《一种仔猪腹泻抗性相关的分子标记检测方法及应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种仔猪腹泻抗性相关的分子标记检测方法及应用.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310502527.X (22)申请日 2013.10.23 C12N 15/12(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (73)专利权人 湖南农业大学 地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路 1 号 (72)发明人 何俊 张珈榕 马海明 蒋隽 贺长青 (74)专利代理机构 湖南兆弘专利事务所 43008 代理人 江巨鳌 CN 101372712 A,2009.02.25, WO 2010066118 A1,2010.06.17,。
2、 第 6 期 . 仔猪腹泻成因及综合防治技术措 施 .中国畜牧杂志 .2006,58-60. 何俊 . 仔猪腹泻相关基因 GPI1 的筛选及其 功能研究 .中国博士学位论文数据库农业科技 辑 .2012,( 第 11 期 ),D050-35. (54) 发明名称 一种仔猪腹泻抗性相关的分子标记检测方法 及应用 (57) 摘要 本发明属于家畜分子标记制备技术领域， 具 体涉及一种作为猪标记辅助选择应用于猪腹泻抗 性性状相关的分子标记的检测及应用。所述的 分子标记由基因克隆得到， 它的核苷酸序列如序 列表 SEQ ID NO ： 1 所述。在序列表 SEQ ID NO ： 1 的第 625bp 处。
3、有一个 G/T 的碱基突变， 导致 PCR-RFLP-BshN1 多态性。本发明还公开了扩增基 因 DNA 序列所用的引物以及用于多态性的检测方 法。本发明为猪腹泻抗性性状标记辅助选择提供 了新的分子标记。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘涛 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 103525822 B 2016.04.20 CN 103525822 B 1.一种仔猪腹泻抗性相关的GPI1基因片段， 其特征在于： 序列表SEQIDNO： 1的625 bp处的碱基突变为G或T， 导致PCR-RFLP-B。
4、shN1多态性。 2.如权利要求1所述的仔猪腹泻抗性相关的GPI1基因片段在选育具有抗腹泻性状的 猪种中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103525822 B 2 一种仔猪腹泻抗性相关的分子标记检测方法及应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及一种包含如SEQIDNO： 1所示仔猪基因核 苷酸的核酸分子。 本发明还涉及如SEQIDNO： 1所示的多核苷酸序列中的单核苷酸多态性 位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。 背景技术 0002 研究表明， GPI与生物体很多疾病有关。 已知的与人沉积在老年性痴呆、 感染性蛋 白质疾病(包括人的Creutzfeld-。
5、Jakob病， Gerstmann-straussler-scheinker综合症， 库鲁 病和绵羊及山羊的瘙痒症等)、 类风湿关节炎、 非洲昏睡病、 疟疾、 阵发性夜间血红蛋白尿 症、 慢性胃炎、 消化性溃疡和胃癌等有直接关系。 0003 在白念珠菌耐药基因研究中， GPI1被认为与耐药有关(麻志萍等， 2008)。 在朊蛋白 的有关研究中， GPI锚定位点的移除可减少对感染性朊蛋白疾病的易感性， 保护了可溶性的 PrPc转变为支持感染性朊蛋白复制的分子(张太翔， 2008)。 还有研究表明， 缺氧状态下， YC- 1抑制人胰腺癌PC-3细胞血管内皮生长因子(VEGF)和GPI基因转录与其抑。
6、制HIF-1 蛋白的 表达有关， YC-1能够抑制人胰腺癌PC-3细胞生长和增殖。 同时有实验表明， 在鼠的肝脏内腔 隙中存在GPI-PLD， 在移去肝脏以后， 酶的活性明显下降， 在紧接着移植入肝后， 酶的活性明 显增加， 在严重肝疾病时， 酶的活性依赖于肝的合成储备功能， 说明肝是其主要来源。 在病 毒性肝炎及支气管炎肺炎时， 其活性明显上升， 说明GPI-PLD也可作为一个急性期反应物。 竞争性RT-PCR监测在不同恶性程度肿瘤细胞中GPI-PLDmRNA的表达水平， 发现释放大量肿 瘤可溶性预后标记物的卵巢癌细胞与释放少量标记物的卵巢癌细胞相比， 其GPI-PLDmRNA 的表达水平明。
7、显增加(XiaoGuang-fen， 2010)。 0004 人的GPI1基因包含11个外显子， 定位于16pl3.3， 靠近 血红蛋白基因座， GPI1基因 在组织和细胞中的表达无所不在， 尤其在骨髓、 胎儿肝脏等造血组织中的表达显著高于其 他组织。 GPI1基因目前已被确认是GPI生物合成的必需组成部分。 GPI编码产物与糖基磷脂 酰肌醇的合成密切相关。 在生物体的免疫、 代谢等多个方面发挥重要的作用。 可以预见， 由 于GPI1基因对于GPI合成的重要性， GPI1基因对于生物体的疾病有着非常重要的调控作用。 而目前对猪GPI1基因的结构和功能的研究却还不太深入。 0005 本发明选择猪。
8、GPI1基因作为猪腹泻抗性性状的候选基因， 以3个外来猪种(杜洛克 猪、 大白猪、 长白猪)和1个本地猪种 （宁乡猪） 为试验材料， 采用PCR-RFLP方法对GPI1基因G/ T位点的基因频率、 基因型频率进行检测， 并分析其遗传结构， 初步探讨该基因与腹泻抗性 性状的相关性。 目前国内外关于猪GPI1基因的相关研究很少。 本发明将找到与仔猪腹泻抗 性有关的遗传标记， 为筛选ETECF4抗性猪提供可行的标记辅助选择方法， 为选育ETECF4 抗性猪配套系提供理论研究依据。 发明内容 0006 本发明的目的在于找到与仔猪腹泻抗性有关的遗传标记， 为筛选ETECF4抗性猪 说明书 1/5 页 3。
9、 CN 103525822 B 3 提供可行的标记辅助选择方法， 为ETECF4抗性猪的早期选种提供依据， 为选育ETECF4抗 性猪配套系提供理论研究依据。 0007 本发明通过以下技术方案实现： 0008 利用比较基因组学方法， 根据发明人提交到GenBank的GPI1基因序列 （收录号为 JX125039） 和人的GPI1基因的保守区设计引物， 以猪的基因组DNA为模板扩增， 扩增片段利 用测序技术发现SNP， 并利用PCRRFLP进行基因分型， 再利用独立性卡方检验对检测的该 基因SNPs与腹泻抗性的关联度进行分析， 以检验该SNPs的实际应用效果。 0009 （1） PCR引物设计与。
10、序列获得 0010 利用PrimerPremier软件， 根据不同物种的GPI1基因的保守序列制备了检测上述 序列表SEQIDNO： 1基因片段突变的引物对， 所述的引物对的正向引物为5 -CTTGGAGCTAAG CAGTGATGTG-3 ， 反向引物为5 -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3 。 该引物对的退火温度为62 ， 以猪的基因组DNA为模板， 构建20 L的扩增体系， 经过预变性、 变性退火延伸33个循 环以及后延伸的反应过程， 获得了目的片段， 片段核苷酸序列如序列表SEQIDNO： 1所述。 0011 （2） SNP发现与检测方法建立 0012 发明人通过对扩增。
11、序列测序， 得到了一种与仔猪腹泻抗性相关的基因片段， 它的 核苷酸序列如序列表SEQIDNO： 1所述。 序列表SEQIDNO： 1序列的625bp处有1个G/T的碱 基突变， 导致PCR-RFLP-BshN1多态性， PCR产物经BshN1酶切后， 显示出GG、 GT和TT三种基因 型。 0013 发明设计了扩增包含该SNPs的引物， 经分析G/T位点的突变可以采用BshN1进行酶 切检测多态性。 在扩增的809bp的片段上， 存在1个BshN1的酶切位点， 经2%琼脂糖凝胶电泳 检测后结果显示， 在GPI1基因的G/T位点存在3种基因型， GG型 （809bp） 、 GT型 （345bp、。
12、 464bp、 809bp） 和TT基因型 （345bp、 464bp） 。 0014 （3） 基因型腹泻抗性关联分析 0015 利用独立性卡方检验对基因型与腹泻性状进行关联分析， 分析表明在杜洛克猪、 长白猪、 大白猪中T基因为优势等位基因， T基因频率分别为1， 0.99， 0.97， 而在宁乡猪中G基 因为优势等位基因， 基因频率为0.85。 GPI1基因的基因型分布在以这四个猪种为代表的中 外猪种中差异较大， 三个外来品种的仔猪的基因型分布与宁乡猪中的分布差异极显著 （p 0.01） ， 仔猪外显子的两种基因型TT型、 GT型间的腹泻抗性差异显著 （0.01p0.05） ， 尤其 在大。
13、白猪、 长白猪外显子的两种基因型TT型、 GT型间的腹泻抗性差异极显著 （p0.01） ， 表 明杜洛克、 长白猪、 大白猪TT基因型的腹泻个体非常集中， 在杜洛克、 长白猪、 大白猪这三个 品种猪中TT型将可能是腹泻抗性的参考遗传标记。 0016 利用上述制备的与猪腹泻抗性相关的分子标记对不同猪品种的腹泻情况进行了 关联分析的应用， 从而完成了本发明。 附图说明 0017 图1 GPI1基因SNPs位点的PCR扩增产物 0018 图2 GPI1基因SNPs位点的酶切电泳结果 0019 泳道1， 5， 6， 7， 9， 12： GG基因型； 泳道2， 3， 4， 11： GT基因型； 泳道8，。
14、 10： TT基因型； 说明书 2/5 页 4 CN 103525822 B 4 具体实施方式 0020 下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释， 但具体实施方式并不对本发明做 任何限定。 0021 实施例1： 0022 1.引物设计 0023 利用比较基因组学方法根据猪的GPI1基因 （GenBank收录号为JX125039） 的第1外 显子， 以该基因在GenBank作BLAST， 序列比对后筛选出GPI1基因候选SNPs位点， 选取GPI1基 因的第625bp候选SNPs位点， 以JX125039.seq序列为标准， 设计引物， 运用PCRRFLP技术验 证该位点的存在。 0024 引。
15、物序列M-F： 5 -CTTGGAGCTAAGCAGTGATGTG-3 ， 0025 M-R： 5 -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3 0026 2.PCR条件的DNA提取 0027 DNA样品来自4个品种共183头， 其中新五丰原种猪场杜洛克猪26头、 大白猪55头、 长白猪34头； 地方品种宁乡猪68头。 取小块供试猪耳组织提取DNA。 0028 PCR条件： 0029 PCR反应体系 （总体积20 L） ： 10buffer2 L， 2mmol/LdNTPs1.6 L， 20mmol/L MgCl21.6 L， TaqDNA聚合酶 （5U/ L） 0.4 L， DNA模板。
16、 （100ng/ L） 1 L， 上下游引物 （10pmol/ L） 各0.5 L， ddH2O12.4 L。 0030 反应程序： 94预变性5min； 94变性30s， 62退火30s， 72延伸50s， 共33个循 环； 72后延伸5min， 最后4保存。 0031 取10 LPCR扩增产物， 加2 L溴酚蓝上样缓冲液混匀后， 点样于1%的琼脂糖凝胶 （含0.05%EB） 上， 然后点6 L100bpDNAMarkers作为参照。 5V/cm电泳0.51.0h。 电泳结束 后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照， 结果如图1所示。 将纯化后的PCR产物后送铂尚 生物技术公司测序。 0032。
17、 3.PCR产物的BshN1酶切 0033 在10ulPCR产物中加入8ul10内切酶缓冲液、 0.2ul限制性内切酶和2ul双蒸水， 总体积为20.2ul， 37消化4-10h。 G/T位点用2%琼脂糖凝胶电泳分析， 5V/cm电压电泳0.5h， 紫外灯下观察结果并拍照， 酶切结果如图2， 扩增产物进行测序， 序列如SEQIDNO： 1所示， 扩增片断为猪GPI1基因的87bp到895bp之间， 为第1外显子的片断， 共809bp， 为PCR-RFLP- BshN1分子标记， 图2是本发明中GPI1基因， PCR-RFLP的三种基因的TT、 GT和GG电泳结果。 图 中M： DNA分子量标准。
18、 （DL2000ladder） 0034 PCR-RFLP-BshN1多态性在各品种中的分布情况如下表1所示， 由表1可以看出， 在 杜洛克猪、 长白猪、 大白猪中T基因为优势等位基因， T基因频率分别为1， 0.99， 0.97， 而在宁 乡猪中G基因为优势等位基因， 基因频率为0.85。 从四个品种的基因型频率分布来看， TT基 因型在外来品种的杜洛克猪、 长白猪、 大白猪中的分布占优势， 而在宁乡猪中， 两个基因型 的分布差异较大； 卡方检验结果表明， 本试验中的三个外来品种杜洛克猪、 长白猪和大白猪 均处于Hardy-Weinberg平衡状态， 属于平衡群体； 而本地猪种宁乡猪不处于H。
19、ardy- Weinberg平衡状态， 不属于平衡群体。 说明书 3/5 页 5 CN 103525822 B 5 0035 表1不同品种GPI1基因G/T位点的Hardy-Weinberg平衡检验 0036 0037 注： 20.05 （1） =3.84， 20.05(2)=5.99， 20.01(1)=6.63， 20.01(2)=9.21下同。 0038 表2外来品种猪和宁乡猪检测样本的GPI1基因型分布情况 0039 0040 本发明的分子标记在猪腹泻抗性标记性状关联分析中的应用 0041 运用独立性卡方检验对GPI1基因型与猪腹泻抗性进行关联分析， 见表3。 0042 表3GPI1基。
20、因外显子多态位点与仔猪腹泻性状的关联 0043 0044 从表2可以看出， GPI1基因的基因型分布在中外猪种中差异较大， 在三个外来品种 的仔猪 （表中称为仔猪） 与宁乡猪中的分布差异极显著 （p0.01） ， 外来品种中TT基因型为 优势基因， 而宁乡猪恰好相反， GG基因型分布占优势。 表明外来品种和宁乡猪对ETECF4的 敏感性存在极显著差异。 0045 经过卡方检验 （见表3） ， 新五丰仔猪外显子的两种基因型TT型、 GT型间的腹泻抗性 差异显著 （0.01p0.05） ， 而在大白猪、 长白猪外显子的两种基因型TT型、 GT型间的腹泻 抗性差异极显著 （p0.01） ， 表明杜洛。
21、克、 长白猪、 大白猪TT基因型的腹泻个体非常集中， TT 说明书 4/5 页 6 CN 103525822 B 6 型个体数量相对于GT型、 GG型而言， 数量要大很多， 分析出现这一情况可能的原因与品种有 关， 杜洛克猪、 长白猪和大白猪是外来猪种， 都是经过高度选育培育而成， 在培育过程已经 逐步降低敏感基因GG型在群体中的比例， 淘汰了腹泻的敏感基因GG型， 因而在杜洛克猪、 长 白猪和大白猪这三个品种猪中TT型将可能是腹泻抗性的参考遗传标记。 说明书 5/5 页 7 CN 103525822 B 7 0001 序列表 1/1 页 8 CN 103525822 B 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 103525822 B 9 。