配制用于对婴儿施用 时，佐剂的剂量确定为在婴儿受试者中是有效且相对非反应原性的。一般而 言，婴儿配制剂中的佐剂剂量低于设计用于对成人(例如年龄为65岁或更年 长的成人)施用的配制剂中使用的剂量。例如，3D-MPL的量通常在每剂 1μg-200μg，诸如10-100μg，或10μg-50μg的范围中。婴儿剂量通常在此范围 (例如约1μg至约50μg，诸如约2μg、或约5μg、或约10μg至约25μg、或约50μg) 的下端。典型地，在配制剂中使用QS21的情况中，范围是相当的(并且依照 上文所指明的比率)。对于成人和老年人群体，配制剂通常包含比婴儿配制 剂中通常找到的佐剂成分更多的佐剂成分。在使用水包油乳剂的特定配制剂 中，此类乳剂可以包含别的成分，例如诸如胆固醇、鲨烯、α-生育酚、和/ 或去污剂，诸如Tween80或Span85。在例示性配制剂中，此类成分可以以下 列量存在：约1-50mg胆固醇、2至10％鲨烯、2至10％α-生育酚和0.3至3％ Tween80。典型地，鲨烯：α-生育酚的比率等于或小于1，因为这提供较稳定 的乳剂。在一些情况中，配制剂还可以含有稳定剂。在存在明矾(例如与 3D-MPL组合)的情况中，量通常在每剂约100μg和1mg之间，诸如约100μg 或约200μg至约750μg，诸如约500μg。
免疫原性组合物通常含有免疫保护数量(或其分数剂量)的抗原，并且 可以通过常规技术来制备。免疫原性组合物(包括用于对人受试者施用的免 疫原性组合物)的制备一般记载于PharmaceuticalBiotechnology，第61卷 VaccineDesign-thesubunitandadjuvantapproach，Powell和Newman编，Plenurn Press，1995.NewTrendsandDevelopmentsinVaccines，Voller等编，University ParkPress，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。例如，Fullerton，美国专利 4,235,877描述了脂质体内的包囊。例如，Likhite，美国专利4,372,945和Armor 等，美国专利4,474,757披露了蛋白质与大分子的偶联。
典型地，每剂免疫原性组合物中的蛋白质量选择为在典型的受试者中诱 导免疫保护性应答而没有显著的、不利的副作用的量。在此语境中的免疫保 护性的并不必然意味着针对感染的完全保护的；它意味着提供保护免于症状 或疾病，尤其是与病毒有关的严重疾病。抗原量可以随哪种特定的免疫原被 采用而变化。一般而言，预期每个人剂量会包含1-1000μg的蛋白质，诸如约 1μg至约100μg，例如约1μg至约50μg，诸如约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、 约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约40μg、或约50μg。基于受试者群体(例 如婴儿或老年人)来选择免疫原性组合物中利用的量。可以通过牵涉在受试 者中观察抗体滴度和其它应答的标准研究来确定特定组合物的最佳量。初始 疫苗接种后，受试者可以在约4周中接受加强免疫。
应当注意到，不管选定的佐剂，最终配制剂中的浓度计算为在靶标群体 中是安全且有效的。例如，有利地对婴儿(例如，出生和1岁，诸如0和6个 月之间的婴儿，在初始剂量的年龄时)施用用于在人中引发针对RSV的免疫 应答的免疫原性组合物。也有利地对老年人施用用于引发针对RSV的免疫应 答的免疫原性组合物(例如单独地或与COPD有关的其它病原体的抗原组合 地)。应当领会的是，佐剂的选择在这些不同应用中可以是不同的，并且本 领域技术人员可以凭经验确定每种情况的最佳佐剂和浓度。
在某些实施方案中，免疫原性组合物是减轻或预防RSV感染的疫苗。在 一些实施方案中，免疫原性组合物是RSV感染后减轻或预防病理应答的疫 苗。任选地，将含有PreF抗原的免疫原性组合物与不同于RSV的病原性生物 体的至少一种别的抗原一起配制。例如，病原性生物体可以是呼吸道病原体 (诸如引起呼吸道感染的病毒或细菌)。在某些情况中，免疫原性组合物含 有自与RSV不同的病原性病毒诸如引起呼吸道感染诸如流感或副流感的病 毒衍生的抗原。在其它实施方案中，选择别的抗原来便于施用或减少保护受 试者免于多种感染性生物体所需要的接种数目。例如，抗原可以衍生自下列 任何一项或多项：流感、乙肝、白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血菌(Hemophilus influenza)、脊髓灰质炎病毒、链球菌属(Streptococcus)或肺炎球菌属 (Pneumococcus)等。
因而，PreF抗原或编码它们的核酸在制备用于处理(或是之后治疗性地 或是之前预防性地)暴露于RSV或RSV感染的药物中的用途也是本公开内容 的特征。同样地，用于在受试者中引发针对RSV的免疫应答的方法是本公开 内容的特征。此类方法包括对受试者诸如人受试者施用免疫学有效量的包含 PreF抗原的组合物。通常，组合物包含引发Th1偏爱性免疫应答的佐剂。对 组合物进行配制以引发对RSV特异性的免疫应答，而不在接触RSV后增强病 毒疾病。也就是说，对组合物进行配制，并且该组合物产生Th1偏爱性免疫 应答，其减轻或预防RSV感染和/或在RSV感染后减轻或预防病理应答。虽然 可以通过多种不同路径来施用组合物，但是最通常，通过肌内或鼻内施用路 径来投递免疫原性组合物。
免疫原性组合物通常含有免疫保护数量(或其分数剂量)的抗原，并且 可以通过常规技术来制备。免疫原性组合物(包括用于对人受试者施用的免 疫原性组合物)的制备一般记载于PharmaceuticalBiotechnology，第61卷 VaccineDesign-thesubunitandadjuvantapproach，Powell和Newman编，Plenurn Press，1995.NewTrendsandDevelopmentsinVaccines，Voller等编， UniversityParkPress，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。例如，Fullerton，美 国专利4,235,877描述了脂质体内的包囊。例如，Likhite，美国专利4,372,945 和Armor等，美国专利4,474,757披露了蛋白质与大分子的偶联。
典型地，每剂免疫原性组合物中的蛋白质量选择为在典型的受试者中诱 导免疫保护性应答而没有显著的、不利的副作用的量。在此语境中的免疫保 护性的并不必然意味着针对感染的完全保护的；它意味着保护免于症状或疾 病，尤其是与病毒有关的严重疾病。抗原量可以随哪种特定的免疫原被采用 而变化。一般而言，预期每个人剂量会包含1-1000μg的蛋白质，诸如约1μg 至约100μg，例如约1μg至约50μg，诸如约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、约 15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约40μg、或约50μg。基于受试者群体(例 如婴儿或老年人)来选择免疫原性组合物中利用的量。可以通过牵涉在受试 者中观察抗体滴度和其它应答的标准研究来确定特定组合物的最佳量。初始 疫苗接种后，受试者可以在约4-12周中接受加强免疫。例如，在对婴儿受试 者施用含有PreF抗原的免疫原性组合物时，可以施用初始接种和后续接种以 与此期间施用的其它疫苗一致。
提供了以下实施例来例示某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不 应解释为将本发明限制于所描述的具体的特征或实施方案。
实施例
μg实施例1：例示性PreF抗原
与天然的RSVF蛋白相比，对PreF抗原进行修饰以稳定化处于其融合前 构象的蛋白质，这基于如下预测来进行，即针对F的融合前构象所产生的免 疫应答会优先包括会阻止结合、构象转变和/或牵涉膜融合的其它事件的抗 体，由此提高保护性应答的功效。
图1A和图1B示意性显示了RSVF0和例示性PreF重组抗原的特征。图1A 是RSVF0蛋白的表示。F0是由574个氨基酸组成的前蛋白。翻译后对F0前蛋 白进行蛋白水解加工和糖基化。信号肽(其随后被信号肽酶除去)将F0前蛋 白的翻译靶向至内质网(RE)。然后在多个位点(通过三角形表示)对RE中的 新生肽进行N糖基化。弗林蛋白酶对F0的切割生成F2和F1肽域，它们被折叠 并装配在一起，作为F2-F1异二聚物的三聚体(即3倍F2-F1)。在其天然状态， F蛋白通过C端区域中的跨膜螺旋而锚定至膜。F0多肽的别的特征包括15个半 胱氨酸残基、4个经表征的中和性表位、2个卷曲螺旋区、和脂质化基序。图 1B显示了例示性PreF抗原的特征。为了构建PreF抗原，修饰F0多肽以稳定F 蛋白的融合前构象，由此保留F蛋白的优势免疫原性表位，如与宿主细胞结 合和融合前由RSV病毒呈现的。相对于F0多肽，将下列稳定化突变引入PreF 抗原中。第一，在F0多肽的胞外域的C端末端放置稳定化卷曲螺旋域，替换 F0的膜锚定域。第二，除去pep27肽(位于天然蛋白质中的F2和F1域之间)。 第三，消除两个弗林蛋白酶基序。在备选的实施方案(称作PreF_V1和 PreF_V2)中，将RSVG蛋白的免疫学活性部分(例如氨基酸149-229)添加 至C端域。
实施例2：自CHO细胞生成和纯化PreF重组蛋白
将编码例示性PreF抗原的重组多核苷酸序列导入宿主CHO细胞中以生 成PreF抗原。将包含所导入多核苷酸序列的瞬时转染的宿主细胞或扩充的稳 定群体在培养基中并在适合于生长的条件下以对于想要目的可接受的规模 培养(例如，如一般记载于Freshney(1994)CultureofAnimalCells，aManualofBasicTechnique，第三版，Wiley-Liss，NewYork及其中引用的参考文献)。典 型地，将细胞在无血清培养基中在摇瓶中于37℃在5％CO2的情况中培养， 并以2-3天的时间间隔传代，或者在生物反应器中于29℃在以20％维持的pO2 的情况中培养。
为了回收重组PreF抗原，离心细胞培养物，并于80℃贮存细胞培养上清 液，直至进一步使用。为了进一步分析，用纯化水将2升等分试样的细胞培 养上清液稀释2x，并用NaOH调节至pH9.5。以14ml/分钟的速率将上清液加 载至在20mM哌嗪pH9.5中平衡的QSepharoseFF离子交换柱(60ml，11.3cm) 上。用起始缓冲液清洗该柱后，用0至0.5MNaCl的NaCl梯度在20个柱体积中 实施洗脱(级分大小10ml)。在SDSPAGE凝胶上通过银染色和Western印迹 来分析级分。然后合并含有实质性PreF蛋白的级分，之后进一步加工。
使用具有PellliconXLPESBiomax100(MWCO10,000Da)膜盒的来自 Millipore的工作台规模TFF系统将Q步骤的合并洗脱(约130ml)进行缓冲液 交换，进入10mM磷酸盐，pH7.0中。所得的材料具有7.0的pH和1.8mS/cm的 电导率。在用10mMPO4(Na)缓冲液pH7.0平衡的10ml羟磷灰石II型(HATII) 凝胶(XK16，高度＝5cm)上以5ml/分钟加载100ml此样品。用起始缓冲液 清洗该柱后，用10mM至200mMPO4(Na)pH7.0的梯度在20个柱体积中实施 洗脱。在SDSPAGE上用银染色和考马斯蓝再次分析级分，并合并阳性级分。
亲和层析后，浓缩合并的级分，并使用Vivaspin20浓缩器单元，10,000Da MWCO将其缓冲液交换入DPBS(pH约7.4)中。最终产物是约13ml。蛋白质浓 度是195μg/ml，其通过Lowry测定法来评估。纯度大于95％。将此纯化的PreF 抗原制备物进行滤器除菌，并在使用前于-20℃贮存。
实施例3：CHO细胞中生成的PreF重组蛋白的表征
通过不对称场流分级(AFF-MALS)来表征CHO细胞中生成的PreF重组蛋 白，并与包含RSVF和G蛋白构件的嵌合抗原进行比较。AFF-MALS容许蛋 白质种类在具有最低限度基质相互作用的液体流动中依照其分子大小分开， 并通过多角度光散射来进一步分析以测定精确的分子量。图2A显示了，发现 超过65％的纯化的FG材料在其最终的PBS缓冲液中为高分子量寡聚物 (1000-100000KDa)，而3％仍然处于单体形式。
图2B显示了，纯化的PreF蛋白以其三聚体形式在PBS缓冲液中以73％的 比例折叠。发现10％的材料为1000至20000KDa寡聚物。这些结果指明，CHO 细胞中表达的重组PreF蛋白折叠为三聚体，如对天然状态所预测的。
出于下列双重目的，还将纯化的PreF蛋白用戊二醛交联：确认蛋白质在 磷酸盐缓冲液溶液中的可溶性质及生成聚集体来与FG蛋白进行比较性体内 评估(参见下文的实施例7)。已知戊二醛交联用于提供对蛋白质四级结构的 良好评估，并且记载于(Biochemistry，36：10230-10239(1997)；Eur.J.Biochem.， 271：4284-4292(2004))。
将蛋白质与1％、2％和5％的戊二醛交联剂于4℃一起温育4小时，并通过 添加NaBH4来阻断反应。通过在PBS缓冲液中进行柱脱盐来除去过量的戊二 醛。通过在280nm的吸光度来量化所得的蛋白质，并通过在变性和还原性条 件中的SDSPAGE来评估。大部分纯化的重组PreF测定为在PBS溶液中作为三 聚体迁移。需要将温育温度提高至23℃来将大部分三聚体蛋白质转变成高分 质量聚集体，如通过SDSPAGE所确认的。
实施例4：由PreF抗原进行的体外中和抑制
通过ELISA对自志愿者获得的人血清筛选针对RSVA的反应性，并基于 先前对每份血清样品建立的RSV中和潜力滴定以相关稀释度在中和抑制(NI) 测定法中使用。简言之，将血清与在具有50％199-H培养基(其具有0.5％FBS、 2mM谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素，均为Invitrogen)的DMEM中的25μg/ml 浓度的抑制剂蛋白质(PreF或基本上与美国专利No.5,194,595中所披露的嵌 合FG对应的对照蛋白质，称作RixFG)混合，并于37℃在转轮上温育1.5至2 小时。将20μl连续稀释的血清和蛋白质在圆底96孔板中与为每份血清样品优 化抑制范围而滴定的RSVA混合。将所得的混合物于33℃在5％CO2下温育20 分钟以维持pH。
然后将血清-抑制剂-病毒混合物放置入先前经Vero细胞接种的平底96孔 板中，并于33℃温育2小时，之后添加160μl培养基。将平板于33℃在5％CO2的情况中再温育5-6天，直至进行免疫荧光测定法来检测NI滴度。用磷酸盐 缓冲盐水(PBS)中的1％低聚甲醛固定1小时后，用2％奶/PBS和封闭缓冲液来 封闭平板。在不漂洗的情况中将山羊抗RSV抗体(BiodesignInternation；1∶400) 添加至每孔，并于室温(RT)温育2小时。用PBS清洗样品2x，并将封闭缓冲液 中的抗山羊IgG-FITC(Sigma；1∶400)添加至各孔。将平板于RT再温育2小时， 并如上文那样清洗2x，之后读数。当检测出≥1个荧光合胞体时，认为孔呈 阳性。使用Spearman-Karber(SK)方法来实施50％组织培养物感染剂量 (TCID50)计算，并如下计算NI的百分比：[(0μg/ml抑制剂的中和滴度- 25μg/ml抑制剂的中和滴度)/0μg/ml抑制剂的中和滴度]X100。图3中显示的 例示性结果指明PreF在NI中在16/21名所测试供体中优于FG。
实施例5：PreF抗原是免疫原性的
为了证明PreF抗原的免疫原性，以两周时间间隔用preF(6.5、3.1、0.63、 0.13、和0.025μg/ml)和1/20人剂量的含有3DMPL和QS21的Th1佐剂(“AS01E”) 或preF(1、0.2和0.04μg/ml)和1/10人剂量的含有3DMPL和明矾的Th1佐剂 (“AS04C”)IM免疫小鼠两次，并在3周后收集血清。
通过ELISA依照标准规程对合并的血清样品测定抗原特异性IgG抗体滴 度。简言之，用纯化的、灭活的RSVA、RSVB和同源preF蛋白包被96孔板， 并于4℃温育过夜。与200ng/ml起始浓度的纯化的小鼠IgG(Sigma，ON)一起 将血清样品在封闭缓冲液中连续稀释，以1∶50的起始浓度开始，并于室温温 育2小时。用偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Sigma，ON)检测结合 的抗体。使用3，3A，5，5A-四甲基联苯胺(TMB，BDOptEIATM，BDBiosciences， ON)作为HRP的底物。将50μl1MH28O4添加至每孔以停止反应。用Molecular Devices微板读板仪(MolecularDevices，USA)于450nm检测每孔的吸光度值。
图4A和4B中详述的代表性结果显示了，在用PreF抗原免疫后，针对RSV A和RSVB两者均引发强烈的滴度。
实施例6：PreF引发中和性抗体
在如上文实施例5中所描述的那样免疫的小鼠的血清样品中评估中和性 抗体的存在和量。将来自经免疫动物的合并血清自1∶8的起始稀释度在RSV 培养基中在96孔板(20μl/孔)中连续稀释。对照孔仅含有RSV培养基，或者 1∶50的山羊抗RSV抗体(Biodesigninternational)。将500-1000个感染剂量的代 表性RSVA或B毒株添加至孔，并将平板于33℃，5％CO2温育20分钟，之后 将混合物转移至先前用1x105个细胞/mLVero细胞接种的96孔平底板。将细胞 于33℃，5％CO2温育约2小时，并再喂养，之后在相同温度温育5-6天。取出 上清液；用PBS清洗平板，并用PBS中的1％低聚甲醛将粘附细胞固定1小时， 接着进行间接免疫荧光(IFA)，其使用山羊抗RSV一抗和抗山羊IgG-FITC来检 测。
图5A和图5B中显示的代表性结果分别证明了，在用preF免疫的动物的血 清中检测出显著的针对两种RSV毒株的中和性抗体。
实施例7：PreF针对RSV攻击提供保护
如上文所描述的那样以两周时间间隔IM免疫小鼠两次，并在第二次注射 RSVA后3周进行攻击。通过测量攻击后肺中存在的病毒来评估针对RSV的保 护。简言之，安乐死后在无菌条件下取出来自经免疫动物的肺，并在15ml 管中使用2个体积的10ml/肺在RSV培养基中清洗。然后对肺称重，并在RSV 培养基中用自动化Potter匀浆器(Fisher，NepeanON)个别均浆化，并以2655xg 于4℃离心2分钟。通过在96孔板中先前接种的Vero细胞(ATCC#CCL-81)单层 上进行连续稀释(8次重复，以1∶10开始)来滴定上清液中存在的病毒，并温 育6天。通过在1％低聚甲醛/PBSpH7.2中固定后用山羊抗RSV一抗和经FITC 标记的抗山羊IgG二抗进行的间接IFA来检测RSV。
图6A和图6B中显示的代表性结果证明，在存在佐剂的情况中给予时等 于或高于0.04μg的剂量引发针对RSV的强烈保护。
实施例8：PreF在攻击后不诱导肺嗜曙红细胞募集
为了评估PreF抗原在免疫和随后的攻击后激起疾病加重的潜力，每次用 (a)10μg经戊二醛处理的preF，(b)10μgpreF或(c)10μg没有佐剂的FG免疫小 鼠组(5只小鼠/组)两次。加强免疫后3周用RSVA攻击小鼠，并在攻击后4 天实施支气管肺泡灌洗(BAL)。对每只小鼠的BAL中的总白细胞浸润计数以 及基于巨噬细胞/单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和淋巴细胞的细胞形 态学进行区别计数(300个细胞)。
将总细胞数目乘以每只动物的嗜曙红细胞的区别百分比。所表示的是每 组的几何均值，置信限度95％。图7中显示的代表性结果证明，嗜曙红细胞 在用preF免疫和攻击后并不募集至肺。此外，这些结果提示，与preF的有意 聚集形式(戊二醛处理)或FG抗原(天然聚集的)相比，PreF抗原的可溶性 质不偏爱嗜曙红细胞。
序列表
SEQIDNO：1
编码RSV参照融合蛋白的核苷酸序列
毒株A2GenBank登录号U50362
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SEQIDNO：2
RSV参照F蛋白前体F0的氨基酸序列
毒株A2GenBank登录号AAB86664
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGT
DAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGV
GSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISN
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MSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV
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KTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA
FIRKSDELLHNVNAGKSTINIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQIDNO：3
编码RSV参照G蛋白的核苷酸序列
毒株Long
Atgtccaaaaacaaggaccaacgcaccgctaagacactagaaaagacctgggacactctcaatcatttatta
ttcatatcatcgggcttatataagttaaatcttaaatctatagcacaaatcacattatccattctggcaatg
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ttccactcaacctcctccgaaggcaatctaagcccttctcaagtctccacaacatccgagcacccatcacaa
ccctcatctccacccaacacaacacgccagtag
SEQIDNO：4
RSV参照G蛋白的氨基酸序列
MSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLT
TAIIQDATSQIKNTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPS
KPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLK
PQTTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQ
PSSPPNTTRQ
SeqIDNO：5
针对CHO优化的PreF类似物的核苷酸序列
aagcttgccaccatggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctg
tgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctac
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gagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggcctgataatctaga
SEQIDNO：6
PreF类似物的氨基酸序列
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGT
DAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLST
NKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTP
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SPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPK
YDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQ
EGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEI
ARIKKLIGEA
SeqIDNO：7
针对CHO优化的编码PreF_V1的核苷酸序列_
aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctg
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ctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaag
accttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtac
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SeqIDNO：8
用于CHO的PreF_V1肽
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGT
DAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLS
TNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTT
PVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLH
TSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNP
KYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNK
QEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENE
IARIKKLIGEAGGSGGSGGSKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTT
KPTKKPTFKTTKKDHKPOTTKPKEVPTTK
SeqIDNO：9
用于CHO的PreF_V2肽
aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctg
tgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctac
ctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaag
tgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaa
ctccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggc
tccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagc
gccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctg
gatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatc
gagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgcc
ggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaacgacatgcct
atcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatg
agcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgc
tggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggacc
gaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcag
tccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgac
atcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctcc
ctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaag
accttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtac
tacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctg
gtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttc
atccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccac
atcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggctggcggcaagcagcggcagaacaagcct
cctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaac
cctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcctacc
aagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaacc
accaagcaccaccaccatcaccactgataatcta
SeqIDNO：10
用于CHO的PreF_V2肽
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGT
DAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLS
TNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTT
PVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLH
TSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNP
KYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNK
QEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENE
IARIKKLIGEAGGKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPT
FKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTK
SEQIDNO：11
例示性卷曲螺旋(异亮氨酸拉链)
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA
SEQIDNO：12
PreF抗原多核苷酸CHO2
atggagctgcccatcctgaagaccaacgccatcaccaccatcctcgccgccgtgaccctgtgcttcgccagc
agccagaacatcacggaggagttctaccagagcacgtgcagcgccgtgagcaagggctacctgagcgcgctg
cgcacgggctggtacacgagcgtgatcacgatcgagctgagcaacatcaaggagaacaagtgcaacggcacg
gacgcgaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgcggtgacggagctgcagctgctg
atgcagagcacgccggcgacgaacaacaagttcctcggcttcctgctgggcgtgggcagcgcgatcgcgagc
ggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagtccgcgctgctgagcacg
aacaaggcggtcgtgagcctgagcaacggcgtgagcgtgctgacgagcaaggtgctcgacctgaagaactac
atcgacaagcagctgctgccgatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagaccgtgatcgag
ttccagcagaagaacaaccgcctgctggagatcacgcgggagttctccgtgaacgcaggcgtgacgacgccc
gtgtctacgtacatgctgacgaacagcgagctgctcagcctgatcaacgacatgccgatcacgaacgaccag
aagaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcgccagcagagctacagcatcatgagcatcatcaaggag
gaggtgctggcatacgtggtgcagctgccgctgtacggcgtcatcgacacgccctgctggaagctgcacacg
agcccgctgtgcacgaccaacacgaaggagggcagcaacatctgcctgacgcggacggaccggggctggtac
tgcgacaacgcgggcagcgtgagcttcttcccgctcgcggagacgtgcaaggtgcagagcaaccgcgtcttc
tgcgacacgatgaacagcctgacgctgccgagcgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaacccgaag
tacgactgcaagatcatgacgagcaagaccgatgtcagcagcagcgtgatcacgagcctcggcgcgatcgtg
agctgctacggcaagacgaagtgcacggcgagcaacaagaaccgcggcatcatcaagacgttcagcaacggc
tgcgactatgtgagcaacaagggcgtggacactgtgagcgtcggcaacacgctgtactacgtgaacaagcag
gagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagccgatcatcaacttctacgacccgctcgtgttcccgagcgac
gagttcgacgcgagcatcagccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggcgttcatccgcaagagcgac
gagaagctgcacaacgtggaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatc
gcgcgcatcaagaagctgatcggcgaggcgcatcatcaccatcaccattga
SEQIDNO：13
具有内含子的PreF抗原多核苷酸
atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcc
tcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctg
cggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcacc
gacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctg
atgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctcc
ggcatcgccgtgagcaaggtacgtgtcgggacttgtgttcccctttttttaataaaaagttatatctttaat
gttatatacatatttcctgtatgtgatccatgtgcttatgactttgtttatcatgtgtttaggtgctgcacc
tggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacg
gcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtga
acaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctgg
agatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccg
agctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcaga
tcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgc
ctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaagg
agggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttct
tccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgc
cttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaaga
ccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccg
cctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtgg
acaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcg
agcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtga
acgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaaga
tcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgagg
ccggaggtcaccaccaccatcaccactga
SEQIDNO：14
合成的接头序列
GGSGGSGGS
SEQIDNO：15
弗林蛋白酶切割位点
RARR
SEQIDNO：16
弗林蛋白酶切割位点
RKRR