技术领域
本发明涉及用于检测对宫颈癌的易感性的方法、试剂和试剂盒。具体而言，本发明涉及新的甲基化标记物以改善对子宫颈上皮内瘤变级别2/3的筛查，并且涉及新的甲基化标记物用于在分离样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于瘤变的用途。
背景技术
宫颈癌表征为明确的恶性前期，宫颈上皮内瘤变(CIN)。通过基于人口的筛查方案及其随后的治疗确定这些CIN病变导致宫颈癌发病率和死亡率显著降低1,2。宫颈涂片的细胞学检测是使用最广泛的宫颈癌的筛查方法，但不太理想，因为CIN2及更高级别(CIN2+)的检测灵敏度仅为约55％3-5。宫颈癌发生与高危人乳头瘤病毒(hrHPV)高度相关6。大型随机控制试验表明，hrHPV检测的灵敏度显著高于细胞学检测4,7-10。然而，hrHPV测试的特异性，特别是在年轻筛查人群中，是相对较低的3,11-13，这可能导致妇科医生不必要的转诊、假阳性妇女的焦虑，以及健康护理系统的更高成本。最后，在不久的将来，在以hrHPV接种疫苗引入初级预防的国家中，CIN和宫颈癌的患病率可能会降低。随着该患病率普遍降低，目前筛查测试的阳性预测值将按定义降低14。因此，需要具有高敏感性和高特异性的其他客观的生物标记作为宫颈癌的新的筛查工具。
在相对于(前)恶性病变的正常情况中，不同的DNA甲基化模式代表基于甲基化特异性PCR(MSP)的诊断方法的良好靶标。肿瘤抑制基因的启动子的高甲基化是宫颈癌发生的早期事件，并且因此高甲基化分析对于早期检测宫颈瘤可以是特别相关的15-17。评价宫颈刮片(刮试物，scraping)中的甲基化标记物用于检测CIN和宫颈癌而是可行的17-23。还参见WO2006/007980。然而，寻找具有高灵敏度和高特异性的甲基化标记物仍然是一个挑战。
通过这些年逐渐开发出更精细的方法，以便在全基因组范围内识别新的甲基化标记物24。在其他团队的相似研究中，我们以前报道了我们与再表达相结合而在药理学上揭露启动子区域的经验，如通过OpenArray平台上的微阵列、高通量定量甲基化特异性PCR(QMSP)和甲基-DNA免疫沉淀，随后的微阵列分析(MeDIP)所分析的，这导致基因C13ORF18、JAM3、EPB41L3和TERT的发现和证实21,22,25。也参见WO2009/115615。这些基因的诊断性能表明检测hrHPV阳性人群中的CIN2+的敏感性介于43％-71％之间，且特异性介于89％-100％之间21。然而，迄今为止，发现新的甲基化标记物的策略都是基于癌症和正常组织之间的差异，导致标记物对癌症具有高灵敏度，但对于检测CIN2/3病变的灵敏度太低。在我们的MeDIP研究中，分析了正常情况和CIN3病变的DNA甲基化组。然而，这种技术的缺点在于它主要识别大量高度甲基化的重复DNA，导致特异性较低。
发明内容
因此，本发明人开始确定和验证能够区分正常宫颈和CIN2/3病变的新的甲基化标记物。为此，开发了一种针对CIN2/3病变与正常宫颈组织的DNA的新颖且更特异的创新型全基因组甲基化分析。应用了甲基化-CpG岛恢复测定法(MIRA)，该方法使用人MeCP2的抗体偶联的甲基结合结构域(MBD)以特异性纯化甲基化DNA。与MeDIP分析相比，MBD复合物对双链CpG-甲基化DNA的较高亲和力导致甲基DNA序列富集度更高。随后下一代测序揭示所确定的新甲基化区(MethylCap-seq)。宫颈刮片的诊断评价表明，对于8个新确定的基因，甲基化的相对水平随潜在组织学病变的严重程度而增加。新的甲基化标记能够在来自群体基筛查的hrHPV阳性妇女中有利地应用为分诊测试。据发现，标记物的组合将会提供改进的诊断价值。
在一种实施方式中，本发明提供了在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于肿瘤变的方法，包括测定选自由以下各项组成的组中的至少两种标记基因的甲基化状态：KCNIP4、GATA4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP(本领域也称为AL590705.4)和LHX8。
更具体而言，据发现，这些基因的高甲基化是对于宫颈癌的指示。因此，根据本发明的方法优选包括测定所述标记基因是否为高甲基化，本文中也称为“甲基化阳性”。
以上标记物中的一些已经各自地涉及于疾病中。例如，WO2009/115615公开了一组111个各自的标记物，其中GATA4的甲基化状态与宫颈癌相关。对于各种类型的癌症，KCNIP4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6或ZSCAN1的甲基化状态的分析在本领域中均有报道。然而，它们对宫颈癌预后价值并未公开。现有技术对ANKRD18CP或LHX8的甲基化状态与疾病之间的联系完全没有提及。因此，本发明用于确定宫颈瘤变(CIN2/3)的标记基因组合的预后价值在本领域中并没有公开或说明。
在一种实施方式中，本发明的方法包括测定至少KCNIP4、和/或至少GATA4、和/或至少GFRA1、和/或至少ST6GALNAC5、和/或至少CDH6和/或至少ZSCAN1、和/或至少ANKRD18CP、和/或至少LHX8的甲基化状态。两种甲基化标记物的优选组合包括ANKRD18CP和CDH6；GFRA1和CDH6；以及GFRA1和ANKRD18CP。
可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上查阅对应于所列出基因的登录号。当然，本领域技术人员应当理解的是，也可以根据本发明的方法检测每个基因序列的功能相关的变体。例如，可以根据本发明的方法测定多个剪接变体的甲基化状态。变体序列优选与数据库条目中的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的核苷酸序列同一性。用于确定核苷酸序列同一性百分比的计算机程序在本领域中是可以利用的，包括可获自国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的基于局部比对算法的搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool(BLAST))。
在一种实施方式中，方法包括测定选自由以下各项组成的组中的至少三种，优选至少四种，更优选至少五种标记基因的甲基化状态：KCNIP4、GATA4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8。例如，可以使用每种以下标记基因组合：
·GFRA1、ANKRD18CP和CDH6；
·GFRA1、ANKRD18CP和LHX8。
·GFRA1、CDH6和LHX8。
·GFRA1、CDH6、ANKRD18CP和LHX8。
·GFRA1、CDH6、ZSCAN1和ANKRD18CP。
·GFRA1、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8。
在一个优选的方面，测定了至少KCNIP4、ST6GALNAC5和/或ZSCAN1的甲基化状态。在另一优选的方面中，检测了CDH6、GATA4和LHX8中至少一种的甲基化状态。在还有的另一优选方面中，检测了GFRA1和ANKRD18CP的至少一种，或ANKRD18CP和LHX8的至少一种的甲基化状态。
在一个具体实施方式中，测定了KCNIP4、GATA4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8的甲基化状态。
可能的是使用本发明的方法以在相同的反应中检测多于一个感兴趣的基因。通过使用多个特异性的引物组，可以在相同的反应混合物中进行多种核酸靶的扩增。这可以称为“复合扩增(multiplexing)”。在同一反应中检测感兴趣的基因和参考基因的背景下也能够利用复合扩增。
应当理解的是，本发明的标记物组(marker panel)可以与本领域已知用于确定、诊断、预后和/或筛查宫颈癌的任何标记基因或标记基因组合进行组合或进行补充。参见，例如WO2004/087957、WO2006/007980、WO2009/115615或WO2011/036173。
将新确定的基因与我们先前报道的组(C13ORF18、JAM3、EPB41L3和TERT；参见WO2011/036173)进行组合，令人惊奇地发现，对于组合JAM3/ANKRD18CP、C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP和JAM3/GFRA1/ANKRD18CP，对CIN2+的灵敏度为72％-74％，这与hrHPV测试的CIN2+灵敏度相当(79％)。我们的基因组的特异性为76％-79％，这在阳性Pap涂片测试导致群体基筛查之后，在分诊组中显著高于(p≤0.05)hrHPV测试的特异性(42％)。
因此，在一种实施方式中，标记基因的组进一步包含JAM3、EPB41L3和C13ORF18中的至少一种。例如，它包括测定标记基因的以下组中的至少一种的基因的甲基化状态：
·ANKRD18CP、CDH6和EPB41L3
·GFRA1、EPB41L3和CDH6；
·GFRA1、ANKRD18CP和CDH6；
·GFRA1、EPB41L3和ANKRD18CP；
·JAM3、GFRA1和ANKRD18CP。
本文中还提供了在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于肿瘤变的方法，包括测定至少第一和第二标记基因的组的甲基化状态，其中至少第一标记基因选自由KCNIP4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8组成的组，并且其中至少第二标记基因选自JAM3、EPB41L3和C13ORF18。优选地，标记基因组包含以下标记基因组合中的至少一种：
JAM3/CDH6；ANKRD18CP/CDH6/EPB41L3；GFRA1/EPB41L3/CDH6；
CDH6/EPB41L3；JAM3/EPB41L3/ANKRD18CP；
C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP；GFRA1/EPB41L3/ANKRD18CP；
ANKRD18CP/EPB41L3；C13ORF18/CDH6；JAM3/GFRA1/ANKRD18CP；
C13ORF18/JAM3/EPB41L3；JAM3/ANKRD18CP；
JAM3/EPB41L3/GFRA1；GFRA1/EPB41L3；C13ORF18/JAM3/GFRA1；
JAM3/GFRA1和C13ORF18/ANKRD18CP。
正如下文所示，根据本发明的方法允许以比现有方法提高的灵敏度和/或增加的特异性检测CIN2或更高级别的(CIN2+)宫颈癌。在一种实施方式中，它允许以至少65％、优选至少70％的灵敏度和/或特异性检测CIN2+宫颈癌。例如，灵敏度和特异性都至少为66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％或75％。
待分析的样品可以是宫颈刮片，优选自采集(自我收集，self-collect)的阴道拭子，或其中样品是液基细胞学样品。
甲基化分析的优点是它是一种客观测试，并且它可以在用于hrHPV测试的相同材料上实施，这也使之对于自取样材料很有意义。不同的甲基化标记物已经在hrHPV阳性妇女中作为分诊测试进行了测试。然而，对于大多数标记，设定了一个截止值以获得高特异性。新发现的标记的优点在于不需要截止值。如果PCR产物是阴性的(即没有特异性产物的扩增)，样品就称为阴性，而任何高于零的比率称为阳性。所选择的基因的这个独特特性允许客观的且易于解释的测试。
确定标记基因的甲基化状态的方法在本领域已知的。在一种实施方式中，至少一对寡核苷酸引物设计为不含胞嘧啶，并扩增经修饰和未修饰的序列。随后可以用与修饰序列杂交的引物进行另外的扩增，从而指示甲基化；或者可以进行采用特异性探针的检测步骤，从而指示甲基化。可替代地，扩增可以通过使用甲基化敏感酶与限制性切割相结合；在这种情况下仅扩增甲基化区域。
可替代地，甲基化敏感性的限制性内切核酸酶可以用于检测甲基化的CpG二核苷酸基序。这样的核酸内切酶可以相对于非甲基化识别位点优先切割甲基化的识别位点，或相对于甲基化识别位点优先切割非甲基化的识别位点。或者，可以使用选择性修饰甲基化或非甲基化形式的CpG二核苷酸基序的化学试剂，从而转化CpG-二核苷酸基序。修饰过的产物可以直接检测，或在进一步反应后(其产生容易区分的产物)进行检测。检测到改变的大小和电荷的方法可以用于检测经过修饰的产物，该方法包括但不限于电泳、色谱和质谱。用于选择性修饰的这种化学试剂的实例包括肼和亚硫酸氢根离子。用哌啶可以处理肼修饰的DNA并将其切割。亚硫酸氢根离子处理的DNA可以用碱处理。在本发明的一种实施方式中，通过使至少一部分可应用的基因或其启动子区域与化学试剂接触，并且检测由于接触而产生的产物来检测甲基化，该化学试剂相对于甲基化的胞嘧啶残基选择性修饰非甲基化胞嘧啶残基，或相对于非甲基化胞嘧啶残基选择性地修饰甲基化胞嘧啶残基。在进一步的实施方式中，化学试剂包括亚硫酸氢根离子。在进一步实施方式中，方法进一步包括用碱处理亚硫酸氢根离子接触的基因部分。
依赖于特异性序列的其他检测手段可以使用，包括但不限于电泳、杂交、扩增、定量甲基化特异性PCR(QMSP)、测序、连接酶链式反应、色谱法、质谱法。也可以使用这些技术的组合。
在优选的实施方式中，本发明的方法包括使用甲基化特异性PCR(MSP)测定基因的甲基化状态，优选实时定量甲基化特异性PCR(QMSP)。为了调整DNA输入，有利地计算相对于参照基因，例如β-肌动蛋白或β-连环链蛋白的DNA水平的超甲基化比率。
在具体的方面，甲基化状态使用包含选自表1A的条目1-16的序列，或由选自表1A的条目1-16的序列组成的一组引物和/或包含选自表1B的条目17-24的序列或由选自表1B的条目17-24的序列组成的一组探针进行测定。
在相关的实施方式中，本发明提供了用于宫颈癌检测或筛查的方法，包括以下步骤：a)对包含来自宫颈细胞的宫颈细胞或核酸的测试样品进行细胞学评价；b)如果a)呈阳性，则分析测试选自由KCNIP4、GATA4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8组成的组中的至少两种基因的甲基化状态；c)如果b)的至少两种基因被甲基化，则指示女性进行阴道镜检查；d)如果b)的至少两种基因未甲基化，则指示女性经常进行例行的细胞学测试。
在相关的实施方式中，本发明提供了一种用于宫颈癌检测或筛查的方法，包括以下步骤：a)分析测试选自由KCNIP4、GATA4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8组成的组中的至少两种基因的甲基化状态；b)如果a)的至少两种基因被甲基化，则进行细胞学测试；c)如果b)检测为阳性，则指示女性进行阴道镜检查；d)如果b)为阴性，则指示女性在6个月后跟进进行HPV测试。
本发明还涉及用于在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于瘤变、优选宫颈瘤变(CIN2/3)的试剂盒。本发明试剂盒表征为存在用于选自由KCNIP4、GATA4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8组成的组中的至少两种基因的基因特异性引物；用于至少两种基因的基因特异性探针；和优选用于从受试者，如Ayre刮铲(Ayre’s spatula)和/或宫颈管刷移出宫颈细胞的工具。
在另一实施方式中，试剂盒包含用于至少两种标记基因的基因特异性引物，其中至少第一标记基因选自由KCNIP4、GFRA1、ST6GALNAC5、CDH6、ZSCAN1、ANKRD18CP和LHX8组成的组，并且其中至少第二标记基因选自JAM3、EPB41L3和C13ORF18；用于至少两种基因的基因特异性探针；和可选的用于从受试者移出宫颈细胞的Ayre刮铲和/或子宫颈管刷。
优选地，试剂盒包含用于标记基因以下组合的至少一种的基因特异性引物：
JAM3/CDH6；ANKRD18CP/CDH6/EPB41L3；GFRA1/EPB41L3/CDH6；
CDH6/EPB41L3；JAM3/EPB41L3/ANKRD18CP；
C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP；GFRA1/EPB41L3/ANKRD18CP；
ANKRD18CP/EPB41L3；C13ORF18/CDH6；
JAM3/GFRA1/ANKRD18CP；；GFRA1/CDH6；JAM3/ANKRD18CP；
JAM3/EPB41L3/GFRA1；GFRA1/EPB41L3；C13ORF18/JAM3/GFRA1；
JAM3/GFRA1；和C13ORF18/ANKRD18CP。
用于本发明试剂盒的优选的引物和探针包含选自包含表1A或1B所示的核苷酸序列组成的引物和探针，或由表1A或1B所示的核苷酸序列组成的引物和探针组成。在一种实施方式中，试剂盒包含一种或多种基因特异性引物，该因特异性引物包含选自表1A的条目1-16的序列，或其组成。可替代地或另外地，试剂盒包含至少一种包含基因特异性探针，该基因特异性探针选自表1B的条目17-24的序列或由其组成。
与此相关的是，本发明还提供了由表1A或表1B中列出的核苷酸序列组成的分离的多核苷酸。
试剂盒另外可以包含其甲基化状态与宫颈癌发生率相关的其他基因的基因特异性试剂，优选地其中，其它基因包括JAM3、EPB41L3和/或C13ORF18。
附图说明
图1：用于识别新的CIN2+甲基化标记物的策略的流程图。
图2：在正常(N1)和癌症(Ca)患者刮片中用QMSP测试的9个基因的甲基化比率。甲基化的相对水平在癌刮片中显著更高(所有基因，除了PAX2之外，p<0.001)。
图3：每个基因的甲基化比率的ROC曲线分析。
图4：在来自具有CIN0、CIN1、CIN2、CIN3和(mi)Ca的患者的刮片中用QMSP测试的8个新标记基因中每个的甲基化比率。甲基化的相对水平随着更严重的组织学异常而显著增加(所有p<0.001)。
具体实施方式
实验部分
患者和方法
一般策略
为了表征CIN2/3病变的DNA甲基化并识别出新的CIN2或更高级别(CIN2+)的甲基化标记物，我们应用了以下策略(见图1)：首先，使用人MECP2的MBD来富集甲基化的DNA，并且随后在从18个CIN2/3病变(6个CIN2和12个CIN3)，20个正常宫颈和健康志愿者白细胞DNA的两个库的新鲜冷冻的巨切(macro-dissected)上皮组织的分离的DNA上进行末端配对测序(MethylCap-seq)。为了确定差异甲基化区域(DMR)，我们检索了启动子和外显子区域的读数。我们选择了在正常和CIN2/3宫颈之间显示出显著差异且同时白细胞计数也必须较低的甲基化标记物，以防止假阳性结果。标记物根据高特异性(正常宫颈中未甲基化)和高灵敏度(CIN2/3病变中甲基化)进行分级。对于最高排位前15的基因，设计甲基化特异性PCR(MSP)引物，并在相同的DNA上验证甲基化模式，这最初用于MethylCap-seq。该第一验证步骤通过使MSP带强度与来自MethylCap-seq读数的数量关联并且使之可以验证MethylCap-seq数据。在第二验证步骤中，通过在从完全独立的患者队列(宫颈癌(n＝13)，CIN2/3病变(n＝19)和正常宫颈(n＝17)中分离的DNA上的MSP分析来分析CIN2/3病变中的甲基化高发率和正常子宫颈中的未甲基化。从巨切福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的上皮组织中分离出DNA。
最后，新发现的甲基化标记物的诊断评价通过QMSP在宫颈刮片上进行。首先，我们对来自宫颈癌患者(n＝100)和类似年龄组健康对照(n＝89)的一系列大量随机选择的刮片测试了新生物标记的甲基化比率。其次，参照在基于人口的筛查中的异常Pap涂片，在随机选择的患者的大量的一系列刮片(n＝215)中，评价作为诊断工具的潜在的新甲基化标记物。组织学用作参考标准。
患者样本
转诊到格罗宁根大学医学中心(UMCG)的门诊的具有宫颈癌或在基于人口的筛查中的异常Pap涂片的所有患者，都常规地要求参加我们正在进行的“甲基化研究”，该研究已获得UMCG的机构审查委员会(IRB)批准。宫颈组织、刮片和临床病理数据都预先收集并存储于我们的组织库中。在我们的甲基化研究中，来自正常宫颈的组织样品、刮片和临床病理学数据也从出于非恶性的原因而计划进行子宫切除的患者中收集。用于正常对照组的所有宫颈组织均判定为组织病理学正常。在全身麻醉下采取盆腔检查和活组织检查，涉及宫颈癌的患者根据FIGO标准进行分期。在全身麻醉手术前收集两组(宫颈癌分期和良性妇科手术)的宫颈刮片。所有涉及基于人口的筛查的异常Pap涂片的患者，在专门用于本研究的阴道镜检查之前，进行额外的Pap涂片检查。在阴道镜检查中，进行了活检和/或移行区大环切除(LLETZ)。组织样品由经验丰富的妇科病理学家评分，并且使用组织学分类作为参考标准。如果预期没有常规诊断评价的干预，则回收来自CIN病变的样本并储存于-80℃下。从患者文件中检索临床病理数据，并存储于我们的大型的、匿名的、密码保护的机构妇科肿瘤学数据库中。所有患者都提供书面知情同意书。
对于用于MethylCap-seq分析的冷冻组织样品，CIN2/3患者的中位年龄为35岁(IQR 30-39)，并且对于正常宫颈的患者则为43岁(IQR 41-44)。对于具有FFPE样品的患者独立队列，CIN2/3患者的中位年龄为37岁(IQR 34-41)，对于具有正常宫颈的患者为43岁(IQR 40-44)并且对于宫颈癌患者则为49岁(范围42-54)。对于宫颈刮片，宫颈癌患者的中位年龄为50岁(IQR 39-64)，并且对于具有正常宫颈的患者则为47岁龄(IQR 43-53)。宫颈癌患者的阶段是：1例(1％)FIGO阶段IA1、31例(31％)FIGO阶段IB1、18例(18％)FIGO阶段IB2、21例(21％)FIGO阶段IIA、17例(17％)FIGO阶段IIB、1例(1％)FIGO阶段IIIA、8例(8％)FIGO阶段IIIB和3例(3％)FIGO阶段IV。宫颈癌患者的组织学分类为：70例(70％)鳞状细胞癌(SCC)、21例(21％)腺癌(AD)、3例(3％)腺鳞状细胞癌(ASC)和6例(6％)未分化癌。涉及异常Pap涂片的患者的中位年龄为37岁(IQR 32-43)。这些患者的组织学分类为：27例无CIN、38例CIN1、45例CIN2、61例CIN3和44例miCa(29例SCC、12例AD、3例ASC)。Pap涂片根据Papanicolaou系统分类。表4显示了每个组织学亚组的Pap分类(并翻译为Bethesda)
从用于MethylCap-seq和FFPE样品的所有冷冻组织样品中，切出10μm组织切片并进行巨切以富集上皮细胞。切割前后制作苏木精和署红载玻片并且检查上皮细胞的存在。将宫颈刮片收集于5mL冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS：6.4mM NA2HPO4；1.5mM KH2PO4；0.14M NaCl；2.7mM KCl)中并保持于冰上直到进行进一步处理。在这5mL细胞悬浮液中，1mL用于细胞形态学评价。将剩余的4mL离心，并将细胞沉淀物再悬浮于1mL TRAP洗涤缓冲液中，分成4份。如前面描述的21，将两个级分作为干燥的沉淀物储存于-80℃下用于DNA分离。
DNA分离
使用100％二甲苯，然后用100％乙醇将来自FFPE组织的组织载玻片脱蜡17。如先前描述的21，通过标准过夜的1％SDS和蛋白酶K处理、盐-氯仿提取和异丙醇沉淀，从新鲜冷冻的巨切样品和子宫颈刮片中分离出基因组DNA。DNA沉淀用70％乙醇洗涤，并溶于150μL TE-4(10mM Tris/HCl；0.1mM EDTA，pH8.0)中。基因组DNA根据BIOMED-2方案在多重PCR中进行扩增，以检查DNA的结构完整性27。对于MethylCap-seq样品，使用Quant-iTTM分析测试试剂盒，根据制造商的方案(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)测定DNA的量。对于宫颈刮片，使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)测定DNA浓度和260/280比率。对于所有样品要求260/280比率>1.8。
甲基化-CpG岛DNA捕获后，进行下一代测序(MethylCap-seq)
使用MethylCap试剂盒，根据制造商的说明书(Diagenode，Liège，比利时)，利用甲基结合结构域捕获甲基化DNA片段。试剂盒由人MeCP2的甲基结合结构域(MBD)构成，作为采用含有N-端His6-标记的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的C-端融合物。在捕获之前，使用BioruptorTM UCD-200(Diagenode，Liège，比利时)将DNA样品(500ng)剪切至300-1000bps的大小范围，并分离出约300bp的片段。4个健康对照的白细胞DNA包含于2个样品的2个组中。根据方案(Illumina，San Diego，CA，USA)，将捕获的DNA在Illumina Genome Analyzer II平台上进行配对-末端-测序。使用Bowtie软件将结果映射于核苷酸序列上28，使用BioBix的H2G2浏览器(http://h2g2.ugent.be/)可视化，并使用人参照基因组(NCBI build 37)进行处理。配对-末端片段是独特的，并位于彼此的400bp内29。
MethylCap-测序分析
为了进行统计分析，检索了启动子(转录起始位点-2000bp至+500bp)和外显子区域的读数。为了确定正常宫颈和CIN2/3病变之间的差异，我们将读取数据分为甲基化阳性或甲基化阴性。如果样品显示0或1读数，则样品被认为是阴性的。如果样品显示≥3的读数，则将样品视为甲基化阳性。随后，根据CIN2/3的最高特异性和最高灵敏度对各区进行排位。候选标记应符合以下标准：1)白细胞的低读数/阴性读数以防止假阳性结果。如果两个白细胞样品都显示>1的读数，或如果1个白细胞样品显示>2的读数，则该区就被排除。2)在至少75％(15/20)的正常宫颈组中未甲基化(0或1的读数)。3)至少28％(5/18)的CIN2/3病变组中甲基化(≥3的读数)。
通过甲基化特异性PCR(MSP)检验和验证MethylCap-测序数据
MSP引物设计用于排名前15的基因(16个DMR)。根据EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo，BaseClear，Leiden，Netherlands)的建议，进行分离的基因组DNA的亚硫酸氢钠处理(1μg/样品)。使用源自H2G2浏览器的序列进行MSP设计和分析。每个反应在30μL总反应体积中进行，所述反应体积包含：600nM的各种MSP引物，1.5μL的亚硫酸氢盐处理的DNA(约15ng)，标准PCR组分(Applied Biosystems)和0.5U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)。MSP的条件是：在95℃下热启动10分钟，95℃长达60秒，60℃长达60秒，72℃长达60秒，共40个循环，并且最终延伸步骤在72℃下长达7分钟。使用来自健康女性的白细胞DNA作为阴性对照，并将体外甲基化(通过SssI酶)的白细胞DNA用作每种MSP的阳性对照。
定量甲基化特异性PCR(QMSP)
如我们团队之前描述的，利用内部(FAM-ZEN/IBFQ)标记的杂交探针进行QMSP用于定量分析21。引物和探针序列总结于表1中。β-肌动蛋白用作甲基化独立的内部参照基因。
表1A：定量甲基化特异性PCR(QMSP)中使用的引物和探针序列
表1B：定量甲基化特异性PCR(QMSP)中的探针序列
在10μL终体积中进行QMSP反应，所述终体积中含有：300nM正向和反向引物，250nM杂交探针，5μL 2*QuantiTech Probe PCR Master Mix(Qiagen Hilden，德国)和2.5μL亚硫酸氢盐修饰的DNA(约25ng)。通过7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)一式三份分析每个样品。阴性和阳性对照与对于MSP所使用的相同。在每个孔板上并且通过设置在一系列稀释的体外甲基化白细胞DNA上的每个引物-探针进行标准曲线分析。如果3个孔中至少有2个是甲基化阳性，Ct值低于50，并且DNA输入至少225pgβ-肌动蛋白，则DNA样品被认为是甲基化的。通过以下计算确定感兴趣区域的相对甲基化水平：感兴趣的甲基化区域的平均数量除以参照β-肌动蛋白基因的平均数量并乘以1000030。在我们的分析中，如我们团队先前描述的，我们还包括4个基因(C13ORF18，JAM3，EPB41L3和TERT)以与新确定的甲基化标记物对比这些已知基因的灵敏度和特异性。这些标记如前进行QMSP21。
HPV检测
如先前的报道，使用通用引物介导的PCR(GP5+/6+)进行HrHPV测试。对于HPV分型以及临床相关HPV感染的检测，GP5+/6+阳性病例通过检测。COBAS HPV测试各自检测HPV 16和18，并且同时确定12个另外的hrHPV类型31。在我们的iso-15189-认证的分子病理学实验室中，COBAS HPV检测常规用于来自全国基于人口的筛查的程序的刮片。对于本研究中的检测，仅使用PCR工作流程，因为在中没有液基刮片可用，并且只有已经分离的DNA。该工作流程首先利用从之前在诊断常规中测试的临床样品中分离的DNA来验证，并且这显示出与液基样品相当的结果。
统计分析
使用SPSS软件包(SPSS 20，Chicago，IL，USA)进行统计学分析。Spearman等级相关系数用于比较MethylCap-seq读数与MSP带强度。使用Pearsonχ2测试分析分类的甲基化数据。产生受试者的工作特征(ROC)曲线，并将ROC曲线下的面积(AUC)用作测试性能的量度。曼恩-惠特尼(Mann-Whitney)U检验和克鲁斯卡-沃利斯(Kruskall-Wallis)检验分别用于确定2组或更多组中甲基化比率的差异。学生T检验用于比较阳性甲基化和年龄。的为了相对于hrHPV，通过DNA甲基化标记物比较患者组(涉及异常细胞学)的灵敏度和特异性，进行由Hawass描述的扩展McNemar检验32。低于0.05的P-值在统计学上认为是显著的。
结果
通过MethylCap测序确定差异甲基化基因
全基因组MethylCap-seq用比较CIN2/3发育异常的宫颈细胞与正常宫颈细胞的DNA甲基化谱，以识别出CIN2/3特异性的DMR。在实施我们的标准后，保留了包含163个基因的176个DMR(数据未示出)。
前15个差异甲基化基因的检验(verification)和验证(validation)
为了验证MethylCap-seq数据，选出163组确定的基因中最前面的15个基因。设计MSP引物并对15个基因可以优化出14个基因。所选择的14个基因的验证，对于11个基因表现出MSP带强度与MethylCap-SEQ数据的读数数量之间的显著相关性。一种基因(PCDH17)在白细胞中表现出高甲基化水平，并且因此被排除不进行进一步的验证。剩下的10个基因通过检验，并继续随后的验证步骤。表2显示了何种基因继续通过不同阶段的验证的概况。
表2：排名最高的前15个基因的检验、验证和诊断评价
*由于白细胞中的高甲基化而排除
**相同的基因，不同区域
第二验证步骤通过在DNA上的MSP进行，该DNA来自由13个宫颈癌、19个HSIL病变(8个CIN2、8个CIN3和3个adCIS)和17个正常宫颈组成的、独立的、随机选择的新患者队列的FFPE组织。所分析的10个基因中的9个基因在正常样品中表现出低的甲基化水平，在正常相对于HSIL病变之间存在的显著的差异甲基化，并且在白细胞中再次表现出极少至没有甲基化(P<0.05)(表3)。选择这9个基因(ZSCAN1、ST6GALNAC5、ANKRD18CP、PAX2、CDH6、GFRA1、GATA4、KCNIP4和LHX8)用于在宫颈刮片中进行进一步的诊断评价(表3)。
表3：FFPE样品的外部队列中的甲基化阳性以验证CIN2+病变中的高甲基化和新近发现的标记物在正常宫颈中的无甲基化的结果。
基因 正常 CIN2 CIN3 adCIS 癌 ZSCAN1 4/16 8/8 7/8 3/3 12/13 ST6GALNAC5 0/16 1/6 4/8 2/3 9/12 ANKRD18CP 0/16 1/8 1/7 2/3 6/12 PAX2 1/14 6/8 7/8 3/3 5/13 CDH6 1/15 3/8 4/8 3/3 7/13 GFRA1 0/12 2/8 3/8 2/3 10/12 POU4F3* 2/14 6/7 3/7 3/3 11/12 GATA4 0/17 3/8 2/7 3/3 10/13 KCNIP4 0/17 6/8 5/8 3/3 10/12 LHX8 1/16 3/8 4/8 3/3 7/13
*由于白细胞中高甲基化而排除
对于相对于癌刮片的正常的刮片，通过QMSP的诊断评价
为了评价新甲基化标记物的诊断价值，使用了两个队列的患者的宫颈刮片：1)相对于癌刮片的正常刮片和2)来自涉及利用异常Pap涂片(≥Pap2)的基于人口的筛查的患者的刮片。
在第1组中，使用了100个随机抽取的宫颈癌患者和89个具有组织学证实的正常宫颈的患者的刮片。QMSP分析表明，相对于正常刮片在癌刮片中DNA甲基化的相关水平更高，9个所选基因有8个(P<0.001)(图2)。宫颈癌中对于甲基化率的曲线下的面积(AUC)表明对于8个基因，AUC>0.91，并且对于1个基因(PAX2)，AUC＝0.59。因此，根据进一步分析，PAX2排除在外(图3)。在具有正常宫颈的女性中，对于所有9个基因的甲基化阳性与年龄无关(未显示数据)。
对于正常/LSIL相对于HSIL刮片，通过QMSP诊断评价
在队列2中，使用了215例涉及采用异常Pap涂片的基于人口的筛查的患者的连续刮片。8个表现出正常刮片相对于癌症刮片的差异甲基化的基因，随后在队列2中进行测试。对于所有8个所分析的基因(ZSCAN1、ST6GALNAC5、ANKRD18CP、CDH6、GFRA1、GATA4、KCNIP4和LHX8)的甲基化水平和频率，随着潜在的组织学病变的严重程度(p<0.001)增加(图4和表4)。
在没有为实现较高/较低的灵敏度和/或特异性设定截止值的情况下，基因ZSCAN1、ST6GALNAC5和KCNIP4对于检测CIN2+病变达到高灵敏度(≥90％)，而CDH6、GATA4和LHX8对于CIN2+的灵敏度为73％-84％(表5A)。ANKRD18CP和GFRA1对于CIN2+的灵敏度为46％-61％，并且这些基因尤其表现出高特异性(82％至92％)。在我们的分析中，如先前我们团队所描述的，我们也包括了4个的基因的标记物组(C13ORF18、JAM3、EPB41L3和TERT)以比较这些已知基因与新确定的甲基化标记物的灵敏度和特异性。C13ORF18基因显示出如先前描述的可再现的结果21，具有高特异性(95％)并且对于CIN2+具有40％的相对低的灵敏度。JAM3和EPB41L3对于CIN2+显示出63％-69％的灵敏度和79％-91％的特异性。TERT基因先前已经描述为具有高的特异性，但由于特异性在我们的分析中仅46％，这样的结果无法再现，而对于CIN2+病变灵敏度却为82％。
hrHPV状态和分诊测试
对涉及基于人口筛查的异常组织学的患者人群进行HrHPV测试。对于215例患者中的6个，没有足够的材料可用于实施HPV检测。通过GP5+/6+PCR和COBAS HPV测试在152/209(73％)的样品中检测hrHPV。表4示出了相对于基础组织学诊断的HPV状态。hrHPV存在于12/26(46％)无CIN病变的患者、24/36(67％)CIN1患者、36/45(80％)CIN2患者、49/59(83％)CIN3患者和31/43(72％)具有miCa的患者中。hrHPV测试对于CIN2+的灵敏度为79％，并且特异性为42％。
表4.根据每个组织学亚组的巴氏(Papanicolaou)系统(贝塞斯达(Bethesda)系统)的细胞学。在来自患者(具有CIN0、CIN1、CIN2、CIN3和(mi)Ca)的宫颈刮片(n＝215)中，采用QMSP测试8个新甲基化标记物和4个已知的标记的甲基化和HPV阳性。
对于CDH6、GATA4和LHX8基因，灵敏度和特异性结果相当于hrHPV测试对于CIN2+的73％-84％的灵敏度和40％-60％的特异性(表5A)。
表5A.在涉及采用异常Pap涂片的人群基筛查的患者的宫颈刮片(n＝215)中对于CIN2+和CIN3+的灵敏度和特异性结果
表5B示出了在hrHPV阳性女性的刮片(n＝152)中对于CIN2+和CIN3+的灵敏度和特异性，这相当于对于整个组的结果，正如表5a中所示。基因ZSCAN1、ST6GALNAC5和KCNIP4对于CIN2+的检测再次表现出高灵敏度(≥92％)，并且同时对于CDH6、GATA4、EPB41L3、TERT和ZSCAN16的灵敏度为72％-85％。然而，ANKRD18CP、JAM3、C13ORF18和GFRA1对于CIN2+敏感性为43％至68％，然而，这些基因表现出86％-94％的高特异性。在目前荷兰人口基础的筛查程序中，具有pap2/pap3a(ASCUS/LSIL)刮片的女性在6个月后通过hrHPV，利用分诊测试进行重新测试。因此，通过在该组中的hrHPV和甲基化标记物，我们也示出了分诊测试的结果(表5B)。通过hrHPV的分诊测试表现出对于CIN2+灵敏度为82％及特异性为41％；GATA4、LHX8和TERT显示出相当的结果。
表5B.在hrHPV阳性女性的刮片(n＝152)中和在Pap2/Pap3a(ASCUS/LSIL)患者的刮片(n＝124)中对于CIN2+和CIN3+的灵敏度和特异性结果。
分析基因的不同组合，以找到具有最高的组合灵敏度和特异性的最佳的甲基化标记物组。对于这种分析，如果在测试的组合中任一基因呈阳性，则样品就认为是阳性的。通过在组合中加入不止3种基因，甲基化测试的特异性降低，灵敏度发生最小增加。对于CIN2+具有最高的灵敏度和特异性组合的基因组合是JAM3/ANKRD18CP、C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP和JAM3/GFRA1/ANKRD18CP，分别具有72％、74％和73％的灵敏度，这相当于hrHPV测试(79％)。两个组合的特异性为71％和76％，这显著高于hrHPV测试(42％)(P≤0.05)特异性。表6显示了对于所有其它组合，用于检测CIN2+病变的灵敏度为64％-80％，并且组合特异性为58％-88％。
表6.不同的甲基化标记物的组合，用于产生级别为最高灵敏度的最适合作为刮片中的测试的基因的组(n＝215)。
在hrHPV阳性刮片中，对于CIN2+的3个最佳性能组合(JAM3/ANKRD18CP、C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP和JAM3/GFRA1/ANKRD18CP)的灵敏度和特异性与总人群是相当的(灵敏度：76％-77％；特异性：81％-83％)(表7)。
表7.不同的甲基化标记物的组合，用于产生级别为最高灵敏度的最适合作为HPV阳性刮片的测试的基因的组(n＝152)。
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