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竹红菌素糖苷及其制法
    本发明属于具有光动力活性的光敏剂领域，尤其是涉及竹红菌素糖苷及其制法。

    光动力疗法(Photodynamic therapy，简称PDT)是一种具有吸引力的新型疗法，它是指给人体施用光敏剂，然后光照激活光敏剂，在氧的参与下，产生活性氧及其他活性中间体(如光敏剂自由基)，破坏病变组织而达到治病的目的。其中要求光敏剂在光疗窗口(600-900纳米)有强吸收，光毒性高，暗毒性低，且能高度选择性地富集于病变组织上。同时，由于光照也可以选择性地进行，使光动力疗法具有双重选择性。因此，光疗就比一般的化疗和辐射疗法更易将治疗作用点集中于病变组织内，减小对正常组织的损伤，降低副作用。

    早在本世纪初，喇博(Rabb)就在《生物杂志》1900年第9卷第524页报道了染料吖啶橙对生物分子的光动力效应(Z.Biol.1900，9，524)。接着赫斯曼(Hausmann)又在《生物化学杂志》1911年第30卷第176页上报道了血卟啉(Hematoporphyrin，简称HP)加光辐照导致家兔红细胞溶血(Biochem.Z.1911，30，176)。但直到1964年，利普生(Lipson)才在《北大西洋公约组织癌症研究所杂志》1961年第26卷第1页和《乳腺疾病》1964年第46卷676页上提出了用血卟啉衍生物(Hematoporphyrin derivatives，简称HPD)的光敏化作用来治疗肿瘤的设想，并发现用HPD可对支气管癌和食道癌进行确诊，可使乳腺癌变组织部分坏死(J.Natl.Cancer Inst.，1961，26，1；Dis.Chest 1964，46，676)。1972年，戴尔芒得(Diamond)首先在《手术刀》1972年第2卷第1175页上报道了应用HPD光动力疗法来治疗动物肿瘤(Lancet 1972，2，1175)，不久凯利(Kelly)等在《英国癌症杂志》1975年第31卷第237页上报道了用HPD光动力治疗了1例膀胱癌患者，结果也发现肿瘤坏死(Br.J.Cancer 1975，31，237)。道尔蒂(Dougherty)等人在《癌症研究》1976年第36卷第2326页和1978年第38卷2628页发表的工作为肿瘤HPD光动力治疗提供了令人信服的依据(Cancer Res.1976，36，2326；1978，38，2628)。在道尔林(Doiron)和高默(Gomer)编的《卟啉定位及肿瘤治疗》一书中，早田义博(Hayata)等人的工作则在某种程度上为确定光动力疗法的适应症和提高治疗效果积累了有用的经验(Porphyrin Localization and Treatment of Tumors.New York，Liss，1984，pp 747)。1993年4月，加拿大首先批准了将光卟啉(Photofrin)商品化，用于治疗膀胱癌。之后，美国、日本和欧洲也相继批准了光动力来治疗一些癌症。

    尽管HPD及其商品已广泛用于实验临床，但这些第一代光敏剂存在着难以克服的不足。首先，其选择性差，易引起皮肤过敏的副作用，体内代谢慢，需要避光时间长；其次，其红光部分的吸收带(带I，约630纳米)很弱，不能很好地吸收红光；再则，其组分复杂，稳定性差；这些都限制了它的应用。

    八十年代以后，光动力疗法已成为肿瘤防治研究中的一个十分活跃地领域，光动力药物(即光敏剂)、光源和导光器材都有了新的发展。许多光敏剂经研究证明是较HPD更为优良的光疗药物，具有潜在的光疗前景，称之为第二代光敏剂。博耐特(Bonnett)在《化学综述》1995年第19页中发表了对一些第二代光敏剂的介绍，如卟啉、卟吩、二氢卟吩、内源卟啉、酞菁和萘酞菁(Chem.Rev.1995，19)。第五振军(Diwu)在《光化学与光生物》1995年第61卷第529页上全面总结了竹红菌素(Hypocrellin)和金丝桃蒽酮(Hypericin)的光动力研究进展(Photochem.Photobiol.1995，61，529)。其中值得注意的是竹红菌素，它是一种盛产于我国云南地区的一种光敏色素，包括竹红菌甲素(Hypocrellin A，简称HA)和竹红菌乙素(Hypocrellin B，简称HB)(结构如I和II所示)，对这种新型光敏剂的开发和研究也是始于我国，后来又吸引了国外研究者们的广泛兴趣。

    作为新型光敏剂，竹红菌素具有如下优势：原料易得，容易纯化；光毒性高，暗毒性低；稳定性好；不簇集，在溶液状态下以单体形式存在；能富集于癌细胞；体内代谢快，无明显副作用；三重态量子产率高，单重态氧(1O2)的量子产率高；光动力作用中，不仅涉及到1O2，还涉及到自由基如超氧阴离子自由基(O2·-)、羟基自由基(·OH)和光敏剂负离子自由基。后者在癌细胞缺氧的条件下将起主要作用。哈得森(Hudson)等人在《光化学与光生物》1994年第60卷第253页上报道了HA能光敏杀灭爱滋病毒(Photochem.Photobiol.1994，60，253)。曹恩华(Cao)等人《光化学与光生物杂志B：生物》1998年第43卷第106页上发表的研究结果表明HA能光敏导致三种恶性肿瘤细胞的凋亡(J.PhotochemPhotobiol.B：Biol.1998，43，106)。傅乃武(Fu)等人曾在《中国药理学报》1989年第10卷第371页上报道了HA对肝癌细胞的线粒体和微粒体具有光动力杀伤作用。邹伟(Zou)等人曾在《光化学与光生物杂志B：生物》1996年第33卷第73页上报道HA-脂质体及13-SO3Na-DDHA对pBR322 DNA产生光敏损伤(J.Photochem.Photobiol.B：Biol.1996，33，73)。这些都证明了竹红菌素具有很好的光疗应用前景。但是，竹红菌素是油溶性色素，且其在光疗窗口(600-900纳米)的吸收不够强，影响了竹红菌素的进一步临床应用研究。吉达(Kieda)和蒙斯格尼(Monsigny)在《侵入与新陈代谢》1986年第6卷第347页上发表的研究表明光敏剂与糖配体的结合具有重要意义，因为糖不仅能提高水溶性，而且能提高光敏剂与恶性肿瘤细胞膜的相互作用和特定亲和力(Invasion andMetastasis 1986，6，347)。到目前为止，麦喇德(Maillard)等人在《美国化学会志》1989年第111卷第9125页上报道卟啉糖苷和酞菁糖苷已经合成成功，并证明糖的引入使光敏剂的光动力活性得以改善(J.Am.Soc.Chem.1989，111，9125)。但是，还没有关于竹红菌素糖苷方面的报道。

    本发明的目的在于克服竹红菌素水溶性差、光疗窗口吸收弱的弱点，提高竹红菌素对肿瘤组织的靶向选择性，而提供一种竹红菌素糖苷及其制法。

    本发明采用在竹红菌素5和(或)8位先利用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)中巯基(-SH)的高反应活性，引入对糖具有结合活性的醇羟基(-OH)，然后再用有名的克尼格斯-克诺尔(Knigs-Knrr)反应实现竹红菌素的间接糖苷化，得到竹红菌甲素糖苷和竹红菌乙素糖苷(结构分别如III和IV所示)。

    其中竹红菌甲素糖苷的结构如III所示，

      IIIA：R1＝H，R2＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5；

    或IIIB：R1＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5；R2＝H；

    或IIIC：R1＝SCH2CH2OH，R2＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5；

    或IIID：R1＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5，R2＝SCH2CH2OH；

    或IIIE：R1＝R2＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5。

      其中，n为正整数。

    竹红菌乙素糖苷的结构如IV所示，

      IVA：R1＝H，R2＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5；

    或IVB：R1＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5；R2＝H；

    或IVC：R1＝SCH2CH2OH，R2＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5；

    或IVD：R1＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5，R2＝SCH2CH2OH。

    或IVE：R1＝R2＝SCH2CH2O(C6H10O5)n-1C6H11O5。

      其中，n为正整数。

    本发明的竹红菌素糖苷的制备方法按如下步骤进行：

    将竹红菌素和巯基乙醇，按摩尔比1∶10～1∶100混合，然后再与极性有机溶剂-缓冲溶液混合，并使其溶解，加到反应器中，其中极性有机溶剂-缓冲溶液的体积比为2∶1～1∶4，pH值为7.0～14.0，缓冲溶液为无机盐的水溶液；同时搅拌，用强光照射20～30分钟，或在暗处反应5～10天；然后再用酸中和至中性，用氯仿萃取，取氯仿层，用水洗3～4次，减压浓缩氯仿液，用薄层层析法或柱层析法分离得到竹红菌素巯基乙醇取代的衍生物；取该产物与溴代乙酰化糖配体，按摩尔比1∶2～1∶4，加入到非极性有机溶剂中使其溶解，搅拌，再加入氧化银、碘和分子筛，氧化银∶碘∶竹红菌素巯基乙醇取代的衍生物的摩尔比为1∶2∶1～4∶1∶1，分子筛为溶剂体积(毫升)的1/60～1/15克，在暗处搅拌24～48小时；反应结束后，过滤，取滤液，抽干溶剂，再用氯仿溶解，经薄层层析法或柱层析法分离得到乙酰化的竹红菌素糖苷；最后，将乙酰化的竹红菌素糖苷溶于甲醇钠的甲醇溶液中使其溶解，暗处搅拌6～12小时后，用酸中和，然后用氯仿萃取；取氯仿层，用水洗3～4次，再用薄层层析法或柱层析法分离提纯，即可得到竹红菌素糖苷。

    其中竹红菌素为竹红菌甲素或竹红菌乙素；极性有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜或氮，氮-二甲基甲酰胺；缓冲溶液为磷酸盐水溶液、碳酸盐水溶液、磷酸盐-NaOH水溶液或NaOH水溶液；非极性有机溶剂为苯、氯仿或二氯甲烷；所用的薄层层析法和柱层析法的展开液为石油醚-乙酸乙酯-乙醇(体积比4∶2∶1)、氯仿-乙酸乙酯(体积比2∶1)和氯仿-甲醇(体积比5∶1)；酸为盐酸；所用的糖配体为单糖或寡糖，如匍萄糖、甘露糖或麦芽糖；分子筛为经过活化的4分子筛；光源为高压钠灯或卤钨灯。

    本发明的用途：本发明合成的竹红菌素糖苷在光疗窗口(600-900纳米)的吸收增强；由于糖基的引入，使其水溶性大大提高，有利于药物在体内的传送；与癌细胞的亲合能力增强，使其体内靶向性提高，毒副作用降低。在激光照射下，竹红菌素糖苷的光动力作用强，有望成为较血卟啉类光敏剂性能更优、功能更强的新一代光疗药物，用于治疗肿瘤、白血病、抗爱滋病毒和血液净化。

    本发明的优点和效果：此竹红菌素糖苷的制备方法表明，竹红菌素与巯基乙醇的光化学反应较热化学反应的速度快，副产物少，目标产物的产率极大提高。在用克尼格斯-克诺尔(Knigs-Knrr)反应进行竹红菌素糖苷化反应一步中，由于氧化银、碘和分子筛的加入，使糖苷的产率提高到60％左右。最后一步的脱乙酰基反应，产率可达93％。最重要的是这是首次竹红菌素糖苷的合成，所得到的竹红菌素糖苷的水溶性大大提高，二糖苷易于溶解在水溶液中，其最大吸收峰也发生了红移，单巯基取代的糖苷最大吸收峰红移30纳米左右，二巯基取代的糖苷最大吸收峰红移50纳米左右，由于糖配体的生物识别作用，所合成的竹红菌素糖苷也有望像卟啉糖苷或酞菁糖苷一样，具有更好的靶向选择性。竹红菌素糖苷的光物理和光化学实验表明，此类衍生物完全保持了竹红菌甲素和竹红菌乙素的光敏特性，能够光敏产生单重态氧(1O2)、超氧阴离子自由基(O2·-)和羟基自由基(·OH)；在无氧条件下，能光敏产生竹红菌素糖苷的负离子自由基。其中单重态氧(1O2)的量子产率有所下降(0.18～0.25)，但自由基的生成效率却比竹红菌素提高了2～3倍左右。对于癌细胞内的厌氧环境来说，自由基机制往往占主导地位。由于糖基的引入，使其水溶性得到改善，有利于在体内的传送。同时其与癌细胞和DNA分子的亲合力增强，光照条件下可导致癌细胞和DNA分子的破坏和损伤，因而不仅可以用于肿瘤光疗，还有望用于抗爱滋病毒和净化血液。从现阶段的实验数据以及结构、作用机制推测，此类糖苷化衍生物具有更好的潜在应用前景。以前我们的生物体实验已证明竹红菌素是光毒性高、暗毒性低的光敏剂。卟啉和酞菁类光敏剂的研究表明，糖基的引入有利于光敏剂的选择性富集和光疗作用的最大发挥。

                             实施例1

    竹红菌甲素(HA)109毫克(0.2×10-3摩尔)，巯基乙醇0.14毫升(2×10-3摩尔)，与200毫升甲醇-磷酸盐缓冲溶液(体积比2∶1)混合，并使其济解，加入到500毫升的圆底烧瓶中，同时搅拌，用高压钠灯照射30分钟，然后用盐酸中和至中性，用氯仿萃取；取氯仿层，用水洗3～4次。减压浓缩氯仿液，用薄层层析法分离，所用展开液为石油醚-乙酸乙酯-乙醇(体积比4∶2∶1)；再用此法纯化，可得巯基乙醇单取代的竹红菌甲素衍生物(如结构III所示，R1＝H，R2＝SCH2CH2OH或R1＝SCH2CH2OH，R2＝H)。

    将巯基乙醇单取代的竹红菌甲素衍生物62毫克(0.1×10-3摩尔)和溴代乙酰化葡萄糖82毫克(0.2×10-3摩尔)加入60毫升苯中，同时搅拌。再加入46毫克氧化银、25毫克碘和1克4分子筛(500℃常压活化)，暗处反应24小时后过滤，取滤液，抽干溶剂，再用氯仿溶解，用薄层层析法分离，所用展开液为氯仿-乙酸乙酯(体积比2∶1)。用同样的方法纯化，即可得到乙酰化的竹红菌甲素单取代葡萄糖糖苷(如结构III所示，R1＝H，R2＝SCH2CH2O(C6H7O5)(CH3CO)4或R1＝SCH2CH2O(C6H7O5)(CH3CO)4，R2＝H)。

    将乙酰化的竹红菌甲素单取代葡萄糖糖苷66毫克(0.07×10-3摩尔)加入到0.05摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中暗处搅拌6小时。然后用盐酸中和，再用氯仿萃取。取氯仿层，用水洗3～4次，再用柱层析法分离，所用展开液为氯仿-甲醇(体积比5∶1)。最后，用同样的方法纯化，即可得到竹红菌甲素单取代葡萄糖糖苷(如结构IIIA或结构IIIB所示，n＝1)。反应产率约为60％。

    此化合物的鉴定：紫外吸收(λmax)：488nm，580nm。红外吸收(νmax)：3416cm-1，1695cm-1，1590cm-1，1100cm-1，1070cm-1，1018cm-1，897cm-1，800cm-1。核磁共振(δ1H)：15.96(s)，15.93(s)，7.98(broad)，6.90(broad)，6.46(s)，5.88(d)，5.67(m)，4.77(m)，4.60(m)，4.37(m)，4.25(m)，4.10(s)，4.07(s)，4.02(dd)，3.94(s)，3.85(s)，3.30(t)，3.22(dd)，2.98(t)，2.37(s)，1.60(s)ppm。质谱分析：m/z 784(M+)。

                            实施例2

    竹红菌乙素(HB)105毫克(0.2×10-3摩尔)，巯基乙醇0.7毫升(1×10-2摩尔)，与200毫升乙醇-碳酸盐缓冲溶液(体积比1∶2)混合，并使其溶解，加入到500毫升的圆底烧瓶中，同时搅拌，在暗处反应8天，然后用盐酸中和至中性，用氯仿萃取；取氯仿层，用水洗3～4次。减压浓缩氯仿液，用柱层析法分离，所用展开液为石油醚-乙酸乙酯-乙醇(体积比4∶2∶1)；再用此法纯化，可得巯基乙醇二取代的竹红菌乙素衍生物(如结构IV所示，R1＝R2＝SCH2CH2OH)。

    将巯基乙醇二取代的竹红菌乙素衍生物68毫克(0.1×10-3摩尔)和溴代乙酰化葡萄糖82毫克(0.2×10-3摩尔)加入60毫升苯和氯仿的混合溶剂中(体积比9∶1)，同时搅拌。再加入92毫克氧化银、25毫克碘和3克4分子筛(180℃真空活化)，电磁搅拌。暗处反应36小时后过滤，取滤液，抽干溶剂，再用氯仿溶解，用柱层析法分离，所用展开液为氯仿-乙酸乙酯(体积比2∶1)。用同样的方法纯化，即可得到巯基乙醇单取代的乙酰化竹红菌乙素葡萄糖单糖苷(如结构IV所示，R1＝SCH2CH2OH，R2＝SCH2CH2O(C6H7O5)(CH3CO)4·或R1＝SCH2CH2O(C6H7O5)(CH3CO)4，R2＝SCH2CH2OH)。

    将巯基乙醇单取代的乙酰化竹红菌乙素葡萄糖单糖苷72毫克(0.07×10-3摩尔)加入到0.05摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中暗处搅拌10小时。然后用盐酸中和，再用氯仿萃取。取氯仿层，用水洗3～4次，再用薄层层析法分离，所用展开液为氯仿-甲醇(体积比5∶1)。最后，用同样的方法纯化，即可得到巯基乙醇单取代的竹红菌乙素葡萄糖单糖苷(如结构IVC或IVD所示，n＝1)。反应产率约为54％。

    此化合物的鉴定：紫外吸收(λmax)：512nm，580nm。红外吸收(νmax)：3414cm-1，1690cm-1，1592cm-1，1100cm-1，1070cm-1，1018cm-1，897cm-1，800cm-1。核磁共振(δ1H)：15.96(s)，15.90(s)，7.96(broad)，6.90(broad)，5.89(d)，5.66(m)，4.78(m)，4.60(m)，4.37(m)，4.26(m)，4.13(s)，4.08(s)，4.05(s)，4.02(s)，3.96(dd)，3.52(t)，3.30(t)，3.20(dd)，3.10(t)，2.93(t)，2.38(s)，1.96(s)ppm。质谱分析：m/z 842(M+)。  

                             实施例3

    竹红菌甲素(HA)109毫克(0.2×10-3摩尔)，巯基乙醇1.4毫升(2×102摩尔)，与200毫升二甲基亚砜-(磷酸盐-NaOH)缓冲溶液(体积比1∶4)混合，并使其溶解，加入到500毫升的圆底烧瓶中，同时搅拌，用卤钨灯照射25分钟，然后用盐酸中和至中性，用氯仿萃取；取氯仿层，用水洗3～4次。减压浓缩氯仿液，用薄层层析法分离，所用展开液为石油醚-乙酸乙酯-乙醇(体积比4∶2∶1)；再用此法纯化，可得巯基乙醇二取代的竹红菌甲素衍生物(如结构III所示，R1＝R2＝SCH2CH2OH)。

    将巯基乙醇二取代的竹红菌甲素衍生物70毫克(0.1×10-3摩尔)和溴代乙酰化甘露糖164毫克(0.4×10-3摩尔)加入60毫升二氯甲烷中，同时搅拌。再加入46毫克氧化银、25毫克碘和2克4分子筛(500℃常压活化)，电磁搅拌。暗处反应48小时后过滤，取滤液，抽干溶剂，再用氯仿溶解，用薄层层析法分离，所用展开液为氯仿-乙酸乙酯(体积比2∶1)。用同样的方法纯化，即可得到乙酰化的竹红菌甲素二取代甘露糖糖苷(如结构III所示，R1＝R2＝SCH2CH2O(C6H7O5)(CH3CO)4)。

    将乙酰化的竹红菌甲素二取代甘露糖糖苷95毫克(0.07×10-3摩尔)加入到0.10摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中搅拌12小时。然后用盐酸中和，再用氯仿萃取。取氯仿层，用水洗3～4次，再用柱层析法分离，所用展开液为氯仿-甲醇(体积比5∶1)。最后，用同样的方法纯化，即可得到竹红菌甲素二取代甘露糖糖苷(如结构IIIE所示，n＝1)。反应产率约为58％。

    此化合物的鉴定：紫外吸收(λmax)：510nm，580nm。红外吸收(νmax)：3410cm-1，1685cm-1，1590cm-1，1100cm-1，1070cm-1，1018cm-1，897cm-1，800cm-1。核磁共振(δ1H)：15.93(s)，15.87(s)，7.90(broad)，7.00(broad)，5.90(d)，5.64(m)，4.80(m)，4.60(m)，4.38(m)，4.26(m)，4.14(s)，4.06(s)，4.02(s)，4.00(dd)，3.96(s)，3.32(t)，3.18(dd)，2.94(t)，2.37(s)，1.60(s)ppm。质谱分析：m/z 1022(M+)。

                              实施例4

    竹红菌乙素(HB)105毫克(0.2×10-3摩尔)，巯基乙醇1.4毫升(2×10-2摩尔)，与200毫升(氮，氮-二甲基甲酰胺)-NaOH缓冲溶液(体积比1∶3)混合，并使其溶解，加入到500毫升的圆底烧瓶中，同时搅拌，用高压钠灯照射20分钟，然后用盐酸中和至中性，用氯仿萃取；取氯仿层，用水洗3～4次。减压浓缩氯仿液，用柱层析法分离，所用展开液为石油醚-乙酸乙酯-乙醇(体积比4∶2∶1)；再用此法纯化，可得巯基乙醇二取代的竹红菌乙素衍生物(如结构IV所示，R1＝R2＝SCH2CH2OH)。

    将巯基乙醇二取代的竹红菌乙素衍生物68毫克(0.1×10-3摩尔)和溴代乙酰化麦芽糖140毫克(0.2×10-3摩尔)加入60毫升苯中，同时搅拌。再加入23毫克氧化银、50毫克碘和4克4分子筛(500℃常压活化)，电磁搅拌。暗处反应36小时后过滤，取滤液，抽干溶剂，再用氯仿溶解，用柱层析法分离，所用展开液为氯仿-乙酸乙酯(体积比2∶1)。用同样的方法纯化，即可得到巯基乙醇单取代的乙酰化竹红菌乙素麦芽糖单糖苷(如结构IV所示，R1＝SCH2CH2OH，R2＝SCH2CH2O(C6H7O5)2(CH3CO)7或R1＝SCH2CH2O(C6H7O5)2(CH3CO)7，R2＝SCH2CH2OH)。

    将巯基乙醇单取代的乙酰化竹红菌乙素麦芽糖单糖苷86毫克(0.07×10-3摩尔)加入到0.10摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中暗处搅拌10小时。然后用盐酸中和，再用氯仿萃取。取氯仿层，用水洗3～4次，再用薄层层析法分离，所用展开液为氯仿-甲醇(体积比5∶1)。最后，用同样的方法纯化，即可得到巯基乙醇单取代的竹红菌乙素麦芽糖单糖苷(如结构IVC或IVD所示，n＝2)。反应产率约为57％。

    此化合物的鉴定：紫外吸收(λmax)：512nm，580nm。红外吸收(νmax)：3412cm-1，1690cm-1，1590cm-1，1100cm-1，1070cm-1，1018cm-1，897cm-1，800cm-1。核磁共振(δ1H)：15.94(s)，15.90(s)，7.90(broad)，6.95(broad)，5.88(d)，5.66(m)，5.30(m)，4.78(m)，4.65(m)，4.34(m)，4.26(m)，4.11(s)，4.06(s)，4.02(s)，4.00(s)，3.98(dd)，3.50(t)，3.29(t)，3.22(dd)，3.10(t)，2.94(t)，2.38(s)，1.96(s)ppm。质谱分析：m/z 1004(M+)。