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1、(10)申请公布号 CN 103555718 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103555718 A (21)申请号 201310576578.7 (22)申请日 2013.11.18 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区孝陵卫钟 灵街 50 号江苏省农科院植保所 (72)发明人 周彤 杜琳琳 周益军 王英 王跞姣 兰莹 孙枫 (54) 发明名称 3 号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性 QTL 紧 密连锁的 SSR 标记及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种与水。
2、稻抗黑条矮缩病主效 QTL 紧密连锁的分子标记。本发明的实质是根据 连锁分离规律， 以特特勃和 RBSDV 感病品种杂交 后代 F2群体为作图群体， 通过抗病性鉴定结果和 SSR标记数据间的连锁分析， 获得了3号染色体上 与水稻黑条矮缩病抗性主效 QTL 紧密连锁的 SSR 标记 RM5626 和 RM7097。通过检测特特勃及其衍 生品种 ( 系 ) 与 RBSDV 感病品种杂交组合后代单 个水稻植株的 SSR 标记带型， 可以判断该植株是 否具有水稻黑条矮缩病抗性， 将其应用于特特勃 及其衍生品种 ( 系 )/RBSDV 感病品种水稻黑条矮 缩病抗病品种的辅助选择育种中， 可以克服常规 育。
3、种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性和重复性 差、 费时费力和技术门槛高等缺点， 其结果可以简 化选择方法和提高育种效率， 进而加快抗黑条矮 缩病水稻病品种的选育进程。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103555718 A CN 103555718 A 1/1 页 2 1. 一种与水稻黑条矮缩病抗性主效 QTL 紧密连锁的分子标记， 其特征在于 ： 以 RBSDV 感病品种 / 特特勃杂交后代 F2群体为作图群体， 通过简单重复序列。
4、标记 (SSR) 数据和抗病 性鉴定结果间的连锁分析， 获得 3 号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效 QTL 连锁的分子 标记 RM5626 和 RM7097。 2.按照权利1所获得一种与RBSDV感病品种/特特勃组合中水稻黑条矮缩病抗性主效 QTL 连锁的分子标记的应用， 其特征在于 ： 以特特勃及其衍生品种 ( 系 ) 与 RBSDV 感病品种 杂交后代的单个水稻植株为对象， 通过检测其分子标记RM5626和RM7097的带型数据， 可以 判断该植株是否具有水稻黑条矮缩病抗性。 权 利 要 求 书 CN 103555718 A 2 1/5 页 3 3 号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性 QTL。
5、 紧密连锁的 SSR 标记及其应用 技术领域 ： 0001 本发明涉及3号染色体上一种与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标 记 RM5626 和 RM7097， 可应用于分子标记辅助育种， 属于水稻抗病育种和分子生物学领域。 背景技术 ： 0002 水稻黑条矮缩病， 病原为水稻黑条矮缩病毒 (Rice black-streaked dwavf virus， RBSDV)， 是一种由灰飞虱以持久性不经卵方式传播的恶性病毒病。感染 RBSDV 水稻 病株大都不能抽穗， 减产严重， 除水稻外， 还危害小麦、 玉米、 大麦及高粱等作物。20 世纪 60、 90 年代后期该病害在华北、 华东等。
6、地暴发成灾， 近年来， 感病品种的广泛种植及稻麦轮 作方式的推广和冬季气候变暖等环境条件的变化使传毒介体灰飞虱的发生量不断上升， 导 致该病害在华东稻区大面积发生。迄今为止， 几乎没有能有效防治病毒病的化学药剂， 治 虫防病的应急措施无法作为一项长期策略， 利用品种自身抗病性是防治病毒病最为经济、 有效的方法。目前， 对于水稻黑条矮缩病抗性遗传的研究报道较少， 研究结果 ( 作物学报， 2009， 35(12) ： 2213-2217 ； 作物学报， 2010， 36(8) ： 1258-1264 ； Molecular Breeding， 2012， 29(4) ： 925-938) 多表现。
7、数量性状的特征， 但不同研究的抗性基因位点不相同， 也有研究 (Treat ofCrop Res， 2007(8) ： 105-115) 发现普通野生稻导入系对水稻黑条矮缩病的抗性 由一对显性核基因控制， 其抗性为质量性状。这表明不同来源的水稻资源中可能存在差异 化的水稻黑条矮缩病抗性机制， 而且遗传机制较为复杂。 0003 水稻黑条矮缩病重病区田间鉴定方法方便快捷， 但因其易受环境条件、 年度和区 域间灰飞虱发生情况 ( 发生量和带毒率 ) 不一致等因素影响了结果的重演性， 导致不同研 究间抗性鉴定结果相去甚远， 另外重病区田间鉴定极易受到同时由灰飞虱传播的水稻条纹 叶枯病的干扰。人工接种鉴。
8、定方法 ( 植物保护学报， 2011， 38(4) ： 301-305) 是在可控条件 下开展的一种抗性鉴定， 利用其评价水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平， 除了可以很 好地克服田间鉴定中难以规避的两个问题外， 还可以拓宽鉴定时间， 但是由于 RBSDV 不经 灰飞虱卵传， 使得该方法相对费时费力。导致抗性鉴定成为水稻黑条矮缩病育种工作进展 缓慢的重要原因之一。 0004 分子标记辅助育种技术有效的解决了这一问题， 通过构建重要抗源的遗传连锁图 谱和数量性状位点(Quantitative Trait Locus， QTL)分析， 可以有效的找到与水稻黑条矮 缩病抗性主效 QTL 紧密连锁的分。
9、子标记， 使用这些标记可以对该抗源的后代及其衍生品系 在苗期进行早世代筛选， 淘汰感病植株， 不仅节约了成本， 还提高了育种效率。 发明内容 ： 0005 本发明针对上述研究背景， 以筛选到的水稻黑条矮缩病抗病品种特特勃和感病主 栽品种淮稻 5 号为材料， 在 842 对 (http ： /www.gramene.org) 微卫星标记中筛选到 160 个 多态性 SSR 标记， 从中选用 127 个 SSR 标记对淮稻 5 号 / 特特勃 F2群体进行分析， 构建水 说 明 书 CN 103555718 A 3 2/5 页 4 稻遗传连锁图谱， 将其与 F2:3家系的抗病性鉴定结果进行连锁分析。
10、， 获得了 3 号染色体上与 水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记RM5626和RM7097， 可应用于水稻黑条矮 缩病抗病品种的辅助选择育种。 0006 本发明所提供的3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标 记 RM5626 和 RM7097， 是通过以下方法获得的 ： 0007 1) 感病品种淮稻 5 号 ( ) 与抗病品种特特勃 ( ) 杂交获得杂种 F1， F1自交得 F2作图群体， 单株收获 F2:3家系种子用于抗病性鉴定 ； 0008 2)CTAB 法提取亲本、 F1及 F2群体 DNA ； 0009 3) 利用选出的 127 对 SSR 引物对亲本、。
11、 F1及 F2群体进行 PCR 扩增， 扩增产物通过 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 获得分子标记数据， 构建遗传连锁图 ； 0010 4) 采用人工接种鉴定方法测定 F2:3家系的抗病性， 以发病与否区分为抗病和感 病 ； 0011 5) 根据标记带型用 Mapmaker/Exp3.0 软件计算出标记间连锁遗传距离， 并用 Mapdraw 软件根据各标记在染色体上的位置画图， 构建水稻遗传连锁图谱 ； 0012 6)采用基于复合区间作图法的软件Windows QTL Cartographer V2.5检测水稻黑 条矮缩病的抗性 QTL。LOD 值的阈值定为 2.0， 按 P 0.005 概率值检测。
12、抗性 QTL 的数目及 其在染色体上的位置。 0013 3 号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效 QTL 紧密连锁的分子标记 RM5626 和 RM7097 的应用包括 ： 以特特勃其衍生品种 ( 系 ) 与 RBSDV 感病品种杂交组合后代的单个水 稻植株为对象， 通过检测其 3 号染色体上 RM5626 和 RM7097 标记的带型数据， 可以预测该植 株对水稻黑条矮缩病的抗性。 0014 本发明能克服常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性、 重复性较差及费时费 力等缺点， 其结果可以简化选择方法和提高育种效率， 进而加快抗病品种的育种进程。 附图说明 ： 0015 图 1 利用淮稻 5 号。
13、 / 特特勃 F2群体构建的分子连锁图谱 0016 图 2 特特勃中水稻黑条矮缩病抗性 QTL 遗传连锁群定位分析示意图 0017 其中 ： 包含QTL的连锁群区段被显示， 左侧为标记间遗传距离(cM) ； 右侧为标记名 称。 具体实施方式 ： 0018 下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 0019 实施例 1， 与水稻黑条矮缩病抗性主效 QTL 紧密连锁的分子标记的获得 0020 1、 植物材料 0021 2008 年在江苏省农科院大田种植亲本淮稻 5 号和特特勃， 并杂交获得杂种 F1， 次 年 F1自交得 F2种子， 2009 年在海南繁殖 F2群体， 作为作图群体。F2单株。
14、编号， 分蘖期取亲 本、 杂种 F1及 F2群体各单株的部分叶片， -70冰箱保存用于 SSR 分析， F2群体单株收种， 以备表型鉴定。2010 年对感病主栽品种淮稻 5 号、 抗病品种特特勃、 F1和 F2:3家系进行人 工接种鉴定 ( 植物保护学报， 2011， 38(4) ： 301-305)。 说 明 书 CN 103555718 A 4 3/5 页 5 0022 2、 传毒介体的筛选 0023 于江苏盐城、 徐州、 连云港等水稻黑条矮缩病重病区采集表现RBSDV症状(浙江农 业科学， 1984， (4) ： 185-192.) 的水稻病株， 通过 RT-PCR 方法 ( 江苏农业学。
15、报， 2009， 25(6) ： 1263-1267) 检测病株是否携带 RBSDV， 利用水稻条纹叶枯病毒 (RSV) 外壳蛋白基因对应的 引物 (CP-F ： ATGGGTACCAACAAGCC， CP-R ： CTAGTCATCTGCACCTT) 检测病株， 选取不携带 RSV 的 RBSDV病株作为毒源。 将1-2龄无毒灰飞虱若虫在毒源上饲毒2-3d， 而后移入育有武育粳3 号秧苗的烧杯中饲养使其度过循回期， 12-13d 后从每杯中随机取出 30 头经 DIBA 方法 ( 南 京农业大学硕士论文， 2012， 杜琳琳 ) 测定其带毒率， 用于测算有效接种虫量 有效接种虫 量 ( 虫 。
16、) 接种虫量 ( 虫 ) 带毒率 ( )。 0024 3、 DNA 提取 (CTAB 法 ) 0025 1)称取500mg水稻叶片置于2.0mL Eppendorf管中， 将离心管置于液氮中冷却， 灌 满液氮后迅速取出， 用研磨棒研磨成粉末状 ； 0026 2)65条件下水浴 1-1.5h， 15min 震荡 1 次 ； 0027 3)4条件下 13,000rpm 离心 10min， 取上层水相 ； 0028 4)加入900L氯仿 ： 异戊醇溶液(241)， 充分混匀震荡至溶液颜色由绿色变为 白色 ； 0029 5)4条件下 13,000rpm 离心 10min， 取上层水相 ； 0030 6。
17、) 加入等体积异丙醇 ( 或 2 倍体积无水乙醇 )， -20条件下静置 20-30min， 沉淀 出絮状 DNA ； 0031 7)4条件下 13,000rpm 离心 10min， 弃上清， 加入 1mL70乙醇洗涤， 4条件下 13,000rpm 离心 5min， 弃上清并用滤纸吸干， 置于超净台上晾干。 0032 8) 加 30L 去离子水溶解 DNA， 4保存备用。 0033 用 Eppendorf BioPhotometer Plus 核酸蛋白测定仪测定 OD 值和浓度， 将各样品 DNA 稀释至 20ng/L 备用。 0034 4、 SSR 标记分析 0035 (1)PCR 扩增 。
18、0036 采用 10L 的 PCR 反应体系， 如表 1 ； 0037 表 1PCR 反应体系 0038 0039 PCR 反应程序 ： 95变性 5min ； 95变性 30s、 54退火 30s、 72延伸 1min， 进行 说 明 书 CN 103555718 A 5 4/5 页 6 35 个循环 ； 72延伸 10min。产物加入 loading buffer 中止反应， 待用。 0040 (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 0041 采用 8聚丙烯酰胺凝胶检测上述 PCR 反应产物， 所用的电泳仪为双板夹芯垂直 电泳槽 DYCZ-30 型 ( 北京六一仪器厂 )。具体操作步骤如下 ： 004。
19、2 1) 用洗洁精把玻璃板反复擦洗干净， 用蒸馏水冲洗， 烘箱烘干， 组装玻璃板之前可 用酒精擦拭。 0043 2) 将两块玻璃板放进橡胶封条内， 琼脂糖凝胶封住底部安装至电泳槽上。 0044 3) 按表 2 顺序加入各储液配制丙烯酰胺凝胶， 充分摇匀后用移液器将配好的胶均 匀注入两玻璃板之间， 再插入梳子， 注意防止梳子底部产生气泡。静置 1h 左右待其凝固。 0045 表 2 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积 0046 0047 4)在电泳槽中加入1TAE的电泳缓冲液， 拔出梳子， 将PCR产物加入到点样孔中。 0048 5)200V 恒压电泳 1-2h。 0049 (3) 聚丙烯酰胺凝胶。
20、的染色 ( 银染法 ) 0050 1) 用含酒精 10， 冰乙酸 0.5的溶液固定 2 次， 6 分钟 / 次。 0051 2) 弃固定溶液， 加 0.2 AgNO3溶液渗透 10-12 分钟。 0052 3) 渗透后用 ddH2O 清洗。 0053 4) 用 0.002硫代硫酸钠溶液进行置代约 30s。 0054 5) 置代后用含 1.5 NaOH， 0.4甲醛的溶液显色。 0055 6) 条带清晰后， 蒸馏水冲洗， 终止显色反应。 0056 7) 用保鲜膜包胶保存， 并在白光灯上记录实验结果。 0057 5、 遗传图谱的构建及 QTL 分析 0058 根据微卫星数据库(http ： /ww。
21、w.gramene.org)合成842对SSR引物， 在亲本间进 行多态性检测， 选用亲本间具有多态的 127 个 SSR 标记分析 F2 群体。 0059 利用 MAPMAKER/EXP3.0 软件进行连锁分析。其中与淮稻 5 号带型相同的赋值为 “A” ， 与特特勃带型相同的赋值为 “B” ， 杂合型的带型赋值为 “H” ， 特殊的或缺失的带型赋值 为 “-” 。根据各标记之间的连锁关系， 用 “group” 命令在 LOD 值大于 3.0 时， 对标记进行分 组。再用 Kosambi 函数将各组中标记间重组率转换成遗传距离 (Centimorgan， cM)。对于小 的连锁群直接采用 “。
22、compare” 命令， 选择具有最大似然值的排列顺序构建连锁框架图 ； 对 于较大的连锁群， 则先用两点测验的方法， 计算任意两两标记间的 LOD 值， 采用 “compare” 命令获得其建议的最佳排列顺序， 构建基本框架图， 再 “try” 命令， 找出每个标记最合适的 位置 ( 最大似然值法 )。同时用 “ripple” 验证。最后用 “map” 命令获得遗传连锁图谱。构 建了包含 12 个遗传连锁群的水稻图谱， 覆盖水稻基因组 2179.6cM， 127 个 SSR 标记间平均 说 明 书 CN 103555718 A 6 5/5 页 7 间距为 17.16cM( 图 1) 0060。
23、 采用基于复合区间作图法(Windows QTL Cartographer V2.5)对构建的遗传图谱 和 F2:3表型数据进行分析， LOD 值的阈值定为 2.0， 按 P 0.005 概率值检测抗性 QTL 的数 目及其在染色体上的位置。在 3 号染色体上检测到 1 个抗水稻黑条矮缩病的 QTL， 命名为 qRBSDV-3( 命名参照 McCouch 的原则 Theor Appl Genet， 1988， 76(6) ： 815-829)， 位于第 3 染色体的 RM5626-RM7097 之间， LOD 值为 4.07， 贡献率为 17.5 ( 图 2)。 0061 实施例2， 3号染色。
24、体上与水稻黑条矮缩病抗性QTL紧密连锁的分子标记在以淮稻 5 号与特特勃为亲本的杂交组合后代中的应用 0062 3 号染色体上获得的与水稻黑条矮缩病抗性 QTL 紧密连锁的 SSR 标记， 对淮稻 5 号与特特勃杂交的 F2:3家系的部分单株进行了水稻黑条矮缩病抗性预测， 分别提取各单株 DNA， 然后用 SSR 标记 RM5626 和 RM7097 的引物进行 PCR 扩增分析， 通过带型分析来确定是 否存在相应的标记， 存在标记的说明该株系水稻黑条矮缩病达到抗的水平， 不存在则是感 病。 随后利用人工接种鉴定的方法测定受试株系水稻黑条矮缩病实际抗性并与预测结果进 行比对， 结果显示 ( 表 3)， 预测结果与实际检测结果相吻合。 0063 表 3 与特特勃主效 QTL 紧密连锁的分子标记预测淮稻 5 号 / 特特勃杂交后代 F2:3 的水稻黑条矮缩病抗性 0064 0065 上述实施不以任何形式限定本发明。 说 明 书 CN 103555718 A 7 1/2 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103555718 A 8 2/2 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103555718 A 9 。