宫颈癌的生物标记物.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201580063278.6 (22)申请日 2015.09.21 (30)优先权数据 14185831.6 2014.09.22 EP (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2017.05.22 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/NL2015/050650 2015.09.21 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2016/048138 EN 2016.03.31 (71)申请人 格罗宁根大学 地址 荷兰格罗宁根 申请人 格罗宁根医学医院 (72)发明人 海斯贝塔巴伦

2、蒂娜阿莉达维 斯曼 阿特赫拉德扬范德泽 爱德华杜斯玛丽亚多米尼克 斯斯胡林 (74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 11240 代理人 张英宫传芝 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 宫颈癌的生物标记物 (57)摘要 本发明涉及用于检测针对宫颈癌的易感性 的方法、 试剂和试剂盒。 特别地， 本发明涉及新型 甲基化标记物以改进对于宫颈上皮内瘤变级别 2/3(CIN2/3)的筛查， 并且涉及新型甲基化标记 物在分离的样品中用于鉴定宫颈细胞为肿瘤或 倾向于瘤变的用途。 权利要求书2页 说明书19页 附图5页 CN 107002136 A

3、2017.08.01 CN 107002136 A 1.一种在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤细胞或倾向于瘤变的方法， 包括测定至少 两种选自由以下各项组成的组中的标记基因的甲基化状态： KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8。 2.根据权利要求1所述的方法， 包括测定所述标记基因是否为高甲基化的。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 包括测定至少三种、 优选至少四种、 更优选至少五种 选自由以下各项组成组中的标记基因的甲基化状态： KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、

4、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法， 包括测定至少KCNIP4、 ST6GALNAC5和/或 ZSCAN1的所述甲基化状态。 5.根据前述权利要求中任一项所述的方法， 包括测定CDH6、 GATA4和LHX8中的至少一种 的所述甲基化状态。 6.根据前述权利要求中任一项所述的方法， 包括测定KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8的所述甲基化状态。 7.根据前述权利要求中任一项所述的方法， 其中所述标记基因的组还包括JAM3、 EPB41L3和C13ORF

5、18中的至少一种。 8.根据权利要求7所述的方法， 包括测定以下标记基因的组中的至少一种的基因的甲 基化状态： ANKRD18CP/CDH6/EPB41L3； GFRA1/EPB41L3/CDH6； GFRA1/ANKRD18CP/CDH6； ANKRD18CP/ CDH6； GFRA1/EPB41L3/ANKRD18CP； JAM3/GFRA1/ANKRD18CP； GFRA1/CDH6； 和GFRA1/ ANKRD18CP。 9.一种在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤细胞或倾向于瘤变的方法， 包括测定至少 两种标记基因的组的甲基化状态， 其中至少第一标记基因选自由以下各项组成的组： KCNI

6、P4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8， 并且其中至少第二标记基因 选自JAM3、 EPB41L3和C13ORF18， 优选地其中， 所述标记基因组包含以下标记基因的组合中 的至少一种： JAM3/CDH6； ANKRD18CP/CDH6/EPB41L3； GFRA1/EPB41L3/CDH6； CDH6/EPB41L3； JAM3/ EPB41L3/ANKRD18CP； C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP； GFRA1/EPB41L3/ANKRD18CP； ANKRD18CP/ EPB41L3； C13ORF18/C

7、DH6； JAM3/GFRA1/ANKRD18CP； ； GFRA1/CDH6； JAM3/ANKRD18CP； JAM3/ EPB41L3/GFRA1； GFRA1/EPB41L3； C13ORF18/JAM3/GFRA1； JAM3/GFRA1； 和C13ORF18/ ANKRD18CP。 10.根据前述权利要求中任一项所述的方法， 其中所述方法允许以至少65、 优选至少 70的灵敏度和/或特异性检测CIN2或更高级别的(CIN2+)宫颈癌。 11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法， 其中所述基因的甲基化状态使用甲基化 特异性PCR(MSP)、 优选定量甲基化特异性PCR(QMSP)

8、进行测定。 12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法， 其中所述甲基化状态使用一组引物和/ 或探针进行测定， 所述引物包含选自表1A的条目1至16的序列或由其组成， 所述探针包含选 自表1B的条目17至24的序列或由其组成。 13.根据前述权利要求中任一项所述的方法， 其中所述样品是宫颈刮片、 优选自采集的 阴道拭子， 或者其中， 所述样品是液基细胞学样品。 权利要求书 1/2 页 2 CN 107002136 A 2 14.一种试剂盒， 用于在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤细胞或倾向于瘤变、 优选宫 颈瘤变(CIN2/3)的用途， 所述试剂盒包括： -基因特异性引物， 用于选自由以下各项

9、组成的组中的至少两种标记基因： KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8； -基因特异性探针， 用于所述至少两种标记基因； -可选的Ayre刮铲和/或宫颈管刷， 用于从受试者移出宫颈细胞。 15.一种试剂盒， 用于在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤细胞或倾向于瘤变、 优选宫 颈瘤变(CIN2/3)的用途， 所述试剂盒包括： -基因特异性引物， 用于至少两种标记基因， 其中至少第一标记基因选自由以下各项组 成的组： KCNIP4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP

10、和LHX8， 并且其中， 至少第二 标记基因选自JAM3、 EPB41L3和C13ORF18， -基因特异性探针， 用于所述至少两种标记基因； -可选的Ayre刮铲和/或宫颈管刷， 用于从受试者移出颈部细胞。 16.根据权利要求15所述的试剂盒， 包括用于标记基因的以下组合中的至少一种的基 因特异性引物： JAM3/CDH6； ANKRD18CP/CDH6/EPB41L3； GFRA1/EPB41L3/CDH6； CDH6/EPB41L3； JAM3/ EPB41L3/ANKRD18CP； C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP； GFRA1/EPB41L3/ANKRD18CP； AN

11、KRD18CP/ EPB41L3； C13ORF18/CDH6； JAM3/GFRA1/ANKRD18CP； ； GFRA1/CDH6； JAM3/ANKRD18CP； JAM3/ EPB41L3/GFRA1； GFRA1/EPB41L3； C13ORF18/JAM3/GFRA1； JAM3/GFRA1； 和C13ORF18/ ANKRD18CP。 17.根据权利要求14至16中任一项所述的试剂盒， 包括至少一种基因特异性引物， 所述 基因特异性引物包含选自表1A的条目1至16的序列或由其组成。 18.根据权利要求14至17中任一项所述的试剂盒， 包括至少一种基因特异性探针， 所述 基因特异性

12、探针包含选自表1B的条目17至24的序列或由其组成。 19.根据权利要求14至18中任一项所述的试剂盒， 另外包括用于其它基因的基因特异 性试剂， 所述其它基因的甲基化状态与宫颈癌的发生相关， 优选地其中， 所述其它基因包括 JAM3、 EPB41L3和/或C13ORF18。 20.一种用于宫颈癌检测或筛查的方法， 包括以下步骤： a)对包含宫颈细胞或来自宫颈 细胞的核酸的测试样品进行细胞学评价； b)如果a)为阳性， 则分析测定选自由以下各项组 成的组中的至少两种基因的甲基化状态： KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18

13、CP和LHX8； c)如果b)的所述至少两种基因甲基化， 则指示女性进行阴道镜检测； d) 如果b)的所述至少两种基因未甲基化， 则指示女性经常定期进行细胞学检测。 21.一种用于宫颈癌检测或筛查的方法， 包括以下步骤： a)分析测定选自由以下各项组 成的组中的至少两种基因的甲基化状态： KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8； b)如果a)的所述至少两种基因被甲基化， 则进行细胞学检测； c)如果b) 检测为阳性， 则指示女性进行阴道镜检测； d)如果b)为阴性， 则指示女性在6个月后跟进进 行HPV检测。

14、 权利要求书 2/2 页 3 CN 107002136 A 3 宫颈癌的生物标记物 技术领域 0001 本发明涉及用于检测对宫颈癌的易感性的方法、 试剂和试剂盒。 具体而言， 本发明 涉及新的甲基化标记物以改善对子宫颈上皮内瘤变级别2/3的筛查， 并且涉及新的甲基化 标记物用于在分离样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于瘤变的用途。 背景技术 0002 宫颈癌表征为明确的恶性前期， 宫颈上皮内瘤变(CIN)。 通过基于人口的筛查方案 及其随后的治疗确定这些CIN病变导致宫颈癌发病率和死亡率显著降低1,2。 宫颈涂片的细 胞学检测是使用最广泛的宫颈癌的筛查方法， 但不太理想， 因为CIN2及更高级别(

15、CIN2+)的 检测灵敏度仅为约553-5。 宫颈癌发生与高危人乳头瘤病毒(hrHPV)高度相关6。 大型随机 控制试验表明， hrHPV检测的灵敏度显著高于细胞学检测4,7-10。 然而， hrHPV测试的特异性， 特别是在年轻筛查人群中， 是相对较低的3,11-13， 这可能导致妇科医生不必要的转诊、 假阳 性妇女的焦虑， 以及健康护理系统的更高成本。 最后， 在不久的将来， 在以hrHPV接种疫苗引 入初级预防的国家中， CIN和宫颈癌的患病率可能会降低。 随着该患病率普遍降低， 目前筛 查测试的阳性预测值将按定义降低14。 因此， 需要具有高敏感性和高特异性的其他客观的生 物标记作为宫

16、颈癌的新的筛查工具。 0003 在相对于(前)恶性病变的正常情况中， 不同的DNA甲基化模式代表基于甲基化特 异性PCR(MSP)的诊断方法的良好靶标。 肿瘤抑制基因的启动子的高甲基化是宫颈癌发生的 早期事件， 并且因此高甲基化分析对于早期检测宫颈瘤可以是特别相关的15-17。 评价宫颈刮 片(刮试物， scraping)中的甲基化标记物用于检测CIN和宫颈癌而是可行的17-23。 还参见 WO2006/007980。 然而， 寻找具有高灵敏度和高特异性的甲基化标记物仍然是一个挑战。 0004 通过这些年逐渐开发出更精细的方法， 以便在全基因组范围内识别新的甲基化标 记物24。 在其他团队的相

17、似研究中， 我们以前报道了我们与再表达相结合而在药理学上揭露 启动子区域的经验， 如通过OpenArray平台上的微阵列、 高通量定量甲基化特异性PCR (QMSP)和甲基-DNA免疫沉淀， 随后的微阵列分析(MeDIP)所分析的， 这导致基因C13ORF18、 JAM3、 EPB41L3和TERT的发现和证实21,22,25。 也参见WO2009/115615。 这些基因的诊断性能表 明检测hrHPV阳性人群中的CIN2+的敏感性介于43-71之间， 且特异性介于89-100 之间21。 然而， 迄今为止， 发现新的甲基化标记物的策略都是基于癌症和正常组织之间的差 异， 导致标记物对癌症具有

18、高灵敏度， 但对于检测CIN2/3病变的灵敏度太低。 在我们的 MeDIP研究中， 分析了正常情况和CIN3病变的DNA甲基化组。 然而， 这种技术的缺点在于它主 要识别大量高度甲基化的重复DNA， 导致特异性较低。 发明内容 0005 因此， 本发明人开始确定和验证能够区分正常宫颈和CIN2/3病变的新的甲基化标 记物。 为此， 开发了一种针对CIN2/3病变与正常宫颈组织的DNA的新颖且更特异的创新型全 基因组甲基化分析。 应用了甲基化-CpG岛恢复测定法(MIRA)， 该方法使用人MeCP2的抗体偶 说明书 1/19 页 4 CN 107002136 A 4 联的甲基结合结构域(MBD)

19、以特异性纯化甲基化DNA。 与MeDIP分析相比， MBD复合物对双链 CpG-甲基化DNA的较高亲和力导致甲基DNA序列富集度更高。 随后下一代测序揭示所确定的 新甲基化区(MethylCap-seq)。 宫颈刮片的诊断评价表明， 对于8个新确定的基因， 甲基化的 相对水平随潜在组织学病变的严重程度而增加。 新的甲基化标记能够在来自群体基筛查的 hrHPV阳性妇女中有利地应用为分诊测试。 据发现， 标记物的组合将会提供改进的诊断价 值。 0006 在一种实施方式中， 本发明提供了在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于 肿瘤变的方法， 包括测定选自由以下各项组成的组中的至少两种标记基因的甲基

20、化状态： KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP(本领域也称为AL590705.4)和 LHX8。 0007 更具体而言， 据发现， 这些基因的高甲基化是对于宫颈癌的指示。 因此， 根据本发 明的方法优选包括测定所述标记基因是否为高甲基化， 本文中也称为 “甲基化阳性” 。 0008 以上标记物中的一些已经各自地涉及于疾病中。 例如， WO2009/115615公开了一组 111个各自的标记物， 其中GATA4的甲基化状态与宫颈癌相关。 对于各种类型的癌症， KCNIP4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH

21、6或ZSCAN1的甲基化状态的分析在本领域中均有报道。 然 而， 它们对宫颈癌预后价值并未公开。 现有技术对ANKRD18CP或LHX8的甲基化状态与疾病之 间的联系完全没有提及。 因此， 本发明用于确定宫颈瘤变(CIN2/3)的标记基因组合的预后 价值在本领域中并没有公开或说明。 0009 在一种实施方式中， 本发明的方法包括测定至少KCNIP4、 和/或至少GATA4、 和/或 至少GFRA1、 和/或至少ST6GALNAC5、 和/或至少CDH6和/或至少ZSCAN1、 和/或至少 ANKRD18CP、 和/或至少LHX8的甲基化状态。 两种甲基化标记物的优选组合包括ANKRD18CP和

22、 CDH6； GFRA1和CDH6； 以及GFRA1和ANKRD18CP。 0010 可以在http:/www.ncbi.nlm.nih.gov上查阅对应于所列出基因的登录号。 当然， 本领域技术人员应当理解的是， 也可以根据本发明的方法检测每个基因序列的功能相关的 变体。 例如， 可以根据本发明的方法测定多个剪接变体的甲基化状态。 变体序列优选与数据 库条目中的核苷酸序列具有至少90、 至少91、 至少92、 至少93、 至少94、 至少 95、 至少96、 至少97、 至少98、 或至少99的核苷酸序列同一性。 用于确定核苷酸序 列同一性百分比的计算机程序在本领域中是可以利用的， 包括可获

23、自国立生物技术信息中 心(National Center for Biotechnology Information)的基于局部比对算法的搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)。 0011 在一种实施方式中， 方法包括测定选自由以下各项组成的组中的至少三种， 优选 至少四种， 更优选至少五种标记基因的甲基化状态： KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8。 例如， 可以使用每种以下标记基因组合： 0012GFRA1、 ANKRD18CP和CDH6； 0013

24、GFRA1、 ANKRD18CP和LHX8。 0014GFRA1、 CDH6和LHX8。 0015GFRA1、 CDH6、 ANKRD18CP和LHX8。 0016GFRA1、 CDH6、 ZSCAN1和ANKRD18CP。 0017GFRA1、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8。 说明书 2/19 页 5 CN 107002136 A 5 0018 在一个优选的方面， 测定了至少KCNIP4、 ST6GALNAC5和/或ZSCAN1的甲基化状态。 在另一优选的方面中， 检测了CDH6、 GATA4和LHX8中至少一种的甲基化状态。 在还有的另一 优选方面中， 检测了G

25、FRA1和ANKRD18CP的至少一种， 或ANKRD18CP和LHX8的至少一种的甲基 化状态。 0019 在一个具体实施方式中， 测定了KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8的甲基化状态。 0020 可能的是使用本发明的方法以在相同的反应中检测多于一个感兴趣的基因。 通过 使用多个特异性的引物组， 可以在相同的反应混合物中进行多种核酸靶的扩增。 这可以称 为 “复合扩增(multiplexing)” 。 在同一反应中检测感兴趣的基因和参考基因的背景下也能 够利用复合扩增。 0021 应当理解的是， 本发明

26、的标记物组(marker panel)可以与本领域已知用于确定、 诊断、 预后和/或筛查宫颈癌的任何标记基因或标记基因组合进行组合或进行补充。 参见， 例如WO2004/087957、 WO2006/007980、 WO2009/115615或WO2011/036173。 0022 将新确定的基因与我们先前报道的组(C13ORF18、 JAM3、 EPB41L3和TERT； 参见 WO2011/036173)进行组合， 令人惊奇地发现， 对于组合JAM3/ANKRD18CP、 C13ORF18/JAM3/ ANKRD18CP和JAM3/GFRA1/ANKRD18CP， 对CIN2+的灵敏度为7

27、2-74， 这与hrHPV测试的 CIN2+灵敏度相当(79)。 我们的基因组的特异性为76-79， 这在阳性Pap涂片测试导致 群体基筛查之后， 在分诊组中显著高于(p0.05)hrHPV测试的特异性(42)。 0023 因此， 在一种实施方式中， 标记基因的组进一步包含JAM3、 EPB41L3和C13ORF18中 的至少一种。 例如， 它包括测定标记基因的以下组中的至少一种的基因的甲基化状态： 0024ANKRD18CP、 CDH6和EPB41L3 0025GFRA1、 EPB41L3和CDH6； 0026GFRA1、 ANKRD18CP和CDH6； 0027GFRA1、 EPB41L3

28、和ANKRD18CP； 0028JAM3、 GFRA1和ANKRD18CP。 0029 本文中还提供了在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于肿瘤变的方法， 包 括测定至少第一和第二标记基因的组的甲基化状态， 其中至少第一标记基因选自由 KCNIP4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8组成的组， 并且其中至少第二 标记基因选自JAM3、 EPB41L3和C13ORF18。 优选地， 标记基因组包含以下标记基因组合中的 至少一种： 0030 JAM3/CDH6； ANKRD18CP/CDH6/EPB41L3； GFRA1/EPB41L

29、3/CDH6； 0031 CDH6/EPB41L3； JAM3/EPB41L3/ANKRD18CP； 0032 C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP； GFRA1/EPB41L3/ANKRD18CP； 0033 ANKRD18CP/EPB41L3； C13ORF18/CDH6； JAM3/GFRA1/ANKRD18CP； 0034 C13ORF18/JAM3/EPB41L3； JAM3/ANKRD18CP； 0035 JAM3/EPB41L3/GFRA1； GFRA1/EPB41L3； C13ORF18/JAM3/GFRA1； 0036 JAM3/GFRA1和C13ORF18/ANK

30、RD18CP。 0037 正如下文所示， 根据本发明的方法允许以比现有方法提高的灵敏度和/或增加的 特异性检测CIN2或更高级别的(CIN2+)宫颈癌。 在一种实施方式中， 它允许以至少65、 优 说明书 3/19 页 6 CN 107002136 A 6 选至少70的灵敏度和/或特异性检测CIN2+宫颈癌。 例如， 灵敏度和特异性都至少为66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74或75。 0038 待分析的样品可以是宫颈刮片， 优选自采集(自我收集， self-collect)的阴道拭 子， 或其中样品是液基细胞学样品。 0039 甲基化分析的优点是它是一种客观测试

31、， 并且它可以在用于hrHPV测试的相同材 料上实施， 这也使之对于自取样材料很有意义。 不同的甲基化标记物已经在hrHPV阳性妇女 中作为分诊测试进行了测试。 然而， 对于大多数标记， 设定了一个截止值以获得高特异性。 新发现的标记的优点在于不需要截止值。 如果PCR产物是阴性的(即没有特异性产物的扩 增)， 样品就称为阴性， 而任何高于零的比率称为阳性。 所选择的基因的这个独特特性允许 客观的且易于解释的测试。 0040 确定标记基因的甲基化状态的方法在本领域已知的。 在一种实施方式中， 至少一 对寡核苷酸引物设计为不含胞嘧啶， 并扩增经修饰和未修饰的序列。 随后可以用与修饰序 列杂交的引

32、物进行另外的扩增， 从而指示甲基化； 或者可以进行采用特异性探针的检测步 骤， 从而指示甲基化。 可替代地， 扩增可以通过使用甲基化敏感酶与限制性切割相结合； 在 这种情况下仅扩增甲基化区域。 0041 可替代地， 甲基化敏感性的限制性内切核酸酶可以用于检测甲基化的CpG二核苷 酸基序。 这样的核酸内切酶可以相对于非甲基化识别位点优先切割甲基化的识别位点， 或 相对于甲基化识别位点优先切割非甲基化的识别位点。 或者， 可以使用选择性修饰甲基化 或非甲基化形式的CpG二核苷酸基序的化学试剂， 从而转化CpG-二核苷酸基序。 修饰过的产 物可以直接检测， 或在进一步反应后(其产生容易区分的产物)进

33、行检测。 检测到改变的大 小和电荷的方法可以用于检测经过修饰的产物， 该方法包括但不限于电泳、 色谱和质谱。 用 于选择性修饰的这种化学试剂的实例包括肼和亚硫酸氢根离子。 用哌啶可以处理肼修饰的 DNA并将其切割。 亚硫酸氢根离子处理的DNA可以用碱处理。 在本发明的一种实施方式中， 通 过使至少一部分可应用的基因或其启动子区域与化学试剂接触， 并且检测由于接触而产生 的产物来检测甲基化， 该化学试剂相对于甲基化的胞嘧啶残基选择性修饰非甲基化胞嘧啶 残基， 或相对于非甲基化胞嘧啶残基选择性地修饰甲基化胞嘧啶残基。 在进一步的实施方 式中， 化学试剂包括亚硫酸氢根离子。 在进一步实施方式中， 方

34、法进一步包括用碱处理亚硫 酸氢根离子接触的基因部分。 0042 依赖于特异性序列的其他检测手段可以使用， 包括但不限于电泳、 杂交、 扩增、 定 量甲基化特异性PCR(QMSP)、 测序、 连接酶链式反应、 色谱法、 质谱法。 也可以使用这些技术 的组合。 0043 在优选的实施方式中， 本发明的方法包括使用甲基化特异性PCR(MSP)测定基因的 甲基化状态， 优选实时定量甲基化特异性PCR(QMSP)。 为了调整DNA输入， 有利地计算相对于 参照基因， 例如 -肌动蛋白或 -连环链蛋白的DNA水平的超甲基化比率。 0044 在具体的方面， 甲基化状态使用包含选自表1A的条目1-16的序列，

35、 或由选自表1A 的条目1-16的序列组成的一组引物和/或包含选自表1B的条目17-24的序列或由选自表1B 的条目17-24的序列组成的一组探针进行测定。 0045 在相关的实施方式中， 本发明提供了用于宫颈癌检测或筛查的方法， 包括以下步 骤： a)对包含来自宫颈细胞的宫颈细胞或核酸的测试样品进行细胞学评价； b)如果a)呈阳 说明书 4/19 页 7 CN 107002136 A 7 性， 则分析测试选自由KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8 组成的组中的至少两种基因的甲基化状态； c)如果b)的至少

36、两种基因被甲基化， 则指示女 性进行阴道镜检查； d)如果b)的至少两种基因未甲基化， 则指示女性经常进行例行的细胞 学测试。 0046 在相关的实施方式中， 本发明提供了一种用于宫颈癌检测或筛查的方法， 包括以 下步骤： a)分析测试选自由KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和 LHX8组成的组中的至少两种基因的甲基化状态； b)如果a)的至少两种基因被甲基化， 则进 行细胞学测试； c)如果b)检测为阳性， 则指示女性进行阴道镜检查； d)如果b)为阴性， 则指 示女性在6个月后跟进进行HPV测试。 0047 本

37、发明还涉及用于在分离的样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于瘤变、 优选宫颈 瘤变(CIN2/3)的试剂盒。 本发明试剂盒表征为存在用于选自由KCNIP4、 GATA4、 GFRA1、 ST6GALNAC5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8组成的组中的至少两种基因的基因特异性引 物； 用于至少两种基因的基因特异性探针； 和优选用于从受试者， 如Ayre刮铲(Ayre s spatula)和/或宫颈管刷移出宫颈细胞的工具。 0048 在另一实施方式中， 试剂盒包含用于至少两种标记基因的基因特异性引物， 其中 至少第一标记基因选自由KCNIP4、 GFRA1、 ST6GALNA

38、C5、 CDH6、 ZSCAN1、 ANKRD18CP和LHX8组成 的组， 并且其中至少第二标记基因选自JAM3、 EPB41L3和C13ORF18； 用于至少两种基因的基 因特异性探针； 和可选的用于从受试者移出宫颈细胞的Ayre刮铲和/或子宫颈管刷。 0049 优选地， 试剂盒包含用于标记基因以下组合的至少一种的基因特异性引物： 0050 JAM3/CDH6； ANKRD18CP/CDH6/EPB41L3； GFRA1/EPB41L3/CDH6； 0051 CDH6/EPB41L3； JAM3/EPB41L3/ANKRD18CP； 0052 C13ORF18/JAM3/ANKRD18CP

39、； GFRA1/EPB41L3/ANKRD18CP； 0053 ANKRD18CP/EPB41L3； C13ORF18/CDH6； 0054 JAM3/GFRA1/ANKRD18CP； ； GFRA1/CDH6； JAM3/ANKRD18CP； 0055 JAM3/EPB41L3/GFRA1； GFRA1/EPB41L3； C13ORF18/JAM3/GFRA1； 0056 JAM3/GFRA1； 和C13ORF18/ANKRD18CP。 0057 用于本发明试剂盒的优选的引物和探针包含选自包含表1A或1B所示的核苷酸序 列组成的引物和探针， 或由表1A或1B所示的核苷酸序列组成的引物和探针组

40、成。 在一种实 施方式中， 试剂盒包含一种或多种基因特异性引物， 该因特异性引物包含选自表1A的条目 1-16的序列， 或其组成。 可替代地或另外地， 试剂盒包含至少一种包含基因特异性探针， 该 基因特异性探针选自表1B的条目17-24的序列或由其组成。 0058 与此相关的是， 本发明还提供了由表1A或表1B中列出的核苷酸序列组成的分离的 多核苷酸。 0059 试剂盒另外可以包含其甲基化状态与宫颈癌发生率相关的其他基因的基因特异 性试剂， 优选地其中， 其它基因包括JAM3、 EPB41L3和/或C13ORF18。 附图说明 0060 图1： 用于识别新的CIN2+甲基化标记物的策略的流程图

41、。 0061 图2： 在正常(N1)和癌症(Ca)患者刮片中用QMSP测试的9个基因的甲基化比率。 甲 说明书 5/19 页 8 CN 107002136 A 8 基化的相对水平在癌刮片中显著更高(所有基因， 除了PAX2之外， p0.001)。 0062 图3： 每个基因的甲基化比率的ROC曲线分析。 0063 图4： 在来自具有CIN0、 CIN1、 CIN2、 CIN3和(mi)Ca的患者的刮片中用QMSP测试的8 个新标记基因中每个的甲基化比率。 甲基化的相对水平随着更严重的组织学异常而显著增 加(所有p1.8。 0075 甲基化-CpG岛DNA捕获后， 进行下一代测序(MethylC

42、ap-seq) 0076 使用MethylCap试剂盒， 根据制造商的说明书(Diagenode， Lige， 比利时)， 利用甲 基结合结构域捕获甲基化DNA片段。 试剂盒由人MeCP2的甲基结合结构域(MBD)构成， 作为采 用含有N-端His6-标记的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的C-端融合物。 在捕获之前， 使用 BioruptorTM UCD-200(Diagenode， Lige， 比利时)将DNA样品(500ng)剪切至300-1000bps的 大小范围， 并分离出约300bp的片段。 4个健康对照的白细胞DNA包含于2个样品的2个组中。 根据方案(Illumina， San

43、Diego， CA， USA)， 将捕获的DNA在Illumina Genome Analyzer II 说明书 7/19 页 10 CN 107002136 A 10 平台上进行配对-末端-测序。 使用Bowtie软件将结果映射于核苷酸序列上28， 使用BioBix的 H2G2浏览器(http:/h2g2.ugent.be/)可视化， 并使用人参照基因组(NCBI build 37)进行 处理。 配对-末端片段是独特的， 并位于彼此的400bp内29。 0077 MethylCap-测序分析 0078 为了进行统计分析， 检索了启动子(转录起始位点-2000bp至+500bp)和外显子区 域

44、的读数。 为了确定正常宫颈和CIN2/3病变之间的差异， 我们将读取数据分为甲基化阳性 或甲基化阴性。 如果样品显示0或1读数， 则样品被认为是阴性的。 如果样品显示3的读数， 则将样品视为甲基化阳性。 随后， 根据CIN2/3的最高特异性和最高灵敏度对各区进行排位。 候选标记应符合以下标准： 1)白细胞的低读数/阴性读数以防止假阳性结果。 如果两个白细 胞样品都显示1的读数， 或如果1个白细胞样品显示2的读数， 则该区就被排除。 2)在至少 75(15/20)的正常宫颈组中未甲基化(0或1的读数)。 3)至少28(5/18)的CIN2/3病变组 中甲基化(3的读数)。 0079 通过甲基化特

45、异性PCR(MSP)检验和验证MethylCap-测序数据 0080 MSP引物设计用于排名前15的基因(16个DMR)。 根据EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo， BaseClear， Leiden， Netherlands)的建议， 进行分离的基因组DNA的亚硫酸氢钠处理(1 g/ 样品)。 使用源自H2G2浏览器的序列进行MSP设计和分析。 每个反应在30 L总反应体积中进 行， 所述反应体积包含： 600nM的各种MSP引物， 1.5 L的亚硫酸氢盐处理的DNA(约15ng)， 标 准PCR组分(Applied Biosystems)和0 .5U AmpliTaq Gold DNA聚合

46、酶(Applied Biosystems)。 MSP的条件是： 在95下热启动10分钟， 95长达60秒， 60长达60秒， 72长 达60秒， 共40个循环， 并且最终延伸步骤在72下长达7分钟。 使用来自健康女性的白细胞 DNA作为阴性对照， 并将体外甲基化(通过SssI酶)的白细胞DNA用作每种MSP的阳性对照。 0081 定量甲基化特异性PCR(QMSP) 0082 如我们团队之前描述的， 利用内部(FAM-ZEN/IBFQ)标记的杂交探针进行QMSP用于 定量分析21。 引物和探针序列总结于表1中。 -肌动蛋白用作甲基化独立的内部参照基因。 0083 表1A： 定量甲基化特异性PCR

47、(QMSP)中使用的引物和探针序列 说明书 8/19 页 11 CN 107002136 A 11 0084 0085 表1B： 定量甲基化特异性PCR(QMSP)中的探针序列 0086 0087 在10 L终体积中进行QMSP反应， 所述终体积中含有： 300nM正向和反向引物， 250nM 杂交探针， 5 L 2*QuantiTech Probe PCR Master Mix(Qiagen Hilden， 德国)和2.5 L亚硫 酸氢盐修饰的DNA(约25ng)。 通过7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)一式三份分析每个样品。 阴性和阳性对照与对于MSP所使用的

48、相同。 在每个孔 板上并且通过设置在一系列稀释的体外甲基化白细胞DNA上的每个引物-探针进行标准曲 线分析。 如果3个孔中至少有2个是甲基化阳性， Ct值低于50， 并且DNA输入至少225pg -肌动 蛋白， 则DNA样品被认为是甲基化的。 通过以下计算确定感兴趣区域的相对甲基化水平： 感 兴趣的甲基化区域的平均数量除以参照 -肌动蛋白基因的平均数量并乘以1000030。 在我们 的分析中， 如我们团队先前描述的， 我们还包括4个基因(C13ORF18， JAM3， EPB41L3和TERT) 以与新确定的甲基化标记物对比这些已知基因的灵敏度和特异性。 这些标记如前进行 QMSP21。 00

49、88 HPV检测 0089 如先前的报道， 使用通用引物介导的PCR(GP5+/6+)进行HrHPV测试。 对于HPV分型 以及临床相关HPV感染的检测， GP5+/6+阳性病例通过检测。 COBAS 说明书 9/19 页 12 CN 107002136 A 12 HPV测试各自检测HPV 16和18， 并且同时确定12个另外的hrHPV类型31。 在我们的iso-15189- 认证的分子病理学实验室中， COBAS HPV检测常规用于来自全国基于人口的筛查的程序的 刮片。 对于本研究中的检测， 仅使用PCR工作流程， 因为在中 没有液基刮片可用， 并且只有已经分离的DNA。 该工作流程首先利用从之前在诊断常规中测 试的临床样品中分离的DNA来验证， 并且这显示出与液基样品相当的结果。 0090 统计分析 0091 使用SPSS软件包(SPSS 20， Chicago， IL， USA)进行统计学分析。 Spearman等级相关 系数用于比较MethylCap-seq读数与MSP带强度。 使用Pearson 2测试分析分类的甲基化数 据。 产生受试者的工作特征(ROC)曲线， 并将ROC曲线下的面积(AUC)用作测试性能的量度。 曼恩-惠特尼(Mann-Whitne