技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用。
背景技术
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)亦称铜绿假单胞菌。是一种常见的条件致病菌，自然界广泛分布于空气、水和土壤中，也可存在于人体器官表面，可污染常用眼药，作为一种条件致病菌，当角膜上皮遭到损害，机体免疫功能低下时，绿脓杆菌可直接侵入角膜，引起绿脓杆菌性角膜炎。绿脓杆菌性角膜溃疡是一种非常严重的化脓性角膜炎，多因角膜外伤或剔除角膜异物术感染所致。其特点是角膜刺激症状极重，多呈环状中央溃疡，表面有淡绿色脓液，前房多有积脓，短期内可致角膜穿孔，易引起眼内炎、视力丧失。伤后数小时或1～2天内发病，症状严重，发展迅猛，若不及时控制，本病一旦发生，患眼不但常失去视力，而且还有丧失眼球的危险。绿脓杆菌性角膜溃疡属眼科急重症，临床主要特点是潜伏期短、发展快、症状重、易穿孔并致盲。因此及时有效的诊断方式对治疗本症至关重要。
目前，常用的绿脓杆菌检测方法有：细菌培养法、基因芯片法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法等。细菌培养法耗时长及其繁琐的步骤是该方法发展难以突破的瓶颈。通常一次培养需要1-3天，耗时费力，易贻误诊断治疗的最佳时机；基因芯片法能对同一致病菌进行多基因位点检测，避免了单一位点检测的缺陷，大大降低假阳性，具有高灵敏度、高特异性的优点，但最大的缺点是成本太高；ELISA法虽然操作简单，较为便捷，但敏感性和特异性差，容易出现假阳性。PCR法或荧光定量PCR法具有较好的敏感性、特异性，是目前所有绿脓杆菌检测方法中最为精确的方法，但这两种方法都需要昂贵的专业仪器设备和试剂，操作步骤复杂，实验费时、费力，对人员技术要求高，不能方便的在临床开展。
可见，目前常用的几种绿脓杆菌检测方法已经不能满足日常门诊的快速诊断或基层医疗机构使用。而由于这些方法的局限，目前眼科临床的现状是大部分患者没有经过准确的病原微生物检测，只凭医生的经验进行诊断治疗，导致抗生素使用较混乱、增加了医疗成本和医疗风险。因此，急需开发一种敏感性高、特异性强，操作简便快捷、检测准确，成本较低的检测绿脓杆菌的方法。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，LAMP反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人员也可准确完成，适合基层医疗机构的应用。并且，LAMP还可以大大缩短操作时间，减少了样品污染机会，适合应用于绿脓杆菌的快速诊断。
但是，由于LAMP的灵敏度和特异性极度依赖于引物的特性，然而良好的LAMP引物不易获得，因此，目前还未见基于LAMP技术对绿脓杆菌样品直接检测的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用，本发明提供的引物灵敏度和特异性皆很高，将其制备成为试剂盒可实现对绿脓杆菌快速准确的检测。
本发明提供了一种LAMP引物组，包括如SEQ ID NO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。
本发明提供的LAMP引物组针对绿脓杆菌的特异保守区域(靶基因)，由6条引物组成，包括序列如SEQ ID NO:1～2所示的内引物(FIP/BIP)、序列如SEQ ID NO:3～4所示的外引物(F3/B3)和序列如SEQ ID NO:5～6所示的环引物(LPF/LPB)。其中，FIP/BIP分别为上下游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3/B3分别为上下游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。LF/LB分别为上下游环引物，与扩增过程中形成的茎环结构结合的区域在F2和F1之间。这样的设计可以保证引物具有更高的特异性，从而避免在检测过程中出现假阳性。
本发明还提供了SEQ ID NO:1～6所示核苷酸序列的引物组在制备检测绿脓杆菌试剂中的应用。
本发明提供的引物组可用于判断待测样品是否受到绿脓杆菌的污染。
所述待测样品为眼部样品、医疗器械、药品、食品、化妆品、皮肤、分泌物或口腔黏膜。
所述药物为眼部用药：具体包括染色剂类，麻醉剂类、消炎抗生素类、皮质类固醇激素类、抗青光眼类、散瞳类。
染色剂类：如荧光素钠，用于角膜、结膜损伤及异物的术前检查。
麻醉剂类：如地卡因，这是做眼科检查前必用的，也是很多角膜损伤必用的药物，也用于眼科表面麻醉。
消炎抗生素类：如利福平，主要适用于眼睑、泪道、结膜、角膜等部位的感染性炎症，或手术后感染的预防与治疗。
皮质类固醇激素类：如可的松，主要适用于过敏性炎症、内因性非感染性炎症以及外伤、手术后反应性炎症，也可以用于近视眼手术后。
抗青光眼类：如匹罗卡品。
散瞳类：如阿托品，主要用于验光、眼底等散瞳检查，也可用于严重的角膜炎、虹膜睫状体炎和手术前后。
具体的，眼部用药为：荧光素钠、地卡因、氢化可的松、阿托品、匹罗卡品、利福平等。
实验表明，本发明提供的引物在对药物是否感染绿脓杆菌进行检测的过程中，不受药物组分的干扰。
作为优选，眼部样品为眼睑组织、角膜组织、泪液、房水或玻璃体腔液。
本发明提供的引物可实现对待测物的直接检测，而不需对待测样品进行DNA的提取。
本发明还提供了一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒，包括本发明提供的LAMP引物组。
作为优选，本发明提供的用于检测绿脓杆菌的试剂盒还包括：LAMP反应液、LAMP密封液和LAMP显色液。
优选的，LAMP反应液中包括：Bst聚合酶，LAMP反应缓冲液，超纯水。
更优选的，LAMP反应缓冲液中包括：硫酸镁、甜菜碱、dNTP、Tris-HCl、超纯水。
优选的，LAMP密封液为甘油。
优选的，LAMP显色液中包括SYBR green I或钙黄绿素。
本发明还提供了一种非诊断目的的绿脓杆菌检测方法，该方法以待测样品为模板，以本发明提供的引物组进行LAMP扩增，经显色后，根据显色结果判断样品是否含有绿脓杆菌。
所述LAMP扩增的温度为65℃，时间为30min。
具体的，该方法包括以下步骤：
步骤1：取待测样品与灭菌生理盐水混合，获得样品混悬液；取如权利要求1所述的引物组与水混合，制得引物组工作液；
步骤2：取所述样品混悬液、所述引物组工作液与LAMP反应液、超纯水、LAMP密封液混合，制得扩增反应液；
步骤3：取所述扩增反应液，65℃反应30min，显色，根据显色结果判断样品是否含有绿脓杆菌。
所述待测样品可为提取获得的DNA样品，也可不经提取，仅将样品与灭菌生理盐水混合后的样品混悬液。
作为优选，显色采用LAMP显色液，其中包含SYBR green I或钙黄绿素，显色结果呈现绿色则待测样品中含有绿脓杆菌，不呈现绿色则待测样品中不含有绿脓杆菌。
不呈现绿色的情况包括：显色结果为橙色、其它颜色或无色。
作为优选，待测样品为眼部样品、医疗器械、药品、皮肤、分泌物或口腔黏膜。
作为优选，LAMP扩增的反应液中，引物组工作液、LAMP反应液、样品混悬液、超纯水和LAMP密封液的体积比为1:12.5:2:(8.5～10.5):20。
作为优选，引物组工作液中，
如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为25μmol/L～50μmol/L；
如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为25μmol/L～50μmol/L；
如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为15μmol/L～30μmol/L；
如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为15μmol/L～30μmol/L；
如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L～10μmol/L；
如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L～10μmol/L。
优选的，引物组工作液中，
如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L；
如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L。
作为优选，LAMP显色液与扩增反应液的体积比为1：45。
本发明提供了一种用于检测绿脓杆菌的LAMP引物组，包括如SEQ ID NO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。本发明还提供了用于检测绿脓杆菌的试剂盒，以及检测绿脓杆菌的方法。本发明基于LAMP技术，针对绿脓杆菌的特异保守区域设计6条引物。因此，本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的绿脓杆菌。并且，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，因此，在LAMP扩增中，无需提取样品的DNA而直接进行扩增，进一步缩短了检测的时间，且简化了操作。经试验证明，本发明提供的引物进行绿脓杆菌检测，准确性可达100％。且利用临床常见病毒作为对照检测的过程中，无假阳性现象产生。并且，本发明提供的引物在绿脓杆菌的检测中，灵敏度可达10pg/μL。而由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对绿脓杆菌的快速准确检测，因此，适用于门诊和基层医生对绿脓杆菌性角膜炎、绿脓杆菌性结膜炎、绿脓杆菌性视网膜炎等疾病的快速诊断。
附图说明
图1示待测样品1～4和阴性对照1～4的扩增产物电泳结果，其中，泳道1～4示阴性对照1～4的扩增产物电泳结果，泳道5～8示待测样品1～4的电泳结果；
图2示不同样品扩增产物电泳结果，其中，泳道1～5依次示绿脓杆菌的扩增产物、表皮葡萄球菌的扩增产物、肺炎链球菌的扩增产物、金黄色葡萄球菌的扩增产物、变形杆菌的扩增产物。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所用试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中：LAMP反应液、LAMP密封液、LAMP显色液购自广州迪奥。
荧光PCR法采用上海一研生物科技有限公司的荧光PCR法绿脓杆菌核酸检测试剂盒。
其它溶剂和试剂皆为普通市售品。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明提供的LAMP引物组的准确性
利用本发明提供的LAMP引物组检测绿脓杆菌，实验设待测样品组合阴性对照。LAMP引物组包含如SEQ ID NO:1～6所示序列的引物。实验分组如表1所示：
表1实验分组与所用样品
各组实验设10次重复。
LAMP实验操作具体为：
1、样本的处理：
角膜组织：用棉拭子取病变处角膜组织和正常角膜组织，分别加入500μL灭菌生理盐水后充分震荡，尽可能将细胞洗脱，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
玻璃体腔液：将玻璃体腔液2μL与500μL灭菌生理盐水，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
滴眼液：将滴眼液与10μL与500μL灭菌生理盐水，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
针头：将针头投入500μL灭菌生理盐水后充分震荡，尽可能将细胞洗脱，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
2、工作液的配制：
引物组工作液中包括：
如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L；
如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L。
选择购自广州迪奥的LAMP反应液、LAMP密封液、LAMP显色液，分别配制待测样品和阴性对照的配制LAMP扩增体系：
在小PCR管内分别加入下列组分：
将1μL显色剂滴在PCR管盖中间，盖紧管盖。
3、将装有待测样品和阴性对照LAMP扩增体系的PCR管放入65℃的水浴锅内，反应30分钟
4、颠倒PCR管数次，使反应液与显色液充分混匀，观察反应液颜色，若呈现绿色则为阳性，呈现橙色或其他颜色则为阴性。
实验结果表明，待测样品1～4的PCR管中皆呈现绿色，而阴性对照1～4的PCR管中皆呈现橙色。说明本发明提供的引物能够准确的分辨组织中是否含有绿脓杆菌。为了进一步验证本实施例的实验结果，在各PCR管中分别取5μL扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳，90V电压下电泳45min。待测样品1～4和阴性对照1～4的扩增产物电泳结果如图1所示。如图1，呈现绿色的待测样品1～4的扩增产物电泳后可见梯状扩增条带，符合预期。可见，本实施例通过6组实验，各组10次重复。60次实验结果完全符合预期，电泳结果也证明显色结果与扩增结果完全一致。充分证明本发明提供的引物在对绿脓杆菌检测的过程中，准确性可达100％。
实施例2：本发明提供的LAMP引物组的敏感性
取绿脓杆菌基因组DNA，10倍梯度稀释样品使其浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl，利用上述稀释后的样品检测本发明提供的LAMP引物组的敏感性。
实验对绿脓杆菌提取DNA和不提DNA组分别进行LAMP检测，确定提取DNA与否对LAMP反应的影响。菌液浓度按比例依次稀释成107个/ml，106个/ml，105个/ml，104个/ml，103个/ml，各浓度的检测设3次重复。
实验以荧光PCR法的绿脓杆菌核酸检测试剂盒为对照。各浓度细菌的检测设3次重复。
LAMP的实验操作参照本发明实施例1。
LAMP扩增体系为：
在小PCR管内分别加入下列组分：
荧光PCR法检测绿脓杆菌操作参照试剂盒中提供的说明书，Ct值≤36且具有较好的对数增长曲线判定为检出，Ct值＞36或扩增曲线不佳判定为未检出。实验结果如表2所示：
表2敏感性检测结果
结果表明，本发明提供的LAMP引物组在对绿脓杆菌DNA的检测中，可准确检出的最小浓度为10pg/μL，该结果与目前公认最为敏感的荧光定量检测法所得结果一致。
表3敏感性检测结果
结果表明，本发明提供的LAMP引物组在对绿脓杆菌菌体的检测中，可准确检出的最小浓度为104个/ml。
实施例3：本发明提供的LAMP引物组的特异性
分别利用临床常见的含有其他病菌样品：皮葡萄球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等作为阴性对照，以生理盐水为空白对照，以绿脓杆菌为实验对象，对本发明提供的引物进行了特异性检测。LAMP实验方法参照本发明实施例1。各组设3次重复。检测结果如表3所示：
表4LAMP引物组的特异性检测结果
重复1 重复2 重复3 皮葡萄球菌 橙色 橙色 橙色 肺炎链球菌 橙色 橙色 橙色 金黄色葡萄球菌 橙色 橙色 橙色 变形杆菌 橙色 橙色 橙色 生理盐水 橙色 橙色 橙色 绿脓杆菌 绿 绿 绿
结果显示，本发明提供的引物组只能特异扩增绿脓杆菌，对其他病原微生物未产生扩增，也未产生颜色反应。可见本发明提供的LAMP引物具有良好的特异性，在检测过程中不会出现假阳性。
各样品扩增产物电泳结果如图2所示。如图2，呈现绿色样品扩增产物电泳后可见梯状扩增条带，符合预期。而其他各组皆未见条带产生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 何伟
<120> 一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用
<130> MP1622774
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttaccggcgt tcagttcgtg gaccgatcgg ccacgagaag 40
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agccacatgt cgccgatcta catgacgaag aaggtggcat c 41
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgctgaactg gctggtg 17
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgttgctctc gtgcgc 16
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaacacctt gatgttcgaa gg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgagttgct ggcgaagctg 20