技术领域
本发明涉及一种促进异源蛋白在大肠杆菌中水溶性表达的方法，尤其涉及一种通过底物 添加促进精氨酸脱亚氨基酶在大肠杆菌中高效水溶性表达的方法，属于生物技术领域。
背景技术
大肠杆菌作为异源表达宿主，因其培养条件简单，代时短，遗传操作体系成熟等特点已 成为获取大量目的蛋白的主要方法。但在大肠杆菌系统中进行过量表达，常常导致蛋白发生 错误折叠、聚集、降解、低活性及以包涵体形式存在等，限制了其相关的研究和应用。
精氨酸脱亚氨基酶（Arginine deiminase，EC3.5.3.6；ADI）催化L-精氨酸水解为L-瓜氨 酸和氨，与鸟氨酸氨甲酰转移酶、氨甲酰磷酸激酶共同组成精氨酸脱亚氨基酶途径，广泛分 布于一些以精氨酸为主要能量来源的细菌、古细菌及少数低等真核生物。精氨酸脱亚氨基酶 除了可用于生产瓜氨酸外，还被证明其是一种潜在的抗癌药物，可抑制精氨酸缺陷型肿瘤细 胞的生长，（如黑色素瘤、肝癌细胞）、抗白血病、潜在的抗病毒（HIV）作用等，在医疗领 域具有广阔的应用价值。
目前，研究人员已经在大肠杆菌中克隆表达了来源于支原体(Mycoplasma arginini)、变形 假单胞杆菌（Pseudomonas plecoglossicida）、链球菌（Streptococcus sanguis）、贾第鞭毛虫 （Giardia Intestinalis）等微生物的ADI基因。但是，它们在表达过程中主要以包涵体形式存 在，不利于大规模工业生产瓜氨酸及作为医药制剂。这也是目前ADI研究和应用的瓶颈。
在大肠杆菌中主要通过分子伴侣共表达、分泌表达、融合表达及培养条件优化等策略来 提高重组蛋白的水溶性产量，但是，这些优化策略并不能有效地解决每一个蛋白在表达纯化 中所遇到的问题，对于某些特殊的蛋白，还需要探寻一些新的更加有效的优化策略去帮助其 进行活性表达。经检索，在分子伴侣共表达的基础上，在大肠杆菌的培养过程中通过添加底 物L-精氨酸和D-葡萄糖促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法还未见报道。
发明内容
针对精氨酸脱亚氨基酶研究和应用的瓶颈，本发明要解决的问题是提供一种促进精氨酸 脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法。
本发明所述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法，步骤是：
（1）将来源于恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）的精氨酸脱亚氨基酶（Arginine deiminase，ADI）基因连接至pET-30a-c(+)载体，构建重组表达质粒pET30a-ADI，并与pGro7 质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中，获得含双质粒的工程菌；
（2）将步骤（1）所述的含双质粒工程菌接种于LB培养基中，在37±1℃，200±10rpm 条件下培养12-18h；
（3）在LB培养基中添加1-10g/L的D-葡萄糖制得LBG培养基，将步骤（2）培养后 的菌液按体积比为1%的接种量接种于制得的LBG培养基中，再添加终浓度为0.2-0.8g/L的 L-阿拉伯糖，在37±1℃，200±10rpm条件下培养；
（4）当步骤（3）所述菌体培养至OD600=0.6-0.8时，向培养液中添加终浓度为1-10g/L 的L-精氨酸，和终浓度为0.1mM的IPTG，在16±1℃，180±10rpm条件下诱导培养24-30h；
（5）将步骤（4）培养后的菌液在4℃，8000rpm条件下离心10-15min，弃上清，沉 淀用体积比为10%的Tris-NaCl缓冲液重悬，常规超声破碎，之后在4℃，12000rpm条件下 离心30-35min，分离出可溶性组分与不溶组分，可溶组分即为含有精氨酸脱亚氨基酶的粗酶 液。
上述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法中：步骤（3）所述的D-葡萄糖在LB 培养基中添加的终浓度优选为5g/L。
上述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法中：步骤（3）所述的L-阿拉伯糖添 加的终浓度优选为0.4g/L。
上述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法中：步骤（4）所述向培养液中添加 L-精氨酸的终浓度优选为5g/L。
上述用于大肠杆菌（即含双质粒工程菌）培养的LB培养基组成为：10g/L胰蛋白胨， 5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl。
本发明在分子伴侣共表达的基础上，在大肠杆菌的培养过程中通过添加底物L-精氨酸和 D-葡萄糖成功实现了促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达，克服了相关精氨酸脱亚氨基酶 难可溶性表达的弊端，为ADI的功能研究、工业化大规模生产瓜氨酸及以ADI作为医药酶 制剂等应用提供技术支持，也为其他重组蛋白的表达纯化也提供了一个新思路。
实验证明：本发明公开的方法中将来源于恶臭假单胞杆菌的精氨酸脱亚氨基酶，利用 pET-30a-c(+)构建重组表达载体pET-30a-ADI，在E.coliBL21(DE3)中异源表达，重组rADI 几乎完全以无活性的包涵体形式（图1），粗酶液活性为0.6357±0.0397U/ml菌液。分子伴侣 GroEL/ES共表达可显著提高其水溶性产量（图1），粗酶活为3.1574±0.0150U/ml菌液，较 现有方法提高了约5倍。
本发明方法在分子伴侣共表达的基础上，在LB培养基中添加5g/L L-精氨酸和5g/LD- 葡萄糖诱导培养，可以显著并有效提高rADI的水溶性产量（图2），粗酶液活性高达 9.7868±0.0368U/ml菌液，较现有方法提高了15倍左右。然而，在E.coliBL21(DE3)中，底物 L-精氨酸需要在D-葡萄糖的协助下才能发挥显著的促进作用，单纯的添加L-精氨酸和D-葡 萄糖均不能促进精氨酸脱亚氨基酶的水溶性表达。实验证实单独添加L-精氨酸或D-葡萄糖 对rADI的水溶性产量则无促进作用，粗酶液活性依次分别为2.0775±0.0520U/ml菌液、 2.7840±0.0232U/ml菌液，此也进一步验证了本发明方法所述的L-精氨酸和D-葡萄糖必须组 合使用才能发挥促进作用的观点（图2）。进一步的，利用本发明方法125ml菌体（在分子伴 侣共表达基础上添加5g/L L-精氨酸及5g/L D-葡萄糖诱导培养）培养物制备的粗酶液可完全 催化100g L-精氨酸生成L-瓜氨酸，而在其本源菌中，催化100g L-精氨酸生成L-瓜氨酸则需 要200ml菌体来源的粗酶液，且恶臭假单胞杆菌的培养条件复杂，生产成本较高。此外，经 验证，本发明提供的新方法对另一种来源于威尔李斯特菌的LADI蛋白仍具有促进作用，可 使其粗酶活由0.0165±0.0002U/ml菌液提高至0.1187±0.0023U/ml菌液，提高了7倍左右。 利用Ni柱亲和层析的方法纯化获得的rADI（图3），其最适温度与pH分别为40℃和6.0。 rADI在最适条件下的比酶活为76±0.03U/mg，处于文献中报道的中上游水平，且文献中的精 氨酸脱亚氨基酶在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在，需通过包涵体体外复性进行纯化。
附图说明
图1示分子伴侣GroEL/GroES共表达时，菌体各组分的SDS-PAGE电泳检测结果。
其中M：蛋白分子量Marker；1，2：含有pET-30a-c(+)空载体的菌体破碎上清和沉淀； 3，4：含有pET30a-ADI重组质粒菌体的破碎和沉淀；5，6：含有pET30a-ADI重组质粒与 pGro7质粒共表达菌体的破碎上清和沉淀。
图2示在分子伴侣GroEL/GroES共表达的基础上，添加5g/L L-精氨酸及5g/L D-葡萄糖 时菌体各组分SDS-PAGE电泳检测结果。
其中M：蛋白分子量Marker；1，2：添加5g/L L-精氨酸时重组菌体破碎上清和沉淀；3， 4：添加5g/L D-葡萄糖时重组菌体破碎上清和沉淀；5，6：添加5g/L L-精氨酸及5g/L D-葡 萄糖的含有pET-30a-c(+)空载体的菌体的破碎上清和沉淀；7，8：添加5g/L L-精氨酸及5g/L D-葡萄糖的重组菌体的破碎上清和沉淀。
图3示纯化的rADI的SDS-PAGE电泳图。
图4示在分子伴侣GroEL/GroES共表达的基础上，添加5g/L L-精氨酸和5g/L D-葡萄糖 时菌体制备的粗酶液的转化率曲线。
具体实施方式
实施例1将来源于恶臭假单胞杆菌的精氨酸脱亚氨基酶，构建重组表达载体，在大肠 杆菌中进行异源表达。
（1）将来源于恶臭假单胞杆菌的精氨酸脱亚氨基酶(GenBank accession no.P41142)， 根据表达宿主E.coliBL21(DE3)的密码子频率表，利用“密码子随机分布”的优化策略，对ADI 基因进行全人工合成。然后，利用PCR的方法将限制性内切酶NcoⅠ、HindⅢ的相应酶切位 点克隆到ADI基因上下游，连接至含有6His标签的pET-30a-c(+)载体，构建重组表达载体 pET30a-ADI，并与编码分子伴侣GroEL/GroES的pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中， 获得获得含双质粒（pET30a-ADI与pGro7）的工程菌。
“密码子随机分布”策略指将此氨基酸序列中的每个氨基酸依据密码子频率表中每个密 码子的频率进行加权，然后将编码这个氨基酸的多个密码子随机分配到此氨基酸序列中。例 如：序列中有17个Ala，而编码Ala的密码子GCG，GCC，GCA，GCU在大肠中的频率分 别为0.36，0.27，0.21，0.16。根据“密码子随机分布”的优化原则，此四个密码子在此序列中 的出现次数为：0.36*17=6，0.27*17=5，0.21*17=4，0.16*17=2。
上述重组表达载体pET30a-ADI构建涉及的引物序列如下：
Forward：CATGCCATGGCTATGAGCGCCGAAAAACAGAATATG
Reverse：CCCAAGCTTGATAATCGATAGGGTCGCGAACAATG
（2）将含有双质粒的工程菌株的接种于新鲜的LB培养基（LB培养基配方：10g/L胰 蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl）中，在37℃，200rpm条件下培养16h；
（3）在LB培养基中添加5g/L的D-葡萄糖制得LBG培养基，将步骤（2）培养后的菌 液按体积比为1%的接种量接种于制得的LBG培养基（同时添加40mg/L卡那霉素，20mg/L 氯霉素）中，再添加终浓度为0.4g/L的L-阿拉伯糖诱导表达分子伴侣GroEL/GroES，在37℃， 200rpm条件下培养；
（4）当步骤（3）所述菌体培养至OD600=0.6-0.8时，向培养液中添加终浓度为5g/L的 L-精氨酸，和终浓度为0.1mM的IPTG，在16℃，180rpm条件下诱导培养24h；
（5）将步骤（4）培养后的菌液在4℃，8000rpm条件下离心10-15min，弃上清，沉淀 用体积比为10%的Tris-NaCl缓冲液（50mM Tris,150mM NaCl，pH8.0）重悬，在冰水浴中 进行常规超声破碎，之后在4℃，12000rpm（或15000g）条件下离心30min，分离出可溶性 组分与不溶组分，可溶组分即为含有精氨酸脱亚氨基酶的粗酶液。用SDS-PAGE(12%)电泳 检测重组蛋白表达情况，并对粗酶液进行活性检测。
（6）活性检测方法
采用改良的二乙酰一肟-氨基硫脲比色法检测酶反应液中的L-瓜氨酸含量。添加适量的 ADI酶至含有20mM L-精氨酸的500mM的磷酸钠缓冲液（pH6.0）中，40℃，反应10min。添 加混合酸-铁溶液（7%（V/V）浓磷酸，16%（V/V）浓硫酸，0.05g/L三氯化铁）终止反应， 并添加二乙酰一肟-氨基硫脲溶液（10g/L二乙酰一肟，0.6g/L氨基硫脲）混合，100℃煮沸 10min，在530nm处测量吸光值。粗酶液为菌体细胞经过超声破碎后的可溶性物质。粗酶液 活性为每毫升菌液细胞经超声破碎后获得的可溶性物质的总活性，用U/ml菌液表示。
1Unit定义为每分钟将1μmol L-精氨酸转化为1μmol L-瓜氨酸的酶量。
（7）测定粗酶液转化率
将100ml菌体按步骤（5）所述方法制备的10ml粗酶液平均分成4份，分别在30℃、 40℃条件下，采用底物添加与非添加的方式，并在0、2、3、5、6、8、10、22、28小时进 行取样，检测相应的L-瓜氨酸产量，绘制转化曲线。每组实验均设置三组平行，取平均值。 其中，非添加底物的方式指初始反应液为200ml含有100g/L L-精氨酸的磷酸钠缓冲液 （500mM，pH6.0），而底物添加的方式指将150ml含有100g/L L-精氨酸的磷酸钠缓冲液分 三次添加至50ml含有100g/L L-精氨酸的磷酸钠缓冲液的至总体积为200ml，与非添加组的 总体积及总底物量相同，均为20g L-精氨酸。结果见图4。
实施例2
方法同实施例1，不同的是步骤（3）中的D-葡萄糖浓度为1g/L，步骤（3）中的L-阿 拉伯糖终浓度为0.2g/L，步骤（4）中的L-精氨酸浓度为1g/L。
实施例3
方法同实施例1，不同的是步骤（3）中的D-葡萄糖浓度为10g/L，步骤（3）中的L-阿 拉伯糖终浓度为0.8g/L，步骤（4）中的L-精氨酸浓度为10g/L。