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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610301592.X (22)申请日 2016.05.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106010503 A (43)申请公布日 2016.10.12 (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 王征科陈末童胡巧玲唐本忠 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 韩介梅 (51)Int.Cl. C09K 11/06(2006.01) C08B 37/08(2006.0。
2、1) (56)对比文件 CN 104945537 A,2015.09.30,说明书第 0013段、 附图1. CN 104845607 A,2015.08.19,说明书第 0005段. CN 102639627 A,2012.08.15,全文. JP 2005200531 A,2005.07.28,全文. Qing Li等.Novel triazolyl- functionalized chitosan derivatives with different chain lengths of aliphatic alcohol substituent： Design， synthesis， an。
3、d antifungal activity. Carbohydrate Research .2015,第418卷第44-49页. 审查员 黄轲轲 (54)发明名称 一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针 及其制备方法 (57)摘要 本发明公开的适于血液长循环的壳聚糖基 荧光探针具有式(1)所示的结构。 其制备步骤包 括： 将聚乙二醇接枝到壳聚糖上得到适于血液长 循环的聚乙二醇-壳聚糖， 再将四苯基乙烯荧光 分子标记到壳聚糖链上得到具有聚集诱导发光 特性的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针。 本 发明制得的荧光探针具有灵敏度高， 光稳定性 好， 高浓度时无淬灭， 荧光光谱不漂移等优点， 适 于血液长。
4、循环， 在细胞示踪、 肿瘤诊断、 药物代谢 检测等领域具有广泛的应用前景。 权利要求书2页 说明书8页 CN 106010503 B 2018.01.30 CN 106010503 B 1.一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： 1)在N2气氛下， 将1g粘均分子量为1万100万， 脱乙酰度为6095的壳聚糖和 2.30g邻苯二甲酸酐加入到40mL N,N-二甲基甲酰胺中， 在130下反应5-7小时， 倒入冰水 中沉淀， 抽滤， 沉淀用甲醇抽提， 真空干燥， 得到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖； 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100mL N,N-二。
5、甲基甲酰胺与水的混合溶剂 中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将产 物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提， 真空干燥， 得到N-邻苯甲酰化壳聚糖； 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30mL质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺 溶液， 于0下预冷， 备用； 将9.5mL三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20mL N,N-二甲基乙酰胺溶剂中， 然后滴至上 述备用的预冷液中， 在4-8下充分反应， 将产物置于冰水中沉淀， 过滤， 用氯仿洗涤， 常温 下真空干燥， 得到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 4)将0.20g 6-。
6、对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30mL N,N- 二甲基甲酰胺中溶解， 80下充分反应， 浓缩后滴加到蒸馏水中沉淀， 过滤， 真空干燥， 得到 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 5)称取5g分子量为2000、 甲基封端的聚乙二醇溶于20mL二氯甲烷， 在0下边搅拌边加 入0.15g氰化钠， 待充分反应后再加入0.4mL溴丙炔， 保持0继续搅拌至少2小时， 然后加热 到室温继续搅拌反应， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷萃取， 将萃取液蒸发后 用苯溶解， 乙醚沉淀， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2。
7、mL水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2mL水， 0.28g-1.11g炔基-聚 乙二醇溶于10mL水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水 溶液； 将0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15mL二甲亚砜， 得到6-叠氮基-N-邻苯甲 酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基- 聚乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液中， 在55下搅拌， 充分反应后， 蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1mL一水合肼， 在80搅拌反应， 所得 溶液用水透析除去杂质， 之后浓缩， 真空干燥， 得到聚。
8、乙二醇-壳聚糖； 7)称取1.5g聚乙二醇-壳聚糖加入到10mL二甲亚砜中， 60下溶胀， 然后加入含异硫氰 酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/聚乙二醇-壳聚糖的摩尔比为1- 25， 继续搅拌， 充分反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混 合溶液透析， 再用水透析， 除去杂质， 冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探 针。 2.一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针， 其特征在于， 采用如权利要求1所述的方 法制备而成， 具有式(1)所示的结构， 权利要求书 1/2 页 2 CN 106010503 B 2 权利要求书 2/2 。
9、页 3 CN 106010503 B 3 一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种壳聚糖基荧光探针及其制备方法， 尤其是具有聚集诱导发光特性 的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针及其制备方法。 背景技术 0002 壳聚糖(CS)作为一种富含氨基的天然多糖， 具有良好的生物相容性和生物活性， 无毒且易于生物降解， 被广泛应用于生物医学领域。 但是壳聚糖分子带正电， 会引起细胞毒 性和体内免疫反应， 用聚乙二醇(PEG)修饰来掩蔽部分正电荷， 可以降低血液循环过程中与 内源性阴离子物质的非特异性结合， 并且可以提高壳聚糖的水溶性从而延长壳聚糖分子的 血液循。
10、环时间， 因此PEG化壳聚糖能实现血液中的长循环。 荧光探针是以荧光物质作为指示 剂， 并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光， 通过检测所产生的荧光实现对被检测物 质的定性或者定量分析。 当前， 荧光探针主要应用于生物、 医学等领域， 然而传统的荧光探 针面临着聚集诱导淬灭(ACQ)效应和细胞毒性两大问题。 聚集诱导发光(AIE)荧光分子的发 现无疑提供了一种解决上述问题的思路。 AIE效应使得荧光探针易于使用， 并且AIE体系对 细胞没有毒性， 不会影响细胞生理学和细胞增殖。 因此， 制备一种适于血液长循环的壳聚糖 基荧光探针分子具有重要的科学意义和良好的应用前景。 发明内容 0003 本。
11、发明的目的是提供一种具有聚集诱导发光特性的适于血液长循环的壳聚糖基 荧光探针及其制备方法。 0004 本发明的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针， 其特征在于具有式(1)所示的结 构， 0005 0006 本发明的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针的制备方法， 包括以下步骤： 说明书 1/8 页 4 CN 106010503 B 4 0007 1)在N2气氛下， 将1g粘均分子量为1万100万， 脱乙酰度为6095的壳聚糖 和2.30g邻苯二甲酸酐加入到40ml N,N-二甲基甲酰胺中， 在130下反应5-7小时， 倒入冰 水中沉淀， 抽滤， 沉淀用甲醇抽提， 真空干燥， 得到N,O-邻苯甲酰化壳。
12、聚糖； 0008 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶 剂中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将 产物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提， 真空干燥， 得到N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0009 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙 酰胺溶液， 于0下预冷， 备用； 0010 将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml N,N-二甲基乙酰胺溶剂中， 然后滴 至上述备用的预冷液中， 在4-8下充分反应， 将产物置于冰水中沉淀， 过滤。
13、， 用氯仿洗涤， 常温下真空干燥， 得到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0011 4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解， 80下充分反应， 浓缩后滴加到蒸馏水中沉淀， 过滤， 真空干燥， 得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0012 5)称取5g分子量为2000、 甲基封端的聚乙二醇溶于20ml二氯甲烷， 在0下边搅拌 边加入0.15g氰化钠， 待充分反应后再加入0.4ml溴丙炔， 保持0继续搅拌至少2小时， 然后 加热到室温继续搅拌反应， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷萃取， 将萃取液。
14、蒸 发后用苯溶解， 乙醚沉淀， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 0013 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水， 0.28g-1.11g炔 基-聚乙二醇溶于10ml水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙 二醇水溶液； 0014 将0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml二甲亚砜， 得到6-叠氮基-N-邻 苯甲酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和 炔基-聚乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液中， 在55下 搅拌， 充分反应后。
15、， 蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1ml一水合肼， 在80搅拌反应， 所得溶液用水透析除去杂质， 之后浓缩， 真空干燥， 得到聚乙二醇-壳聚糖； 0015 7)称取1.5g聚乙二醇-壳聚糖加入到10mL二甲亚砜中， 60下溶胀， 然后加入含异 硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/聚乙二醇-壳聚糖的摩尔比为1- 25， 继续搅拌， 充分反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混 合溶液透析， 再用水透析， 除去杂质， 冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探 针。 0016 本发明通过将聚乙二醇(PEG)接枝壳聚糖上得到。
16、适于血液长循环的聚乙二醇-壳 聚糖(PEG-CS)， 再将四苯基乙烯(TPE)荧光分子标记到壳聚糖链上从而制得具有聚集诱导 发光特性的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针分子PEG-CS-TPE。 PEG接枝率为20- 80； TPE标记率为0.75-10.12。 0017 本发明的优点在于： 0018 1)荧光探针具有聚集诱导发光特性， 与传统荧光探针相比， 具有灵敏度高， 光稳定 性好， 高浓度时无淬灭， 荧光光谱不漂移等优点， 成像效果佳。 有望应用于细胞示踪、 癌症诊 断、 药物代谢检测等领域。 说明书 2/8 页 5 CN 106010503 B 5 0019 2)壳聚糖分子带正电， 会。
17、引起细胞毒性和体内免疫反应， 用PEG修饰来掩蔽部分正 电荷， 可以降低血液循环过程中与内源性阴离子物质的非特异性结合， 从而延长壳聚糖分 子的血液循环时间， 因此PEG化壳聚糖能实现血液中的长循环。 具体实施方式 0020 以下结合实例进一步说明本发明。 0021 实施例1： 0022 1)在N2气氛下， 向三口瓶中加入1g粘均分子量为1万， 脱乙酰度为60的壳聚糖 (CS)和2.30g邻苯二甲酸酐， 加入40ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)， 在130下反应5小时， 将 其倒入冰水中沉淀， 抽滤后将沉淀用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N,O-邻苯甲 酰化壳聚糖。 0023。
18、 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶 剂中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将 产物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N-邻苯甲酰化壳聚 糖； 0024 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙 酰胺溶液， 于0下预冷， 备用； 0025 将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中， 然后 滴至上述备用的预冷液中， 保持4反应12小时。 将产物置于冰水中沉。
19、淀， 过滤， 用氯仿洗 涤， 常温下真空干燥， 得到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0026 4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中溶解， 80下反应24小时， 浓缩后缓慢滴加到蒸馏水中沉淀， 过 滤， 40下真空干燥， 得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0027 5)称取5g分子量为2000、 甲基封端的聚乙二醇(MPEG-2000)溶于20ml二氯甲烷， 在 0下边搅拌边加入0.15g氰化钠(NaH)。 搅拌30分钟后再加入0.4ml溴丙炔， 保持0继续搅 拌2小时， 然后加热到室温继续搅。
20、拌22小时， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷 萃取， 将萃取液蒸发后用20ml苯溶解， 倒入200ml乙醚中， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 并在室温 下干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 0028 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水， 0.28g炔基-聚乙 二醇溶于10ml水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水溶 液； 0029 取0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml二甲亚砜(DMSO)， 得到6-叠氮 基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的DMSO溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液 和炔。
21、基-聚乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的DMSO溶液中， 在55下搅 拌反应24小时后， 旋转蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1ml一水合肼， 加热到80搅 拌2小时， 所得溶液用水透析48小时， 之后旋转蒸发浓缩， 在室温下真空干燥， 得到聚乙二 醇-壳聚糖(PEG-CS)(PEG接枝率为20)； 0030 7)称取1.5g PEG-CS加入到10mL DMSO中， 60下溶胀24h， 然后加入含异硫氰酸酯 官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/PEG-CS摩尔投料比为1， 继续搅拌48小时 说明书 3/8 页 6 CN 106010503 B。
22、 6 后停止反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析1 天， 再用水透析3天， 用冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针(PEG-CS- TPE)； 其结构如式(1)所示。 0031 本例制得的PEG-CS-TPE荧光探针TPE标记率为0.75。 0032 0033 实施例2： 0034 1)在N2气氛下， 向三口瓶中加入1g CS(粘均分子量为1万， 脱乙酰度为60)和 2.30g邻苯二甲酸酐， 加入40ml DMF， 在130下反应5小时， 将其倒入冰水中沉淀， 抽滤后将 沉淀用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N,O-邻苯甲酰化。
23、壳聚糖； 0035 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶 剂中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将 产物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N-邻苯甲酰化壳聚 糖； 0036 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙 酰胺溶液， 于0下预冷， 备用； 0037 将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml DMAc中， 然后滴至上述备用的预冷 液中， 保持4反应12小时。 将产物置于冰水中沉淀， 。
24、过滤， 用氯仿洗涤， 常温下真空干燥， 得 到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0038 4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml DMF中溶解， 80下反应24小时， 浓缩后缓慢滴加到蒸馏水中沉淀， 过滤， 40下真空干燥， 得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0039 5)称取5g MPEG-2000溶于20ml二氯甲烷， 在0下边搅拌边加入0.15g NaH。 搅拌 30分钟后再加入0.4ml溴丙炔， 保持0继续搅拌2小时， 然后加热到室温继续搅拌22小时， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷萃取， 将萃取液蒸发后用2。
25、0ml苯溶解， 倒入 200ml乙醚中， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 并在室温下干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 0040 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水， 0.42g炔基-聚乙 二醇溶于10ml水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水溶 说明书 4/8 页 7 CN 106010503 B 7 液； 0041 取0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml DMSO， 得到6-叠氮基-N-邻苯 甲酰化壳聚糖的DMSO溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚 乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-。
26、N-邻苯甲酰化壳聚糖的DMSO溶液中， 在55下搅拌反应24 小时后， 旋转蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1ml一水合肼， 加热到80搅拌2小时， 所得溶液用水透析48小时， 之后旋转蒸发浓缩， 在室温下真空干燥， 得到PEG-CS(PEG接枝率 为30)； 0042 7)称取1.5g PEG-CS加入到10mL DMSO中， 60下溶胀24h， 然后加入含异硫氰酸酯 官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/PEG-CS摩尔投料比为5， 继续搅拌48小时 后停止反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析1 天， 再用水透析3天，。
27、 用冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针(PEG-CS- TPE)； 0043 本例制得的PEG-CS-TPE荧光探针TPE标记率为1.53。 0044 实施例3： 0045 1)在N2气氛下， 向三口瓶中加入1g CS(粘均分子量为20万， 脱乙酰度为70)和 2.30g邻苯二甲酸酐， 加入40ml DMF， 在130下反应6小时， 将其倒入冰水中沉淀， 抽滤后将 沉淀用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖； 0046 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶 剂中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体。
28、积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将 产物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N-邻苯甲酰化壳聚 糖； 0047 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙 酰胺溶液， 于0下预冷， 备用； 0048 将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml DMAc中， 然后滴至上述备用的预冷 液中， 保持6反应12小时。 将产物置于冰水中沉淀， 过滤， 用氯仿洗涤， 常温下真空干燥， 得 到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0049 4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化。
29、壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml DMF中溶解， 80下反应24小时， 浓缩后缓慢滴加到蒸馏水中沉淀， 过滤， 40下真空干燥， 得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0050 5)称取5g MPEG-2000溶于20ml二氯甲烷， 在0下边搅拌边加入0.15g NaH。 搅拌 30分钟后再加入0.4ml溴丙炔， 保持0继续搅拌2小时， 然后加热到室温继续搅拌22小时， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷萃取， 将萃取液蒸发后用20ml苯溶解， 倒入 200ml乙醚中， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 并在室温下干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 0051 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于。
30、2ml水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水， 0.56g炔基-聚乙 二醇溶于10ml水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水溶 液； 0052 取0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml DMSO， 得到6-叠氮基-N-邻苯 甲酰化壳聚糖的DMSO溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚 乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的DMSO溶液中， 在55下搅拌反应24 说明书 5/8 页 8 CN 106010503 B 8 小时后， 旋转蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1ml一水合肼， 加热到80搅。
31、拌2小时， 所得溶液用水透析48小时， 之后旋转蒸发浓缩， 在室温下真空干燥， 得到PEG-CS(PEG接枝率 为40)； 0053 7)称取1.5g PEG-CS加入到10mL DMSO中， 60下溶胀24h， 然后加入含异硫氰酸酯 官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/PEG-CS摩尔投料比为10， 继续搅拌48小时 后停止反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析1 天， 再用水透析3天， 用冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针(PEG-CS- TPE)； 0054 本例制得的PEG-CS-TPE荧光探针TPE标记率为。
32、2.47。 0055 实施例4： 0056 1)在N2气氛下， 向三口瓶中加入1g CS(粘均分子量为20万， 脱乙酰度为80)和 2.30g邻苯二甲酸酐， 加入40ml DMF， 在130下反应6小时， 将其倒入冰水中沉淀， 抽滤后将 沉淀用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖； 0057 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶 剂中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将 产物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N-邻。
33、苯甲酰化壳聚 糖； 0058 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙 酰胺溶液， 于0下预冷， 备用； 0059 将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml DMAc中， 然后滴至上述备用的预冷 液中， 保持6反应12小时。 将产物置于冰水中沉淀， 过滤， 用氯仿洗涤， 常温下真空干燥， 得 到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0060 4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml DMF中溶解， 80下反应24小时， 浓缩后缓慢滴加到蒸馏水中沉淀， 过滤， 40下真空干燥， 得到6-。
34、叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0061 5)称取5g MPEG-2000溶于20ml二氯甲烷， 在0下边搅拌边加入0.15g NaH。 搅拌 30分钟后再加入0.4ml溴丙炔， 保持0继续搅拌2小时， 然后加热到室温继续搅拌22小时， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷萃取， 将萃取液蒸发后用20ml苯溶解， 倒入 200ml乙醚中， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 并在室温下干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 0062 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水， 0.69g炔基-聚乙 二醇溶于10ml水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-。
35、聚乙二醇水溶 液； 0063 取0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml DMSO， 得到6-叠氮基-N-邻苯 甲酰化壳聚糖的DMSO溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚 乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的DMSO溶液中， 在55下搅拌反应24 小时后， 旋转蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1ml一水合肼， 加热到80搅拌2小时， 所得溶液用水透析48小时， 之后旋转蒸发浓缩， 在室温下真空干燥， 得到PEG-CS(PEG接枝率 为50)； 0064 7)称取1.5g PEG-CS加入到10mL DMSO中， 60下溶胀。
36、24h， 然后加入含异硫氰酸酯 说明书 6/8 页 9 CN 106010503 B 9 官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/PEG-CS摩尔投料比为15， 继续搅拌48小时 后停止反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析1 天， 再用水透析3天， 用冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针(PEG-CS- TPE)； 0065 本例制得的PEG-CS-TPE荧光探针TPE标记率为4.79。 0066 实施例5： 0067 1)在N2气氛下， 向三口瓶中加入1g CS(粘均分子量为50万， 脱乙酰度为80)和 2.30g邻苯。
37、二甲酸酐， 加入40ml DMF， 在130下反应7小时， 将其倒入冰水中沉淀， 抽滤后将 沉淀用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖； 0068 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶 剂中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将 产物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N-邻苯甲酰化壳聚 糖； 0069 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙 酰胺溶液， 于0下预冷， 备用。
38、； 0070 将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml DMAc中， 然后滴至上述备用的预冷 液中， 保持8反应12小时。 将产物置于冰水中沉淀， 过滤， 用氯仿洗涤， 常温下真空干燥， 得 到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0071 4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml DMF中溶解， 80下反应24小时， 浓缩后缓慢滴加到蒸馏水中沉淀， 过滤， 40下真空干燥， 得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0072 5)称取5g MPEG-2000溶于20ml二氯甲烷， 在0下边搅拌边加入0.15g NaH。 搅拌 3。
39、0分钟后再加入0.4ml溴丙炔， 保持0继续搅拌2小时， 然后加热到室温继续搅拌22小时， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷萃取， 将萃取液蒸发后用20ml苯溶解， 倒入 200ml乙醚中， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 并在室温下干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 0073 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水， 0.69g炔基-聚乙 二醇溶于10ml水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水溶 液； 0074 取0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml DMSO， 得到6-叠氮基-N-邻苯 甲酰化壳聚糖的DM。
40、SO溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚 乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的DMSO溶液中， 在55下搅拌反应24 小时后， 旋转蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1ml一水合肼， 加热到80搅拌2小时， 所得溶液用水透析48小时， 之后旋转蒸发浓缩， 在室温下真空干燥， 得到PEG-CS(PEG接枝率 为50)； 0075 7)称取1.5g PEG-CS加入到10mL DMSO中， 60下溶胀24h， 然后加入含异硫氰酸酯 官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/PEG-CS摩尔投料比为20， 继续搅拌48小时 后停止。
41、反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析1 天， 再用水透析3天， 用冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针(PEG-CS- TPE)； 说明书 7/8 页 10 CN 106010503 B 10 0076 本例制得的PEG-CS-TPE荧光探针TPE标记率为7.56。 0077 实施例6： 0078 1)在N2气氛下， 向三口瓶中加入1g CS(粘均分子量为100万， 脱乙酰度为95)和 2.30g邻苯二甲酸酐， 加入40ml DMF， 在130下反应7小时， 将其倒入冰水中沉淀， 抽滤后将 沉淀用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得。
42、到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖； 0079 2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶 剂中， N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95： 5， 在氮气氛围中加热到120， 充分搅拌后， 将 产物置于冰水沉淀， 抽滤， 用甲醇抽提24小时， 在40下真空干燥， 得到N-邻苯甲酰化壳聚 糖； 0080 3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5氯化锂的N,N-二甲基乙 酰胺溶液， 于0下预冷， 备用； 0081 将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml DMAc中， 然后滴至上述备用的预冷 液中， 保持8反应12小时。 将产。
43、物置于冰水中沉淀， 过滤， 用氯仿洗涤， 常温下真空干燥， 得 到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0082 4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml DMF中溶解， 80下反应24小时， 浓缩后缓慢滴加到蒸馏水中沉淀， 过滤， 40下真空干燥， 得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖； 0083 5)称取5g MPEG-2000溶于20ml二氯甲烷， 在0下边搅拌边加入0.15g NaH。 搅拌 30分钟后再加入0.4ml溴丙炔， 保持0继续搅拌2小时， 然后加热到室温继续搅拌22小时， 将反应结束后的混合物置于水中， 用二氯甲烷萃取，。
44、 将萃取液蒸发后用20ml苯溶解， 倒入 200ml乙醚中， 过滤， 产物用乙醚洗涤， 并在室温下干燥， 得到炔基-聚乙二醇； 0084 6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水， 7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水， 1.11g炔基-聚乙 二醇溶于10ml水， 分别配制成五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水溶 液； 0085 取0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml DMSO， 得到6-叠氮基-N-邻苯 甲酰化壳聚糖的DMSO溶液， 将上述配制的五水硫酸铜水溶液、 抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚 乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的DMSO溶液中，。
45、 在55下搅拌反应24 小时后， 旋转蒸发除去其中的水； 再在N2保护下， 加入1ml一水合肼， 加热到80搅拌2小时， 所得溶液用水透析48小时， 之后旋转蒸发浓缩， 在室温下真空干燥， 得到PEG-CS(PEG接枝率 为80)； 0086 7)称取1.5g PEG-CS加入到10mL DMSO中， 60下溶胀24h， 然后加入含异硫氰酸酯 官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC， TPE-ITC/PEG-CS摩尔投料比为25， 继续搅拌48小时 后停止反应， 将反应液放入透析袋中， 先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析1 天， 再用水透析3天， 用冻干法干燥， 得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针(PEG-CS- TPE)； 0087 本例制得的PEG-CS-TPE荧光探针TPE标记率为10.12。 说明书 8/8 页 11 CN 106010503 B 11 。