重组RSV抗原.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 200880127407.3 (22)申请日 2008.12.23 61/016,524 2007.12.24 US 61/056,206 2008.05.27 US C07K 19/00(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 39/155(2006.01) A61K 39/295(2006.01) A61K 9/107(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 37/04(2006.01) C07K 14/135(2006.01) C12N

2、15/45(2006.01) C12N 15/62(2006.01) (73)专利权人 葛兰素史密斯克莱生物公司 地址 比利时里克林萨斯 (72)发明人 让 - 皮埃尔鲍杜克斯 诺曼德布莱斯 帕特里克雷奥尔特 让 - 路易斯鲁尔 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 岑晓东 Diana Martn 等 .Sequence elements of the fusion peptide of human respiratory syncytial virus fusion protein required for activity.Journal of General V

3、irology .2006, 第 86 卷 (54) 发明名称 重组 RSV 抗原 (57) 摘要 本公开内容提供了重组呼吸道合胞病毒 (RSV) 抗原及其制备和使用方法， 包括用于治疗 和 / 或预防 RSV 感染的免疫原性组合物 ( 例如疫 苗 )。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2010.08.24 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/CA2008/002277 2008.12.23 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2009/079796 EN 2009.07.02 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 杨光 (19)中华人民共和国国家

4、知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书42页 序列表16页 附图9页 CN 101952321 B 2016.05.11 CN 101952321 B 1/1 页 2 1.重组呼吸道合胞病毒 (RSV) 抗原， 其包含 RSV F 蛋白多肽的没有居间弗林蛋白酶切 割位点的 F2域和 F 1域， 其中所述多肽还包含位于所述 F1域的 C 端的异源三聚化域。 2.权利要求 1 的重组 RSV 抗原， 其中所述 F2域至少包含 RSV F 蛋白多肽中与参照 F 蛋 白前体多肽 (F0)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸 26-105 对应的一部分。 3.权利要求 1 的重组 RSV

5、抗原， 其中所述 F1域至少包含 RSV F 蛋白多肽中与参照 F 蛋 白前体多肽 (F0)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸 137-516 对应的一部分。 4.权利要求 1 的重组 RSV 抗原， 其中所述 F2域包含与参照 F 蛋白前体多肽 (F0)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸 26-105 对应的 RSV F 蛋白多肽和 / 或其中所述 F1 域包含与参照 F 蛋白前 体多肽 (F0)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸 137-516 对应的 RSV F 蛋白多肽。 5.权利要求 1 的重组 RSV 抗原， 其中所述 RSV 抗原为包含 SEQ ID NO ： 6 的多肽，

6、 其中所述 RSV 抗原多肽保留了没有 F2域和 F 1域之间的居间弗林蛋白酶切割位点的特 点和有异源三聚化域的特点。 6.权利要求 1 的重组 RSV 抗原， 其进一步包含信号肽。 7.权利要求 1 的重组 RSV 抗原， 其中所述异源三聚化域包含卷曲螺旋域。 8.权利要求 7 的重组 RSV 抗原， 其中所述异源三聚化域包含异亮氨酸拉链。 9.权利要求 1 的重组 RSV 抗原， 其中所述 RSV 抗原包含至少一处选自下组的修饰 ： (i) 删除至少一个非弗林蛋白酶切割位点 ； (ii) 删除 pep27 域的一个或多个氨基酸 ； 和 (iii) 所述 F 蛋白胞外域的疏水域中替代或添加至

7、少一处亲水性氨基酸。 10.权利要求 1 的重组 RSV 抗原， 其中所述 RSV 抗原包含多肽的多聚体。 11.权利要求 10 的重组 RSV 抗原， 其中所述 RSV 抗原包含多肽的三聚体。 12.一种免疫原性组合物， 其包含权利要求1的重组RSV抗原和药学可接受载体或赋形 剂。 13.权利要求 12 的免疫原性组合物， 其中所述载体或赋形剂包含缓冲剂。 14.权利要求 12 的免疫原性组合物， 其进一步包含佐剂。 15.权利要求 14 的免疫原性组合物， 其中所述佐剂包含 3D-MPL、 QS21、 水包油乳剂、 和 铝盐或钙盐中至少一项。 16.权利要求 12 的免疫原性组合物， 其中

8、所述免疫原性组合物抑制呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染。 17.权利要求 12 的免疫原性组合物， 其进一步包含与 RSV 不同的病原性生物体的至少 一种别的抗原。 18.权利要求12的免疫原性组合物在制备激发抗呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫应答的 药物组合物中的用途。 19.权利要求18的用途， 其中所述药物组合物引发对RSV特异性的免疫应答， 而不在与 RSV 接触后增强病毒疾病。 20.权利要求 15 的免疫原性组合物， 其中所述佐剂包含 3D-MPL 和明矾。 权 利 要 求 书 CN 101952321 B 2 1/42 页 3 重组 RSV 抗原 0001 对相关申请的交叉引用 0

9、002 本申请要求 2007 年 12 月 24 日提交的美国临时申请号 61/016,524 和 2008 年 5 月 27 日提交的美国临时申请号 61/056,206 的较早提交日期的权益， 通过提及而将其公开 内容收入本文。 0003 按照 37C.F.R.1.71(E) 的版权通知 0004 本专利文件的公开内容的一部分含有受到版权保护的材料。 版权拥有人不反对任 何人拓制专利文件或专利公开内容， 就像其出现在专利商标局专利文件或记录中的那样， 但是在其它情况中保留无论什么的所有版权权利。 0005 发明背景 0006 本公开内容关注免疫学领域。更具体而言， 本公开内容涉及用于引发对

10、呼吸道合 胞病毒 (RSV) 特异性的免疫应答的组合物和方法。 0007 人呼吸道合胞病毒 (RSV) 是小于 6 个月龄的婴儿和怀孕期小于或等于 35 周的早 产儿中下呼吸道感染(LRI)的最常见的全球性原因。 RSV疾病谱包括从鼻炎(rhinitis)和 耳炎 (otitis) 至肺炎 (pneumonia) 和细支气管炎 (bronchiolitis) 的一大批呼吸症状， 后 两种疾病与相当高的发病率和死亡率有关。人是 RSV 唯一已知的贮主。自受污染的鼻分泌 物扩散病毒经由大的呼吸飞沫发生， 因此传播需要与受感染个体或受污染表面紧密接触。 RSV 能在玩具或其它物体上持续数小时， 这解

11、释了医院 RSV 感染的高比率， 特别是在儿科病 房中。 0008 估计全球每年的 RSV 感染和死亡数字分别是 6400 万和 16 万。仅在美国， 估计 RSV 每年造成 18,000 至 75,000 例住院和 90 至 1900 例死亡。在温带气候， RSV 被较好地证明 为急性 LRI( 包括细支气管炎和肺炎 ) 的每年冬季流行病的一个原因。在美国， 几乎所有儿 童到两岁时都感染过 RSV。RSV 相关 LRI 在其它方面健康的儿童中的发生率计算为生命前 两年中 37/1000 名儿童 - 年 ( 小于 6 个月龄的婴儿中 45/1000 名儿童 - 年 )， 而住院风险为 6/10

12、00 名儿童 - 年 ( 生命前 6 个月中每 1000 名儿童 - 年 )。发生率在患有心肺疾病的儿 童和早产儿中较高， 在美国这些儿童构成几乎半数的 RSV 相关医院收治。经受由 RSV 引起 的更严重的 LRI 的儿童以后具有升高的儿童哮喘发生率。这些研究表明患有严重 LRI 及其 后遗症的患者的护理花费巨大的工业化国家普遍需要 RSV 疫苗及其使用。RSV 还日益被公 认为老年人中流感样病的发病率的一个重要原因。 0009 已经尝试了多种办法来努力产生安全且有效的 RSV 疫苗， 其在健康的和有风险的 群体中产生持久的且保护性的免疫应答。然而， 迄今所评估的候选物无一证明作为疫苗用 于

13、预防 RSV 感染和 / 或减轻或预防 RSV 疾病 ( 包括下呼吸道感染 (LRI) 是安全且有效的。 0010 发明概述 0011 本公开内容关注重组呼吸道合胞病毒 (RSV) 抗原。更具体而言， 本公开内容关注 包含已经进行过修饰以稳定三聚体融合前构象的重组 F 蛋白的抗原。所公开的重组抗原展 现出卓越的免疫原性， 而且作为针对 RSV 感染和 / 或疾病提供保护的免疫原性组合物 ( 例 如疫苗 ) 的成分而被采用是特别有利的。还公开了编码重组抗原的核酸、 含有所述抗原的 说 明 书 CN 101952321 B 3 2/42 页 4 免疫原性组合物、 及用于生成和使用所述抗原的方法。

14、0012 附图简述 0013 图 1A 是突出显示 RSV F 蛋白的结构特征的示意图。图 1B 是例示性 RSV 融合前 F(PreF) 抗原的示意图。 0014 图 2 是一幅线图， 其显示了对 PreF 的不对称场流分级 (asymmetrical fieldflow fractionation， AFF-MALS) 分析的代表性结果。 0015 图 3 是一幅柱形图， 其显示了 PreF 抗原对人血清的中和抑制。 0016 图 4A 和图 4B 是柱形图， 其显示了小鼠中响应 PreF 抗原而引发的血清 IgG 滴度。 0017 图 5A 和图 5B 是柱形图， 其显示了由 PreF

15、抗原引发的对 RSV 特异性的中和性抗体 的滴度。 0018 图 6A 和图 6B 是显示在小鼠中由 RSV PreF 抗原提供的针对攻击的保护的图。 0019 图 7 是免疫和攻击后评估 BAL 白细胞的图。 0020 发明详述 0021 导言 0022 由于宿主免疫应答表现出在疾病的发病机制中起作用的实情而使开发疫苗来预 防 RSV 感染变得复杂。二十世纪 60 年代的早期研究显示了， 与未接种疫苗的对照受试者相 比， 接种用福尔马林灭活的 RSV 疫苗的儿童在随后暴露于病毒后遭受更严重的疾病。这些 早期试验导致 80的接种疫苗者住院和 2 例死亡。增强的疾病严重性已经在动物模型中 得到再

16、现， 而且认为其源自血清中和性抗体的水平不足、 缺乏局部免疫、 和 2 型辅助 T 细胞 样 (Th2) 免疫应答的诱导过量， 其伴有肺嗜酸粒细胞增多及 IL-4 和 IL-5 细胞因子的生成 增加。比较而言， 针对 RSV 感染提供保护的成功疫苗诱导 Th1 偏爱性免疫应答， 其特点在于 IL-2 和 - 干扰素 (IFN) 的生成。 0023 本公开内容关注重组呼吸道合胞病毒 (RSV) 抗原， 其解决先前在疫苗中使用 RSV 抗原遇到的问题， 而且改善抗原的免疫学特性以及制备特性。本文所公开的重组 RSV 抗原 牵涉一种融合 (F) 蛋白类似物， 其包含可溶性 F 蛋白多肽， 该可溶性

17、F 蛋白多肽已经进行过 修饰以稳定F蛋白的融合前构象， 即成熟的装配好的F蛋白在与宿主细胞膜融合前的构象。 为了清晰和简单， 这些 F 蛋白类似物称作 “PreF” 或 “PreF 抗原” 。本文所公开的 PreF 抗原 以如下未预见到的发现为基础， 即已经通过掺入异源三聚化域来修饰的可溶性 F 蛋白类似 物展现出改良的免疫原性特征， 而且在对受试者体内施用时是安全且高度保护性的。 0024 本文参照本领域中广泛接受的术语和名称来提供 RSV F 蛋白结构的详情， 并在图 1A 中示意性显示。图 1B 中提供了例示性 PreF 抗原的示意图。本领域技术人员会了解， 依 照本文所提供的教导， 可

18、以修饰任何 RSV F 蛋白来稳定融合前构象。因此， 为了便于理解指 导 PreF 抗原生成的原则， 各个结构构件会参照例示性 F 蛋白来指明， 所述例示性 F 蛋白的 多核苷酸和氨基酸序列分别在 SEQ ID NO ： 1 和 2 中提供。类似地， 在可适用的情况中， G 蛋 白抗原参照例示性 G 蛋白来描述， 所述例示性 G 蛋白的多核苷酸和氨基酸序列分别在 SEQ ID NO ： 3 和 4 中提供。 0025 参照 F 蛋白多肽的一级氨基酸序列 ( 图 1A)， 利用下列术语来描述 PreF 抗原的结 构特征。 0026 术语 F0 指全长翻译的 F 蛋白前体。F0 多肽可以细分成由称

19、作 pep27 的居间肽分 说 明 书 CN 101952321 B 4 3/42 页 5 开的 F2 域和 F1 域。成熟过程中， F0 多肽在位于 F2 和 F1 之间且在 pep27 侧翼的两个弗林 蛋白酶位点处经历蛋白水解切割。为了随后的讨论， F2 域包含 F 蛋白氨基酸 1-109 的至少 一部分， 并且多达所有， 而 F1 域的可溶性部分包含 F 蛋白氨基酸 137-526 的至少一部分， 并 且多达所有。如上文所指明的， 这些氨基酸位置 ( 和本文指明的所有随后的氨基酸位置 ) 参照例示性 F 蛋白前体多肽 (F0)SEQ ID NO ： 2 给出。 0027 融合前 F( 或

20、 “PreF” ) 抗原是一种可溶性 ( 即不是膜结合的 )F 蛋白类似物， 其包 含至少一处稳定 F 蛋白的融合前构象的修饰， 从而 RSV 抗原保留 F 蛋白的融合前构象的至 少一个免疫优势表位。可溶性 F 蛋白多肽包含 RSV F 蛋白的 F2 域和 F1 域 ( 但是不包含 RSV F 蛋白的跨膜域 )。在例示性的实施方案中， F2 域包含 F 蛋白的氨基酸 26-105， 而 F1 域包含F蛋白的氨基酸137-516。 然而， 也可以使用更小的部分， 只要稳定化的PreF抗原的 三维构象得到维持。类似地， 也可以使用包含额外结构构件的多肽 ( 例如融合多肽 ) 来替 换例示性F2和F

21、1域， 只要所述额外构件不破坏三维构象， 或者在其它方面不会不利地影响 稳定性、 生成或加工， 或者降低抗原的免疫原性。F2 和 F1 域以 N 端至 C 端取向定位， 设计成 复制 F 蛋白类似物折叠和装配成成熟的融合前构象。为了增强生成， F2 域之前可以有分泌 信号肽， 诸如天然 F 蛋白信号肽或异源信号肽， 其选择用于在要表达重组 PreF 抗原的宿主 细胞中增强生成和分泌。 0028 通过引入一处或多处修饰， 诸如一个或多个氨基酸的添加、 删除或替代来稳定 PreF 抗原 ( 处于三聚体融合前构象 )。一种此类稳定化修饰是添加包含异源稳定化域的氨 基酸序列。在例示性的实施方案中， 所

22、述异源稳定化域是蛋白质多聚化域。此类蛋白质多 聚化域的一个特别有利的例子是卷曲螺旋域， 诸如异亮氨酸拉链域， 其促进多个具有此类 域的多肽的三聚化。SEQ IDNO ： 11 中描述了一种例示性异亮氨酸拉链域。典型地， 所述异 源稳定化域定位于 F1 域的 C 端。 0029 任选地， 经由短的氨基酸接头序列 ( 诸如序列 GG) 将多聚化域连接至 F1 域。所 述接头也可以是更长的接头 ( 例如包括序列 GG， 诸如氨基酸序列 ： GGSGGSGGS ； SEQ ID NO ： 14)。许多构象中性接头是本领域中已知的， 其可以在这种背景中使用而不破坏 PreF 抗原 的构象。 0030 另

23、一种稳定化修饰是消除弗林蛋白酶识别和切割位点， 其位于天然 F0 蛋白中 F2 和 F1 域之间。可以通过删除或替代弗林蛋白酶识别位点的一个或多个氨基酸来消除一个 或两个弗林蛋白酶识别位点 ( 位于第 105 位 - 第 109 位和第 133 位 - 第 136 位 )， 从而该 蛋白酶不能将 PreF 多肽切割成其构成域。任选地， 也可以除去或用例如接头肽替代居间 pep27 肽。另外， 或任选地， 可以除去或替代接近融合肽的非弗林蛋白酶切割位点 ( 例如第 112 位 - 第 113 位的金属蛋白酶位点 )。 0031 稳定化突变的另一个例子是将亲水性氨基酸添加或替代入 F 蛋白的疏水域

24、中。典 型地， 会在疏水区中添加带电荷的氨基酸诸如赖氨酸或者用其替代中性残基诸如亮氨酸。 例如， 可以将 / 用亲水性氨基酸添加至或替代 F 蛋白胞外域的 HRB 卷曲螺旋域内的疏水性 或中性氨基酸。举例而言， 可以用带电荷的氨基酸残基诸如赖氨酸替代 F 蛋白的第 512 位 处存在的亮氨酸。或者 / 另外， 可以将 / 用亲水性氨基酸添加至或替代 F 蛋白的 HRA 域内 的疏水性或中性氨基酸。例如， 可以在 PreF 抗原的第 105 位 - 第 106 位处或者接近第 105 位 - 第 106 位处 ( 例如在与参照 SEQ ID NO ： 2 的残基 105 对应的氨基酸后， 诸如在

25、氨基酸 说 明 书 CN 101952321 B 5 4/42 页 6 105 和 106 之间 ) 插入一个或多个带电荷的氨基酸诸如赖氨酸。任选地， 可以在 HRA 和 HRB 域两者中添加亲水性氨基酸或者用亲水性氨基酸替代。或者， 可以删除一个或多个疏水性 残基， 只要 PreF 抗原的总体构象没有受到不利影响。 0032 可以个别地和/或与本文所公开的任何其它稳定化修饰组合地使用任何和/或所 有稳定化修饰来生成 PreF 抗原。在例示性的实施方案中， PreF 蛋白包含如下多肽， 其包含 F2 域和 F1 域， F2 域与 F1 域之间没有居间弗林蛋白酶切割位点， 并且有位于 F1 域

26、C 端的异 源稳定化域 ( 例如三聚化域 )。在某些实施方案中， PreF 抗原还包括一处或多处将 / 用亲 水性残基添加和 / 或替代入疏水性 HRA 和 / 或 HRB 域中。任选地， PreF 抗原具有至少一个 非弗林蛋白酶切割位点 ( 诸如金属蛋白酶位点 ) 的修饰。 0033 任选地， PreF 抗原可以包括额外的多肽构件， 其至少包含 RSV G 蛋白的免疫原性 部分。也就是说， 在某些实施方案中， PreF 抗原是包含 F 蛋白和 G 蛋白构件两者的嵌合蛋 白。F 蛋白构件可以是上文所描述的任何 PreF 抗原， 而 G 蛋白构件选择为 RSV G 蛋白的免 疫学活性部分 ( 多

27、至和 / 或包括全长 G 蛋白 )。在例示性的实施方案中， G 蛋白多肽包含 G 蛋白的氨基酸 149-229( 其中氨基酸位置参照 SEQ ID NO ： 4 中表示的 G 蛋白序列指明 )。 本领域技术人员会领会， 可以使用G蛋白的更小部分或片段， 只要选定的部分保留较大G蛋 白片段的优势免疫学特征。具体地， 选定的片段保留在约氨基酸位置 184-198( 例如氨基酸 180-200) 之间的免疫学优势表位， 而且长得足以折叠和装配成展现出免疫优势表位的稳定 构象。也可以使用更长的片段， 例如自约氨基酸 128 至约氨基酸 229， 多达全长 G 蛋白。只 要选定的片段在嵌合蛋白的背景中折

28、叠成稳定的构象， 并且在宿主细胞中重组生成时不干 扰生成、 加工或稳定性。任选地， 经由短的氨基酸接头序列诸如序列 GG 将 G 蛋白构件连接 至 F 蛋白构件。所述接头也可以是更长的接头 ( 诸如氨基酸序列 ： GGSGGSGGS ： SEQ ID NO ： 14)。许多构象中性的接头是本领域中已知的， 其可以在不破坏 PreF 抗原构象的情况中在 这种背景中使用。 0034 任选地， G 蛋白构件可以包括在 RSV 疾病的动物模型中减轻或预防增强性病毒疾 病的一处或多处氨基酸替代。也就是说， G 蛋白可以包括如下氨基酸替代， 从而在对选自公 认动物模型 ( 例如 RSV 的小鼠模型 ) 的

29、受试者施用包含 PreF-G 嵌合抗原的免疫原性组合 物时， 与接受疫苗 ( 包括含有未修饰 G 蛋白的疫苗 ) 的对照动物相比， 受试者展现出疫苗增 强性病毒疾病 ( 例如嗜酸粒细胞增多、 中性白细胞增多 ) 的症状减轻或没有症状。疫苗增 强性病毒疾病的减轻和/或预防在没有佐剂的情况中施用免疫原性组合物时(而不是在例 如存在强烈的 Th1 诱导性佐剂的情况中施用抗原时 ) 可以是明显的。另外， 在对人受试者 施用时， 氨基酸替代可以减轻或预防疫苗增强性病毒疾病。合适氨基酸替代的一个例子是 用丙氨酸替换第 191 位的天冬酰胺 ( 氨基酸 191 处 Asn Ala ： N191A)。 003

30、5 任选地， 上文所描述的任何 PreF 抗原可以包含起有助于纯化的作用的额外序列。 一个例子是多组氨酸标签。若想要的话， 可以自最终产物除去此类标签。 0036 在表达时， PreF 抗原经受分子内折叠， 并装配成成熟蛋白， 其包括多肽的多聚体。 有利地， PreF 抗原多肽装配成三聚体， 其类似于成熟的、 加工过的 RSV F 蛋白的融合前构 象。 0037 为了引发针对 RSV 的保护性免疫应答， 可以在免疫原性组合物中有利地使用本文 所公开的任何 PreF 抗原 ( 包括 PreF-G 抗原 )。此类免疫原性组合物通常包含药学可接受 说 明 书 CN 101952321 B 6 5/4

31、2 页 7 载体和 / 或赋形剂诸如缓冲剂。为了增强施用后产生的免疫应答， 免疫原性组合物通常还 包含佐剂。在用于引发针对 RSV 的保护性免疫应答的免疫原性组合物 ( 例如疫苗 ) 的情况 中， 有利的是， 组合物包含主要引发 Th1 免疫应答的佐剂 (Th1 偏爱性佐剂 )。典型地， 佐剂 选择为适合于对要施用组合物的目标群体施用。 如此， 根据应用， 佐剂选择为适合于对例如 新生儿或老年人施用。 0038 有利地， 采用本文所描述的免疫原性组合物作为疫苗来减轻或预防感染 RSV， 而在 施用或暴露于 RSV 后不诱导病理学应答 ( 诸如疫苗增强性病毒疾病 )。 0039 在一些实施方案中

32、， 免疫原性组合物包含 PreF 抗原 ( 诸如由 SEQ ID NO ： 6 显示 的例示性实施方案 ) 和包含 G 蛋白构件的第二多肽。G 蛋白构件通常至少包含 G 蛋白的氨 基酸 149-229。虽然可以使用 G 蛋白的更小部分， 但是此类片段应当最低限度包含氨基酸 184-198的免疫学优势表位。 或者， G蛋白可以包含G蛋白的更大部分， 诸如氨基酸128-229 或 130-230， 任选地， 作为更大蛋白质诸如全长 G 蛋白或嵌合多肽的元件。 0040 在其它实施方案中， 免疫原性组合物包含作为嵌合蛋白的 PreF 抗原， 所述嵌合 蛋白还包含 G 蛋白构件 ( 诸如由 SEQ I

33、D NO ： 8 和 10 显示的例示性实施方案 )。此类嵌合 PreF( 或 PreF-G) 抗原的 G 蛋白构件通常至少包含 G 蛋白的氨基酸 149-229。如上文所指 明的， 也可以使用G蛋白的更小或更大片段(诸如氨基酸129-229或130-230)， 只要免疫优 势表位得到保留， 并且 PreF-G 抗原的构象没有受到不利影响。 0041 任选地， 免疫原性组合物还可以包含与 RSV 不同的病原性生物体的至少一种别的 抗原。 例如， 病原性生物体是与RSV不同的病毒， 诸如副流感病毒(PIV)、 麻疹、 乙肝、 脊髓灰 质炎病毒、 或流感病毒。 或者， 病原性生物体可以是细菌， 诸

34、如白喉、 破伤风、 百日咳、 流感嗜 血菌、 和肺炎球菌。 0042 编码任何 PreF 抗原 ( 包括 PreF-G 抗原 ) 的重组核酸也是本公开内容的特征。在 一些实施方案中， 优化编码 PreF 抗原的核酸的多核苷酸序列以在选定的宿主 ( 诸如 CHO 细 胞、 其它哺乳动物细胞、 或昆虫细胞 ) 中表达。因而， 载体 ( 包括表达载体， 包括原核和真核 表达载体 ) 是本公开内容的特征。同样地， 包含此类核酸和载体的宿主细胞是本公开内容 的特征。此类核酸也可以在对受试者施用的免疫原性组合物的背景中使用以引发对 RSV 特 异性的免疫应答。 0043 有利地， 使用 PreF 抗原来预

35、防和 / 或治疗 RSV 感染。如此， 本公开内容的另一方 面关注一种用于引发针对 RSV 的免疫应答的方法。该方法牵涉对受试者 ( 诸如人或动物受 试者 ) 施用免疫学有效量的含有 PreF 抗原的组合物。施用免疫学有效量的组合物引发对 PreF抗原上存在的表位特异性的免疫应答。 此类免疫应答可以包括B细胞应答(例如中和 性抗体的生成 ) 和 / 或 T 细胞应答 ( 例如细胞因子的生成 )。有利地， 由 PreF 抗原引发的 免疫应答包括对 RSVF 蛋白的融合前构象上存在的至少一个构象表位特异性的要件。可以 对受试者施用 PreF 抗原和组合物， 而在与 RSV 接触后不增强病毒疾病。有

36、利地， 本文所公 开的PreF抗原和适当配制的免疫原性组合物引发Th1偏爱性免疫应答， 其减轻或预防感染 RSV 和 / 或减轻或预防感染 RSV 后的病理学应答。 0044 可以经由多种路径来施用免疫原性组合物， 包括直接将 PreF 抗原放置得与上呼 吸道的粘膜接触的路径， 诸如鼻内的。或者， 可以采用更传统的施用路径， 诸如肌内施用路 径。 说 明 书 CN 101952321 B 7 6/42 页 8 0045 如此， 还涵盖任何所公开的 RSV 抗原 ( 或核酸 ) 在制备用于治疗 RSV 感染 ( 例如 预防性处理或预防 RSV 感染 ) 的药物中的用途。因而， 本公开内容提供了在

37、药物中使用的 所公开重组 RSV 抗原或免疫原性组合物， 以及其用于预防或治疗 RSV 相关疾病的用途。 0046 在下文描述和实施例中呈现了关于 PreF 抗原及其使用方法的其它详情。 0047 术语 0048 为了便于审阅本公开内容的各个实施方案， 提供了术语的下列解释。可以在本公 开内容的语境中提供别的术语和解释。 0049 除非另有解释， 本文所使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域普通 技术人员的通常理解具有相同含义。分子生物学中的常见术语的定义可以参见 Benjamin Lewin， Genes V， 由 Oxford University Press 出版， 1994(IS

38、BN 0-19-854287-9) ； Kendrew 等 ( 编 )， The Encyclopedia of MolecularBiology， 由 Blackwell Science Ltd. 出 版， 1994(ISBN 0-632-02182-9) ； 及 RobertA.Meyers( 编 )， Molecular Biology and Biotechnology ： a Comprehensive DeskReference， 由 VCH Publishers， Inc. 出版， 1995(ISBN 1-56081-569-8)。 0050 除非上下文另有明确指明， 单数术语

39、“一个” 、“一种” 和 “所述” 包括复数所指物。 类似地， 除非上下文另有明确指明， 词语 “或” 意图包括 “和” 。术语 “多个 / 种” 指两个 / 种 或更多个 / 种。应当进一步理解的是， 对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小， 和 所有分子量或分子质量值是近似的， 并且为了描述而提供。 另外， 关于物质诸如抗原的浓度 或水平给出的数值限制意图为近似的。 如此， 若指明浓度是至少(例如)200pg， 则意图该浓 度被理解为至少约 ( 或 “大约” 或 “” )200pg。 0051 虽然与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以在本公开内容的 实践或测试中使用， 下

40、文描述了合适的方法和材料。术语 “包含” 意味着 “包括” 。如此， 除 非上下文另有要求， 词语 “包含” 及其变化形式应当理解为暗示包括规定的化合物或组合物 ( 例如核酸、 多肽、 抗原 ) 或步骤， 或者化合物或步骤的组， 但是不排除任何其它化合物、 组 合物、 步骤， 或其组。缩写 “例如” (e.g.) 衍生自拉丁语 exemplify gratia， 并且在本文中用 于指明非限制性例子。如此， 缩写 “例如” (e.g.) 与术语 “例如” (for example) 是同义的。 0052 呼 吸 道 合 胞 病 毒 (RSV) 是 副 粘 病 毒 科 (Paramyxovirid

41、ae)、 肺 病 毒 亚 科 (Pneumovirinae)、 肺病毒属(Pneumovirus)的一种病原性病毒。 RSV的基因组是负义RNA分 子， 其编码 11 种蛋白质。RNA 基因组与病毒 N 蛋白的紧密联合形成包在病毒包膜内部的核 壳。 基于G糖蛋白的抗原性差异， 已经描述了两组人RSV毒株， 即A和B组。 迄今已经分离出 多种 RSV 毒株。由 GenBank 和 / 或 EMBL 登录号指明的例示性毒株可以参见 WO2008114149， 通过提及而将其收入本文， 以便披露适合于在 PreF 抗原 ( 包括嵌合 PreF-G 抗原 ) 中使用， 和与 PreF 抗原联合使用的

42、RSV F 和 G 蛋白的核酸和多肽序列。别的 RSV 毒株可能会得到 分离， 并且涵盖在 RSV 属内。类似地， RSV 属涵盖通过遗传漂变、 或人工合成和 / 或重组， 源 于天然存在的变体 ( 例如以前或以后鉴定的毒株 )。 0053 术语 “F 蛋白” 或 “融合蛋白” 或 “F 蛋白多肽” 或 “融合蛋白多肽” 指具有 RSV 融合 蛋白多肽的整个或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。类似地， 术语 “G 蛋白” 或 “G 蛋白多 肽” 指具有 RSV 附着蛋白多肽的整个或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。已经描述了许多 RSV 融合和附着蛋白， 并且是本领域技术人员已知的。WO2008114

43、149 列出了此公开内容提 说 明 书 CN 101952321 B 8 7/42 页 9 交日时公众可获得的例示性 F 和 G 蛋白变体 ( 例如天然存在的变体 )。 0054 “变体” 在提及核酸或多肽 ( 例如 RSV F 或 G 蛋白核酸或多肽， 或 PreF 核酸或多 肽 ) 时指与参照核酸或多肽不同的核酸或多肽。通常， 变体与参照核酸或多肽之间的差异 构成与所指物相比小比例的差异。 0055 多肽或蛋白质的 “域” 或 “结构域” 指多肽或蛋白质内结构限定的元件。例如，“三 聚化域” 指多肽内促进多肽装配成三聚体的氨基酸序列。例如， 三聚化域能促进经由与 ( 具 有相同或不同氨基酸

44、序列的别的多肽的 ) 其它三聚化域的联合而装配成三聚体。该术语也 用于指编码此类肽或多肽的多核苷酸。 0056 术语 “天然的” 和 “天然存在的” 指以与其在自然界中相同状态存在的元件， 诸如蛋 白质、 多肽或核酸。也就是说， 该元件没有进行过人工修饰。应当理解的是， 在本公开内容 的语境中， RSV 蛋白或多肽有许多天然的 / 天然存在的变体， 例如自不同的天然存在的 RSV 毒株或分离物获得的。 0057 术语 “多肽” 指其中单体是经由酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。 如本文 中所使用的， 术语 “多肽” 或 “蛋白质” 意图涵盖任何氨基酸序列， 而且包括经修饰的序列诸 如糖蛋白

45、。术语 “多肽” 明确意图涵盖天然存在蛋白质， 以及重组或合成生成的蛋白质。术 语 “片段” 提到多肽时指多肽的一部分 ( 即亚序列 )。术语 “免疫原性片段” 指多肽的保留 全长参照蛋白质或多肽的至少一个优势免疫原性表位的所有片段。多肽内的取向一般以 N 端至 C 端方向叙述， 由各个氨基酸的氨基和羧基模块的取向限定。多肽从 N 或氨基端朝向 C 或羧基端翻译。 0058 “信号肽” 是一种短的氨基酸序列 ( 例如长度为约 18-25 个氨基酸 )， 其将新合成 的分泌性蛋白质或膜蛋白引导至膜及穿过膜， 例如内质网的。信号肽常常但不普遍位于多 肽的 N 端， 并且常常在蛋白质穿过膜后被信号肽

46、酶切去。信号序列通常含有三种常见的结 构特征 ： N 端极性碱性区 (n 区 )、 疏水性核心、 和亲水性 c 区。 0059 术语 “多核苷酸” 和 “核酸序列” 指长度为至少 10 个碱基的核苷酸聚合形式。核 苷酸可以是核糖核苷酸、 脱氧核糖核苷酸、 或任一核苷酸的经修饰形式。 该术语包括单一和 双重形式 DNA。 “分离的多核苷酸” 指与编码序列两者均不紧密相邻的多核苷酸， 它与所述 编码序列在正是衍生其的生物体的天然存在的基因组中紧密相邻 ( 一个在 5 端上， 而一个 在 3 端上 )。在一个实施方案中， 多核苷酸编码多肽。核酸的 5 和 3 方向通过参照各个 核苷酸单元的连接性来限

47、定， 并依照脱氧核糖 ( 或核糖 ) 糖环的碳位置来指派。以 5 至 3 方向阅读多核苷酸序列的信息 ( 编码 ) 内容。 0060 “重组” 核酸指具有非天然存在序列或者具有通过人工组合两个在其它情况中分 开的序列区段生成的序列的核酸。 可以通过化学合成或者， 更常见地， 通过人工操作分离的 核酸区段， 例如通过遗传工程技术来实现此人工组合。 “重组” 蛋白指由已经导入宿主细胞 诸如细菌或真核细胞中的异源 ( 例如重组 ) 核酸编码的蛋白质。可以在具有能够表达由所 导入核酸编码的蛋白质的信号的表达载体上导入核酸， 或者可以将核酸整合入宿主细胞染 色体中。 0061 术语 “异源的” 就核酸、

48、 多肽或其它细胞成分而言指明存在如下成分， 其在自然界 中通常找不到和 / 或其源自不同来源或物种。 0062 术语 “纯化” ( 例如就病原体或含有病原体的组合物而言 ) 指自组合物除去成分 说 明 书 CN 101952321 B 9 8/42 页 10 (其存在不是想要的)的方法。 纯化是一个相对术语， 并且不要求从组合物除去不想要的成 分的所有痕迹。 在疫苗生产的语境中， 纯化包括诸如离心、 透析、 离子交换层析、 和大小排阻 层析、 亲和纯化或沉淀等工艺。如此， 术语 “纯化的” 并不要求绝对纯度 ； 相反， 其意图为一 个相对术语。如此， 例如纯化的核酸制备物是指定蛋白质比该核酸在

49、其生成环境中 ( 例如 在细胞内或在生化反应室中 ) 得到更多富集的核酸制备物。可以纯化基本上纯的核酸或蛋 白质的制备物， 使得想要的核酸占制备物总核酸含量的至少50。 在某些实施方案中， 基本 上纯的核酸会占制备物总核酸或蛋白质含量的至少60、 至少70、 至少80、 至少85、 至少 90、 或至少 95或更多。 0063 “分离的” 生物学成分 ( 诸如核酸分子、 蛋白质或细胞器 ) 已经与该成分天然存在 的生物体的细胞中的其它生物学成分， 诸如其它染色体和染色体外 DNA 和 RNA、 蛋白质和细 胞器基本上分开或已经基本上纯化除去与该成分天然存在的生物体的细胞中的其它生物 学成分， 诸如其它染色体和染色体外 DNA 和 RNA、 蛋白质和细胞器。已经 “分离的” 核酸和蛋 白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。 该术语还包括通过在宿主细胞中重组表 达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸和蛋白质。 0064 “抗原” 指能在动物中刺激抗体生成和 / 或 T 细胞应答的化合物、 组合物、 或物质， 包括注射、 吸附、 或别的方式导入动物中的组合物。术语 “抗原” 包括所有相关抗原性表位。 术语 “表位” 或 “抗原决定簇” 指抗原