技术领域
本发明涉及基于PTO切割及延伸-依赖性切割（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage：PCEC）试验的靶核酸序列的检测 （Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage）。
背景技术
DNA杂交（hybridization）是分子生物学的基本的过程，受离子 强度、碱基结构、核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影 响。基于DNA杂交的技术将成为决定特定核酸序列的非常有用的用具， 将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。
但是，在仅依赖杂交的以往的方法以及过程中，发生因探针和非- 靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，以 往的方法以及过程存在改善可靠度的问题。
除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如， TaqManTM探针方法。
在TaqManTM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针基于上游 引物-依赖性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列 存在的信号（美国专利第5,210,015号、第5,538,848号以及第6,326,145 号）。TaqManTM探针方法提出用于信号产生的两种接近法：聚合-依 赖性切割（polymerization-dependent cleavage）以及聚合-独立性切割 （poly merization-independent cleavage）。在聚合-依赖性切割中，上游 引物的延伸必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触之前发生。 随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚 合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与靶核酸序列 进行杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合 酶与标记探针的5’-末端接触来放出标记。并且，TaqManTM探针方 法公开，通过在其5’-末端部位具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域 的标记探针被切割来形成包含5’-尾巴区域的片段。
也有对具有对靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶 切割，放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。
例如，美国专利第5,691,142号就公开了对基于DNA聚合酶的5’ 核酸酶活性来被切割的切割结构。公开中则例示有对包含对模板非-互 补的5’部位以及对模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，并且 上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的切割结构。切 割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者具有减少的合成 活性的变形DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后， 被放出的5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由 此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。
美国专利第7,381,532号则公开了具有3’-末端被阻断的上游寡核 苷酸的切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核 酸酶切割，来放出非-互补的5’皮瓣（flap）部位，被放出的5’皮瓣 部位基于大小分析或者相互作用性双重标记来被检测的过程。美国专 利第6,893,819号则公开了能够检测的被放出的皮瓣基于核酸合成依赖 性的、皮瓣-媒介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一 个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成依赖性方式切割第二个切割结构 来放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。
美国申请公开号第2008-0241838号中公开了利用在靶核酸序列具 有非-互补的5’部位的探针的切割以及捕捉（capture）探针的杂交的 靶检测方法。标记位于非-互补的5’部位。杂交于靶序列的标记探针 被切割而放出片段，之后，片段与捕捉探针杂交而检测靶序列的存在。 在此方法中，未切割的/完好无损的（uncleaved/intact）探针不与捕捉 探针杂交是必须的。为此，需要长度短的捕捉探针在固相基质上实现 固定化。但是，这种限制会降低固相基质上的杂交效率，并且使反应 条件的最优化变得困难。
因此，对开发以更加便利、具有可靠性以及再现性的方式，不仅 基于杂交，还基于5’核酸切割反应（5’nucleolytic reaction）等的酶 反应，在液相以及固相中检测靶序列，更为优选地检测多个靶序列的 新颖的接近法的要求正在抬头。并且，在本行业正需求一种不受限于 标记（尤其，荧光标记）种类的数量的新颖的靶检测方法。
在本说明书全文中参照多个专利及文献，其引用由括号来表示。 这样的专利及文献的公开，作为参照全部包括在本说明书中，因此能 够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。
发明内容
要解决的问题
本发明者为了开发具有更加得到改善的准确性以及方便性的，尤 其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果， 本发明者定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测不仅通过 探针杂交，还通过连续的切割反应，即PTO的5’核酸切割反应及延 伸二聚物的核酸切割反应而达成）。本发明的方案不仅优秀地适用于固 相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，具有更加得到改善的准 确性以及方便性，能够检测多个靶序列。
因此，本发明的目的在于，提供利用PCEC（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage）试验，从DNA或者核酸混合物中检测 靶核酸序列的方法。
本发明的再一目的在于，提供用于利用PCEC（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage）试验，从DNA或者核酸混合物中检测 靶核酸序列的方法的试剂盒。
本发明的另一目的及优点，通过所附的权利要求书及附图，以及 下面的详细说明将变得更加明确。
附图说明
图1表示利用于PCEC（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage）试验的探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）以及捕捉和模板化寡核苷酸（CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide）的图示性结构。优选地，PTO以及CTO的 3’-末端因被阻断，因而防止延伸。
图2表示利用被5’→3’外切核酸酶切割的切割位点的PCEC试 验的实施例。CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图3表示利用被限制酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。 CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图4表示利用被RNase H切割的切割位点的PCEC试验的实施例。 CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图5表示利用被5’→3’外切核酸酶切割的切割位点的PCEC试 验的实施例。CTO在其模板化部位具有荧光单一标记。CTO通过其3’ -末端固定在固相基质上。
图6表示利用被限制酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。 CTO在其捕捉部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固 相基质上。
图7表示利用被RNase H切割的切割位点的PCEC试验的实施例。 CTO在其捕捉部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固 相基质上。
图8表示利用被限制酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。 PTO在其标记部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固 相基质上。
图9表示利用被RNase H切割的切割位点的PCEC试验的实施例。 PTO在其标记部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固 相基质上。
图10表示基于PCEC试验的淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae） 基因的实时检测结果。CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
具体实施方式
根据本发明的一实施方式，本发明提供一种基于PCEC（PTO切 割及延伸-依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸 序列的方法，其特征在于，包括：
步骤（a），将上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO进行杂 交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列； 上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的 杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列 非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上 述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上 述PTO的上游；
步骤（b），在用于切割上述PTO的条件下，将上述步骤（a）的 结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延 伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种 上述切割放出包含上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部 分的片段；
步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段与CTO进行杂交；上 述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO 的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及 （ii）模板化部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向 部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO 的捕捉部位杂交；
步骤（d），利用上述步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚 合酶来实施延伸反应；杂交于上述CTO的捕捉部位的上述片段，通过 被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点；
步骤（e），利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，用于生 成切割的片段；以及
步骤（f），检测上述延伸二聚物是否发生切割，上述延伸二聚物 发生切割表示上述靶核酸序列存在。
本发明者为了开发具有更加得到改善的准确性以及方便性的，尤 其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果， 本发明者定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测不仅通过 探针杂交，还通过连续的切割反应，即PTO的5’核酸切割反应及延 伸二聚物的核酸切割反应而达成）。本发明的方案不仅优秀地适用于 固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，具有更加得到改善的 准确性以及方便性，能够检测多个靶序列。
本发明利用基于以下连续的核酸切割反应，即，基于5’核酸切 割反应的探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）的第一次切割及基于核酸切割反应的延伸二聚物的第 二次切割，生成靶信号。因此，本发明被命名为PCEC（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage）试验。
对本发明PCEC试验进行更详细的说明，如下。
步骤（a）：靶核酸序列和上游寡核苷酸及PTO的杂交
根据本发明，首先将靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记 的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）进行杂交。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶 序列”意味着所要检测的核酸序列，且，在杂交、退火或者扩增条件 下与探针或者引物进行退火或者杂交。
在本说明书中使用的术语“探针（probe）”意味着与靶核酸序列 实质上互补的部位或者包含这些部位的单-链核酸分子。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核 酸链（模板）互补的引物延伸产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA 聚合酶等聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的 起始点的作用。
优选地，探针以及引物为单-链脱氧核糖核苷酸分子。在本发明中 利用的探针或者引物可包含天然（naturally occurring）脱氧单磷酸核苷 （dNMP）（即，脱氧腺苷酸（dAMP）、dGMP（脱氧鸟苷酸）、dCMP （脱氧胞苷酸）及dTMP（脱氧胸苷酸））、变形的核苷酸或者非-天 然核苷酸。并且，探针或者引物还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延伸 产物的合成。引物的适合的长度取决于包括例如，温度、应用领域及 引物的根源（source）的多个因素。在本说明书中使用的术语“退火” 或“引发”意味着在模板核酸并置（apposition）寡脱氧核苷酸或者核 酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或 者其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交（hybridization）”意味着互补的 单链核酸形成双链核酸。在两个核酸链之间的互补性完全匹配（perfect match）时发生杂交，或者即使存在一部分错配（mismatch）碱基也能 发生杂交。杂交时所需的互补性的程度可随着杂交条件而不同，尤其 是可通过温度来进行调节。
上游寡核苷酸以及PTO与靶核酸序列的杂交可在通常基于最佳化 步骤而决定的合适的杂交条件下实施。温度、成分的浓度、杂交及清 洗次数、缓冲液成分及它们的pH及离子强度等条件可根据包含寡核苷 酸（上游寡核苷酸以及PTO）的长度及糖皮质激素（GC）含量以及靶 核苷酸序列等的多种因子而变化。例如，在利用相对短的寡核苷酸的 情况下，优选地，选择低的严格条件（stringent condition）。用于杂交 的详细条件可以在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor5，N.Y. （2001）；及M.L.M.Anderson，Nucleic Acid Hybridization， Springer-Verlag New York Inc.N.Y.（1999）确认。
术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。
上游寡核苷酸以及PTO具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序 列。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或 者严格条件下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分 地互补，并包括“实质上互补的（substantially complementary）”及“完 全互补的（perfectly complementary）”，优选地意味着完全互补的意 思。
PTO的5’-标记部位具有与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。捕 捉和模板化寡核苷酸（CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide） 的模板化部位具有与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的 核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“非-互补的”意味着在预定的 退火条件或者严格条件下引物或者探针不以选择性地与靶核酸序列杂 交的程度充分地非-互补，并包括“实质上非互补的（substantially non-complementary）”及“完全非-互补的（perfectly non-complementary）”，优选地意味着完全非-互补的意思。
在本说明书中使用的术语“探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）”意味着寡核苷酸，其包含：（i）3’- 靶向部位，其起到探针的作用；以及（ii）5’-标记部位，其具有在与 靶核酸序列杂交后被切割，进而从PTO放出，并与靶核酸序列非-互补 的核苷酸序列。PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位必须以5’→3’ 顺序而置。在图1中图示PTO。
优选地，在3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，5’-标记部位不与 靶核酸序列杂交的严格条件下实施步骤（a）的杂交。
PTO不要求任何特定的长度。例如，PTO的长度可具有15-150核 苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-150 核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-50核苷酸、 30-150核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸、30-50 核苷酸、35-100核苷酸、35-80核苷酸、35-60核苷酸或者35-50核苷 酸的长度。只要PTO的3’-靶向部位与靶核酸序列特异性地杂交，就 可以具有任何长度。例如，PTO的3’-靶向部位可具有10-100核苷酸、 10-80核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、15-100核 苷酸、15-80核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸、20-100 核苷酸、20-80核苷酸、20-50核苷酸、20-40核苷酸或者20-30核苷酸 的长度。只要5’-标记部位与CTO的模板化部位特异性地杂交后被延 伸，就可以具有任何长度。例如，PTO的5’-标记部位可具有5-50核 苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-50核苷酸、10-40 核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、 15-30核苷酸或者15-20核苷酸的长度。
PTO的3’-末端还可具有3’-OH末端（terminal）。优选地，PTO 的3’-末端被“阻断”，由此防止其延伸。
阻断可通过以往方法来达成。例如，阻断可通过在最后核苷酸的 3’-羟基上追加如生物素、标记、磷酸盐基、烷基、非-核苷酸连接肽、 硫代磷酸酯或者烷烃-二醇残基等的化学组成部分（moiety）来实施。 择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或者利用如双脱氧 核苷酸这种没有3’-羟基的核苷酸来实施。
择一性地，可设计成使PTO具有发夹结构。
PTO的5’-标记部位以及靶核酸序列之间的非-杂交意味着在特定 杂交条件下它们之间非-形成稳定的双-链。根据本发明的优选实施例， 不参与与靶核酸序列的杂交的PTO的5’-标记部位形成单-链。
上游寡核苷酸位于PTO的上游。
并且，与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于 具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
基于上游寡核苷酸的对PTO切割的诱导可通过两种方式来达成。 （i）诱导上游寡核苷酸延伸-独立性切割；以及（ii）诱导上游寡核苷 酸延伸-依赖性切割。
在上游寡核苷酸与PTO相邻近，进而能够充分诱导基于具有5’ 核酸酶活性的酶的上述PTO的切割反应的情况下，与上游寡核苷酸结 合的上述酶能够无需延伸反应而切割PTO。另一方面，在上游寡核苷 酸与PTO隔开的情况下，具有聚合酶活性的酶（例如，模板-依赖性聚 合酶）能够促进上游寡核苷酸（例如，上游引物）的延伸，与延伸产 物结合的具有5’核酸酶活性的酶切割PTO。
因此，上游寡核苷酸能够以两种方式位于与PTO相对的位置。上 游寡核苷酸可位于与PTO邻近的位置，由此以延伸-独立性方式能够充 分诱导PTO的切割。择一性地，上游寡核苷酸可位于充分能够以延伸- 依赖性方式诱导PTO切割的与PTO隔开的位置。
在本说明书中揭示方位（positions）或者位置（locations）而使用 的术语“邻近的（adjacent）”意味着上游寡核苷酸紧位于与PTO的3’ -靶向部位相近的位置形成缺口（nick）。并且，上述术语意味着上游 寡核苷酸位于从PTO的3’-靶向部位隔开1-30核苷酸、1-20核苷酸或 者1-15核苷酸的位置。
在本说明书中揭示方位或者位置而使用的术语“隔开（distant）” 包含能够充分产生延伸反应的某种位置或者位点。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸可位于从PTO隔开的位 置，由此以延伸-依赖性方式能够充分诱导PTO的切割。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸为上游引物或者上游探 针。上游引物适合诱导延伸-独立性切割或者延伸-依赖性切割，上游探 针适合诱导延伸-独立性切割。
选择性地，上游寡核苷酸可具有与PTO的3’-靶向部位的5’- 一部分部分重叠的序列（partial-overlapped sequence）。优选地，重叠 的序列为1-10核苷酸长度、更优选为1-5核苷酸长度、进而优选为1-3 核苷酸长度。在上游寡核苷酸具有与PTO的3’-靶向部位的5’-一部 分部分重叠的序列（partial-overlapped sequence）的情况下，在步骤（b） 的切割反应中，3’-靶向部位将与5’-标记部位一起被部分切割。并且， 重叠的序列能够使3’-靶向部位中所需的特定部位被切割。
根据本发明的优选实施例，上游引物通过其延伸链来诱导基于具 有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
只要上游寡核苷酸能够诱导与靶核酸序列杂交的PTO的切割，使 得包含PTO的5’-标记部位或者PTO的5’-标记部位的一部分的片段 被放出，与基于上游寡核苷酸的切割反应相关的以往技术就能够适用 于本发明。例如，美国专利第5,210,015号、第5,487,972号、第5,691,142 号、第5,994,069号、第7,381,532号以及美国申请公开号第 2008-0241838号就能够应用于本发明。
根据本发明的优选实施例，上述方法在存在下游引物的情况下实 施。下游引物能够使与PTO杂交的靶核酸序列追加生成，并能够提高 靶检测的灵敏度。
根据本发明的优选实施例，在利用上游引物以及下游引物的情况 下，为了引物的延伸可追加使用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸（上游引物或者上游探 针）、下游引物和/或PTO的5’-标记部位具有由本发明者开发的双重 引发寡核苷酸（DPO）结构。具有DPO结构的寡核苷酸与以往引物以 及探针相比表现出相当得到改善的靶特异度（参照WO2006/095981； Chun等，Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19gene，Nucleic Acid Research，35:6e40（2007））。
根据本发明的优选实施例，PTO的3’-靶向部位具有由本发明者 开发的变形双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构。变形双重特异性寡核 苷酸（mDSO）结构与以往的探针相比表现出相当得到改善的靶特异性 （参照WO2011/028041）。
步骤（b）：从PTO放出片段
接着，在用于切割PTO的条件下，将上述步骤（a）的结果物与 具有5’核酸酶活性的酶相接触。与靶核酸序列杂交的PTO被具有5’ 核酸酶活性的酶切割，因而放出包含PTO的5’-标记部位或者5’-标 记部位的一部分的片段。
在本说明书中使用的术语“用于切割PTO的条件”意味着基于具 有5’核酸酶活性的酶产生对与靶核酸序列杂交的PTO的切割的充分 的条件，例如，温度、pH、离子强度及缓冲液、寡核苷酸的长度及序 列和酶。例如，在利用作为具有5’核酸酶活性的酶的Taq DNA聚合 酶的情况下，用于切割PTO的条件包含Tris-HCl缓冲液、氯化钾（KCl）、 氯化镁（MgCl2）以及温度。
在PTO与靶核酸序列杂交的情况下，虽然3’-靶向部位进行杂交， 但是其5’-标记部位则不与靶核酸序列杂交而形成单-链（参照图2）。 像这样，将单-链以及双-链结构都包含在内的寡核苷酸可基于在本领域 被告知的多种技术，利用具有5’核酸酶活性的酶来切割。
PTO的切割位点根据上游寡核苷酸（上游探针或者上游引物）的 种类、上游寡核苷酸的杂交位置以及切割条件会不同（美国专利第 5,210,015号、第5,487,972号、第5,691,142号、第5,994,069号以及第 7,381,532号或者美国申请公开号第2008-0241838号）。
为了PTO的切割反应可利用多个以往技术，会放出包含5’-标记 部位或者5’-标记部位的一部分的片段。
综合来看，在步骤（b）的切割反应中可有三种切割位点。第一切 割位点为PTO的杂交部位（3’-靶向部位）以及非-杂交部位（5’-标 记部位）之间的连接位置（junction site）。第二切割位点为从PTO的5’ -标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一部分核苷酸的位置。第三切 割位点为从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着5’-方向隔开一部分 核苷酸的位置。
根据本发明的优选实施例，上游引物被延伸的同时基于具有5’ 核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶而开始切割PTO的位置是PTO及靶 核酸序列之间的双链开始的地点或者从其开始的地点隔开1-3核苷酸 的位置。
因此，在本说明书中揭示基于具有5’核酸酶活性的酶的对PTO 的切割而使用的术语“包含PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的 一部分的片段”意味着包含（i）5’-标记部位、（ii）5’-标记部位以 及3’-靶向部位的5’-末端的一部分、以及（iii）5’-标记部位的一部 分。并且，在本发明中，术语“包含PTO的5’-标记部位或者5’-标 记部位的一部分的片段”表现为“PTO片段”。
在本说明书中揭示如同PTO的5’-标记部位的一部分、PTO的3’ -靶向部位的5’-末端的一部分以及CTO的捕捉部位的5’-末端的一 部分的PTO或者CTO而使用的术语“一部分（part）”意味着由1-40、 1-30、1-20、1-15、1-10或者1-5核苷酸构成的核苷酸序列，优选为1 核苷酸、2核苷酸、3核苷酸或者4核苷酸。
根据本说明书的优选实施例，具有5’核酸酶活性的酶为具有5’ 核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核酸酶，更优选为具有5’核酸酶 活性的热稳定性DNA聚合酶或者FEN核酸酶。
适合于本发明的具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶为从多种细菌 种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermus aquaticus（Taq）、 Thermus thermophilus（Tth）、Thermus filiformis、Thermis flavus、 Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、 Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosipho africanus、Thermococcus litoralis、 Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、 Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus woesei、 Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifex pyrophilus以及Aquifex aeolieus。最优选地，热稳定性DNA聚合酶为 Taq聚合酶。
择一性地，本发明可使用变形为具有聚合酶活性的、具有5’核 酸酶活性的DNA聚合酶。
所使用的皮瓣内切核酸酶（FEN，flap endonuclease）为5’皮瓣- 特异性核酸酶（5’flap-specific nuclease）。
适合于本发明的FEN核酸酶包含从多种细菌种得到的FEN核酸 酶，其包含Sulfolobus solfataricus、Pyrobaculum aerophilum、 Thermococcus litoralis、Archaeaglobus veneficus、Archaeaglobus profundus、Acidianus brierlyi、Acidianus ambivalens、Desulfurococcus amylolyticus、Desulfurococcus mobilis、Pyrodictium brockii、 Thermococcus gorgonarius、Thermococcus zilligii、Methanopyrus kandleri、Methanococcus igneus、Pyrococcus horikoshii、Aeropyrum pernix 以及Archaeaglobus veneficus。
优选地，在步骤（a）中利用上游引物的情况下，用于切割PTO 的条件包含上游引物的延伸反应。
根据本发明的优选实施例，在步骤（a）中利用上游引物，为了使 上述上游引物延伸而利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶 为与具有5’核酸酶活性的酶相同的酶。
选择性地，在步骤（a）中利用上游引物，为了使上述上游引物延 伸而利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核 酸酶活性的酶不同的酶。
择一性地，本发明无需利用上游寡核苷酸。PTO可通过上游寡核 苷酸-独立性5’核酸酶活性切割。在这种情况下，可利用具有上游寡 核苷酸-独立性5’核酸酶活性的以往酶。在具有5’核酸酶活性的模板 -依赖性聚合酶中，存在具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的一 些部分酶，例如，Taq DNA聚合酶。
鉴于靶核酸序列的扩增及PTO的切割效率，优选地，利用上游寡 核苷酸来实施本发明的PCEC试验。
步骤（c）：从PTO放出的片段与CTO的杂交
从PTO放出的片段与CTO（Capturing and Templating Oligonucleotide）杂交。
CTO沿着3’→5’方向包含（i）捕捉部位，其包含与上述PTO 的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及 （ii）模板化部位，其包含与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位 非-互补的核苷酸序列。
CTO起到用于延伸从PTO放出的片段的模板的作用。起到引物作 用的上述片段与CTO杂交，通过被延伸来形成延伸二聚物。
只要模板化部位具有与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非 -互补的序列，就可以包含任何序列。并且，只要模板化部位能够起到 用于延伸从PTO放出的片段的模板的作用，就可以包含任何序列。
如上所述，优选地，在放出具有PTO的5’-标记部位的片段的情 况下，CTO的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸 序列。优选地，在放出具有5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末 端的一部分的片段的情况下，CTO的捕捉部位应被设计成包含与5’- 标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸序列。 优选地，在放出具有PTO的5’-标记部位的一部分的片段的情况下， CTO的捕捉部位应被设计成具有与5’-标记部位的一部分互补的核苷 酸序列。
另一方面，可通过预想PTO的切割位点来设计CTO的捕捉部位。 例如，在CTO的捕捉部位被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸 序列的情况下，具有5’-标记部位的一部分的片段或者具有5’-标记 部位的片段可与捕捉部位杂交，之后将被延伸。在放出包含5’-标记 部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，上述片段 可能与被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的CTO的捕捉 部位杂交，即使在上述片段的3’-末端部位存在错配核苷酸，也能够 成功地被延长。这是由于即使引物的3’-末端包含一部分错配核苷酸 （例如，1-3错配核苷酸），引物也能够根据反应条件而被延长。
在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分 的片段的情况下，通过将CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分设计成 具有与上述被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸 序列，就能够解决与错配核苷酸相关的问题（参照图1）。
优选地，对与被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的 CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分的核苷酸序列，可根据PTO的3’ -靶向部位上的预想到的切割位点来选择。优选地，与被切割的3’-靶 向部位的5’-末端的一部分互补的CTO的捕捉部位的5’-末端的一部 分的核苷酸序列为1-10核苷酸，更优选为1-5核苷酸，进而优选为1-3 核苷酸。
CTO的3’-末端可包含不包含于与片段的杂交的追加的核苷酸。 并且，只要CTO与上述片段稳定地杂交，CTO的捕捉部位就能够包含 仅仅与上述片段的一部分（例如，包含片段的3’-末端部位的片段的 一部分）互补的核苷酸序列。
对在本说明书中使用的术语“包含与5’-标记部位或者5’-标记 部位的一部分互补的核苷酸序列的捕捉部位”，如同上述，将包含CTO 的捕捉部位的多种设计以及结构来进行说明。
CTO可被设计成具有发夹结构。
CTO的长度可以是多种的。例如，CTO具有7-1000核苷酸、7-500 核苷酸、7-300核苷酸、7-100核苷酸、7-80核苷酸、7-60核苷酸、7-40 核苷酸、15-1000核苷酸、15-500核苷酸、15-300核苷酸、15-100核苷 酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-1000核苷酸、20-500 核苷酸、20-300核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、 20-40核苷酸、30-1000核苷酸、30-500核苷酸、30-300核苷酸、30-100 核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸或者30-40核苷酸的长度。只要 与从PTO放出的片段特异性地杂交，CTO的捕捉部位就可以具有任何 长度。例如，CTO的捕捉部位可以具有5-100核苷酸、5-60核苷酸、 5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-100核苷酸、10-60核苷 酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-100核苷酸、15-60 核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或者15-20核苷酸的长度。并且， 只要CTO的模板化部位在从PTO放出的片段的延伸反应中起到模板作 用，CTO的模板化部位就可以具有任何长度。例如，CTO的模板化部 位可以具有1-900核苷酸、1-400核苷酸、1-300核苷酸、1-100核苷酸、 1-80核苷酸、1-60核苷酸、1-40核苷酸、1-20核苷酸、2-900核苷酸、 2-400核苷酸、2-300核苷酸、2-100核苷酸、2-80核苷酸、2-60核苷 酸、2-40核苷酸、2-20核苷酸、5-900核苷酸、5-400核苷酸、5-300 核苷酸、5-100核苷酸、5-80核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30 核苷酸、10-900核苷酸、10-400核苷酸、10-300核苷酸、15-900核苷 酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸或者 15-20核苷酸的长度。
CTO的3’-末端可以具有3’-OH末端。优选地，CTO的3’-末 端被阻断成防止其延伸。通过以往方法就能够达到阻断CTO的非-延 伸。例如，可以通过在CTO的最后核苷酸的3’-羟基追加如生物素、 标记、磷酸基、烷基、非-核苷酸连接肽、磷硫酰或者烷烃-二醇残基等 的化学性的部分（moiety）来实施阻断。择一性地，阻断可通过去除最 后核苷酸的3’-羟基或者利用如双脱氧核苷酸这种没有3’-羟基的核 苷酸来实施。
从PTO放出的片段与CTO杂交，提供适合于片段的延伸的形态。 并且，即使非切割PTO通过其5’-标记部位来与CTO的捕捉部位杂交， 由于PTO的3’-靶向部位不会与CTO杂交，因而防止延伸二聚物的形 成。
参照对步骤（a）中的杂交的说明，就能够更详细地说明步骤（c） 中的杂交。
步骤（d）：PTO片段的延伸及核酸切割酶的切割位点的生成
利用模板-依赖性核酸聚合酶以及步骤（c）的结果物来实施延伸 反应。与CTO的捕捉部位杂交的PTO片段，通过被延伸来形成延伸二 聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点（site）。相反，与CTO的 捕捉部位杂交的非切割PTO则不被延伸也不会因此而生成被核酸切割 酶切割的切割位点（site）。
在本说明中使用的术语“延伸二聚物”意味着基于将模板-依赖 性核酸聚合酶和CTO的模板化部位利用为模板使与CTO的捕捉部位 杂交的片段被延伸的延伸反应而形成的二聚物。
通过形成延伸二聚物来生成可被核酸切割酶切割的切割位点。本 领域所知，有着对二聚物起到特异性作用的许多核酸切割酶。本发明 的核酸切割酶提供表示靶核酸序列的存在的信号。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是限制酶，CTO的模板化 部位包含被限制酶识别的序列，步骤（d）中的延伸二聚物的形成用于 生成限制酶的切割位点。生成限制酶切割位点的延伸二聚物被限制酶 切割而形成切割片段，这将表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是核糖核酸酶，CTO的模 板化部位包含RNA序列，上述步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来 形成DNA-RNA混合二聚物，由此生成核糖核酸酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶， 通过形成步骤（d）的延伸二聚物，在CTO上生成5’→3’外切核酸 酶的切割位点。CTO上的切割位点在形成延伸二聚物之后生成，并且 被5’→3’外切核酸酶切割而形成包含CTO的5’-末端的切割片段， 这将表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实施例，被通过形成延伸二聚物来生成的核酸 切割酶切割的切割位点是用于切割DNA二聚物、RNA二聚物或 DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶的切割位点。
PTO和/或CTO用于生成所需种类的核酸切割酶的切割位点。
优选地，要生成作用于DNA二聚物的核酸切割酶（例如，限制酶 及5’→3’外切核酸酶）的切割位点的情况下，分别利用由DNA分子 组成的PTO及CTO。由DNA分子组成的PTO片段利用dNTPs而被延 伸，来形成延伸二聚物，由此生成作用于DNA二聚物的核酸切割酶（例 如，限制酶及5’→3’外切核酸酶）的切割位点。
优选地，要生成作用于RNA二聚物的核酸切割酶的切割位点的情 况下，利用由RNA分子组成的PTO或包含由RNA分子组成的5’- 标记部位的PTO以及由RNA分子组成的CTO。与由RNA分子组成的 CTO进行杂交的由RNA分子组成的PTO片段利用NTPs而被延伸， 来形成延伸二聚物，由此生成作用于RNA二聚物的核酸切割酶的切割 位点。
优选地，要生成作用于DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶的切 割位点的情况下，利用由DNA分子组成的PTO及包含由RNA分子组 成的模板化部位的CTO。模板化部位的RNA分子包含1-10个核糖核 苷酸。与包含由RNA分子组成的模板化部位的CTO进行杂交的由DNA 分子组成的PTO片段利用dNTPs而被延伸，来形成延伸二聚物，由此 生成作用于DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶（例如，RNase H）的 切割位点。
在步骤（d）中使用于延伸反应的模板-依赖性核酸聚合酶包含任 何核酸聚合酶，例如，E.coli DNA聚合酶I的“克列诺（Klenow）” 片段、热稳定性DNA聚合酶以及噬菌体T7DNA聚合酶。优选地，上 述核酸聚合酶是能够从多种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包 含Thermus aquaticus（Taq）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、 Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、 Thermus species sps17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、 Thermotoga neapolitana、Thermosipho africanus、Thermococcus litoralis、 Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、 Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus furiosus （Pfu）、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、 Pyrodictium occultum、Aquifex pyrophilus以及Aquifex aeolieus。最为 优选地，模板-依赖性核酸聚合酶为Taq聚合酶。
根据本发明的优选实施例，在步骤（b）中利用的具有5’核酸酶 活性的酶与在步骤（d）中利用的模板-依赖性核酸聚合酶是相同的。更 为优选地，在步骤（b）中利用的具有5’核酸酶活性的酶、为了使上 游引物延伸而利用的模板-依赖性核酸聚合酶以及在步骤（d）中利用的 模板-依赖性核酸聚合酶是相同的。
步骤（e）：利用核酸切割酶的延伸二聚物的切割
通过形成延伸二聚物来生成核酸切割酶的切割部位之后，利用适 当的核酸切割酶来切割延伸二聚物，形成切割片段。
根据本发明的优选实施例，延伸二聚物的切割片段可以是单链或 者双链，可通过切割延伸二聚物来形成至少2种的片段。例如，基于 限制酶切割延伸二聚物来形成双链形态的2种的切割片段，上述双链 片段可根据反应条件分离为单链形态。在利用5’→3’外切核酸酶的 切割反应中，可形成单一切割片段。
本说明书中，步骤（b）的切割反应为第一次切割反应，步骤（e） 的切割反应是第二次切割反应。
第二次切割反应中利用的核酸切割酶也包含本领域公知的任何 酶。
根据本发明的优选实施例，第二次切割反应中利用的核酸切割酶 是5’→3’外切核酸酶、限制酶及核糖核酸酶，更优选为热稳定性5’ →3’外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶。
根据本发明的优选实施例，第二次切割反应中利用的核酸切割酶 包含特异性地作用于二聚物分子的核酸切割酶。
上述核酸切割酶中，5’→3’外切核酸酶切割DNA二聚物的5’ -末端。如图2及图5所示，通过切割与靶核酸序列进行杂交的PTO来 形成的PTO片段与CTO进行杂交之后被延伸而形成延伸二聚物。延伸 二聚物中，CTO的5’-末端被5’→3’外切核酸酶切割而形成切割片 段，这将表示靶核酸序列的存在。
具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶具有5’→3’外 切核酸酶活性，一些聚合酶也具有5’→3’内切核酸酶活性。
具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶在步骤（b）中可诱 导上游寡核苷酸-依赖性切割反应（参照美国专利第5,210,015号）。并 且，这些还可以诱导上游寡核苷酸-独立性切割反应（参照lawyer et al， Genome Res.1993，2：275-287及WO2008/011004）。
根据本发明的优选实施例，5’→3’外切核酸酶是具有5’→3’ 外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶，更优选为热稳定性DNA 聚合酶。参照步骤（b）的记载内容，可详细说明热稳定性DNA聚合 酶。优选地，用于切割延伸二聚物的5’→3’外切核酸酶是Taq聚合 酶。
根据本发明的优选实施例，具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA 聚合酶诱导上游寡核苷酸-独立性切割反应，由此可在步骤（e）中切割 延伸二聚物。
根据本发明的优选实施例，具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA 聚合酶不仅在步骤（b）中诱导上游寡核苷酸-依赖性切割，还可在步骤 （e）中诱导延伸二聚物的上游寡核苷酸-独立性切割。
根据本发明的优选实施例，基于模板-依赖性DNA聚合酶的5’→ 3’外切核酸酶活性的延伸二聚物的上游寡核苷酸-独立性切割由于提供 表示延伸二聚物发生切割的信号，因而呈现充分的效率。
根据本发明的优选实施例，基于具有上游寡核苷酸-独立性5’核 酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶进行的延伸二聚物的切割受到存 在于延伸二聚物的标记的位点或标记的结合类型的影响。优选地，标 记与延伸二聚物的CTO的5’-末端相结合的情况下，基于具有5’核 酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的延伸二聚物的切割，在标记与 CTO的5’-末端的磷酸基相连接的情况下，尤其是，以碳间隔区（carbon spacer）为媒介相连接的情况下更有效。标记与CTO的5’-末端的碱 基相连接或者不以碳间隔区为媒介相连接的情况下，延伸二聚物有可 能不发生切割。
优选地，利用5’→3’外切核酸酶作为核酸切割酶的情况下，用 于检测延伸二聚物是否发生切割的标记不与PTO相结合。
在核酸切割酶中的限制酶用于切割在上述步骤（d）中通过形成延 伸二聚物而生成的限制酶切割位点。如图3、图6及图8所示，通过切 割与靶核酸序列进行杂交的PTO的片段而形成的PTO片段与CTO（包 含被限制酶识别的序列）进行杂交之后被延伸，由此形成具有限制酶 切割位点的延伸二聚物。限制酶以核酸内部切割方式 （endonucleolytically）切割这种延伸二聚物来形成切割片段，这将表 示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实施例，限制酶是能够特异性地识别二聚物的 特定序列来切割该序列的限制酶，更优选为热稳定性限制酶。可利用 本领域公知的多种限制酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是核糖核酸酶，CTO的模 板化部位包含RNA序列，步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来形成 DNA-RNA混合二聚物，由此生成核糖核酸酶的切割位点。核糖核酸酶 的切割位点在步骤（e）中被核糖核酸酶切割而形成表示靶核酸序列的 存在的切割片段。
根据本发明的优选实施例，本发明中利用的核糖核酸酶是RNase H或ExoⅢ。
RNase H是可切割DNA-RNA混合二聚物的RNA部位的内切核糖 核酸酶之一。优选地，在本发明中利用RNase H的情况下，CTO在模 板化部位包含RNA分子。如图4、图7及图9所示，通过切割与靶核 酸序列进行杂交的PTO而形成的PTO片段与CTO的模板化部位进行 杂交之后被延伸来形成DNA-RNA混合延伸二聚物。RNase H以核酸 内部切割方式（endonucleolytically）切割DNA-RNA混合延伸二聚物 来形成切割片段，这将表示靶核酸序列的存在。
众所周知，ExoⅢ具有RNase活性（Mol CD，et al.，Nature374 （6520）：381–386（1995））。在本发明中利用ExoⅢ的情况下， 以与RNase H相同的方式形成表示靶核酸序列的存在的切割片段。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是热稳定性核酸切割酶。
步骤（e）：检测表示靶核酸序列的存在的延伸二聚物是否发生切 割
延伸二聚物的切割反应之后，检测延伸二聚物是否发生切割，从 而确认靶核酸序列的存在。
可通过多种方法来检测延伸二聚物是否发生切割。
可通过直接分析延伸二聚物的切割片段来检测延伸二聚物是否发 生切割，例如，有毛细管电泳（capillary electrophoresis）。在这种情况 下，优选地，PTO和/或CTO被制作成使切割片段具有单一荧光标记， 由此能够以更方便的方式检测切割片段。
根据本发明的优选实施例，利用信号化系统来检测延伸二聚物是 否发生切割。本发明中采用的信号化系统的特征在于，使延伸二聚物 的切割和信号发生同步化（synchronization）。即，通过诱导延伸二聚 物的切割来提供可检测的信号。
根据本发明的优选实施例，本发明中利用的信号化系统根据延伸 二聚物的切割来发生信号变化。仅在靶核酸序列存在时发生延伸二聚 物的切割，表示靶核酸序列的存在的信号与信号变化同时被提供。因 此，必要的情况下，以实时方式实施本发明。
根据本发明的优选实施例，延伸二聚物具有至少1种的标记，上 述标记是与上述PTO或CTO相连接的标记，或是来源于嵌入染料 （intercalating dye）的标记，通过从上述至少1种的标记中检测信号来 切割上述延伸二聚物。
适合于本发明的标记的例子能够如下详细说明。
（ⅰ）单一标记
本发明利用单一标记可提供表示靶核酸序列存在的延伸二聚物切 割相关信号。
单一标记不受特别限制，包含荧光标记、发光（luminescent）标 记、化学发光（chemiluminescent）标记或者电化学（electrochemical） 标记。优选地，上述单一标记优选为荧光标记。
目前有根据是否与寡核苷酸相结合或者是否从寡核苷酸放出的情 况表示不同信号的一些单一标记。在利用这种单一标记的情况下，本 发明可制造在液相中也与延伸二聚物的切割同步化的信号化系统。例 如，荧光铽螯合物（fluorescent terbium chelate）根据是否与寡核苷酸 相结合或者是否从寡核苷酸放出的情况提供不同的信号（Nurmi et al， Nucleic Acids Research，2000，Vol.28No.8e28）。作为其他例子，单 一标记为通过基于平面偏振光（plane polarized light）的激发而放出偏 振的荧光（a polarized fluorescence）的染料（dye）时，可利用荧光偏 振（FP，Fluorescence polarization）方法来检测切割片段。放出的荧光 的偏振程度受到与标记相连接的分子的移动（motion）的影响。一般而 言，若移动变快，则偏振程度变低（Latif等，Genome Research，11： 436-440，2001）。
根据本发明的优选实施例CTO具有单一标记，步骤（e）中的延 伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，来自延伸二聚物 被切割之前的单一标记的信号与来自延伸二聚物被切割之后的单一标 记的信号不同，可通过这些信号之差来检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，PTO具有单一标记，步骤（e）中的延 伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，来自延伸二聚物 被切割之前的单一标记的信号与来自延伸二聚物被切割之后的单一标 记的信号不同，可通过这些信号之差来检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，根据延伸二聚物的切割而提供不同信 号的单一标记是荧光铽螯合物或者是放出偏振荧光的单一标记。
根据本发明的优选实施例，单一标记与CTO相连接，更优选地， 与CTO的模板化部位相连接，进而优选地，与CTO的模板化部位的 5’-末端相连接。
根据本发明的优选实施例，单一标记与PTO相连接，更优选地， 与PTO的5’-标记部位相连接。优选地，单一标记位于PTO上，使得 PTO片段具有单一标记。
在本发明中利用单一标记的情况下，优选地，利用固定化的CTO 在固相中实施本发明。利用单一标记在固相中实施本发明的情况下， 与PTO或CTO相结合的单一标记可提供表示延伸二聚物发生切割的信 号。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定 于固相基质上。
根据本发明的优选实施例，CTO具有单一标记，步骤（e）中的延 伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，切割片段从固相 基质放出，并在固相基质上引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物 发生切割的信号。
更优选地，CTO通过其3’-末端固定于固相基质上，PTO具有单 一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切 割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上引起信号的变化， 来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
CTO通过3’-末端被固定化且利用单一标记的情况下，单一标记 与CTO的模板化部位相结合，核酸切割酶的切割位点优选为5’→3’ 外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶的切割位点。
如图5所示，若PTO片段与通过3’-末端固定于固相基质上的 CTO进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生成5’→3’外切核酸 酶的切割位点。5’→3’外切核酸酶对切割位点进行切割，由此切割 延伸二聚物，由此从CTO的5’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序 列存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。 在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光不 会被减少或者消灭。
选择性地，CTO通过其5’-末端固定于固相基质上，PTO具有单 一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切 割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上引起信号的变化， 来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
如图6所示，若PTO片段与通过5’-末端固定于固相基质上的 CTO（在模板化部位包含被限制酶识别的序列）进行杂交而被延伸来 形成延伸二聚物，则生成限制酶的切割位点。限制酶通过切割延伸二 聚物，从CTO的3’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序列存在的情 况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在靶核酸 序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者 消灭。
图7表示利用RNase H的例子。若PTO片段与通过5’-末端固定 于固相基质上的CTO（在模板化部位包含RNA分子）进行杂交而被延 伸来形成延伸二聚物，则生成RNase H的切割位点。RNase H通过切 割延伸二聚物，从CTO的3’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序列 存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。 在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光不 会被减少或者消灭。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端固定于固相基质 上，PTO具有单一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包 含单一标记的切割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上 引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，单一标记与PTO相连接，更优选地， 与PTO的5’-标记部位相连接。优选地，单一标记位于PTO上，使得 PTO片段具有单一标记。
图8及图9表示利用具有单一标记的PTO的例子。在图8中，若 PTO片段与通过5’-末端固定于固相基质上的CTO（在模板化部位包 含被限制酶识别的序列）进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生 成限制酶的切割位点。限制酶通过切割延伸二聚物，从PTO的5’-末 端放出荧光报道分子。在靶核酸序列存在的情况下，包含被固定化的 CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在靶核酸序列不存在的情况下， 在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在图9中，若PTO 片段与通过5’-末端固定于固相基质上的CTO（在模板化部位包含RNA 分子）进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生成RNase H的切割 位点。RNase H通过切割延伸二聚物，从PTO的5’-末端放出荧光报 道分子。在靶核酸序列存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上 荧光被减少或者消灭。在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化 的CTO的位置上荧光不会被减少或者消灭。
优选地，CTO通过5’-末端固定于固相基质上，并利用单一标记 的情况下，单一标记与CTO或PTO相结合，并生成如限制酶或核糖核 酸酶等核酸切割酶的切割位点。
固相反应中利用的单一标记不要求特定的特征，为了实现固相反 应，可以利用任何单一标记。之所以如此是因为，延伸二聚物被切割 之后，根据固相基质上的单一标记的存在与否而诱导切割单一延伸二 聚物时产生的信号之差。
如上所述，通过分析与第二次切割反应相关的单一标记所提供的 信号的存在与否或者信号的变化（强度的增加或减少），可检测靶核 酸序列。
上述荧光单一标记的优选例子如下：Cy2TM（506）、YO-PROTM-1 （509）、YOYOTM-1（509）、Calcein（517）、FITC（518），FluorX TM（519）、AlexaTM（520）、Rhodamine110（520）、Oregon Green TM500（522）、Oregon GreenTM488（524）、RiboGreenTM（525）、 Rhodamine GreenTM（527）、Rhodamine123（529）、Magnesium Green TM（531）、Calcium GreenTM（533）、TO-PROTM-1（533）、TOTO1 （533）、JOE（548）、BODIPY530/550（550）、Dil（565）、BODIPY TMR（568）、BODIPY558/568（568）、BODIPY564/570（570）、Cy3 TM（570）、AlexaTM546（570）、TRITC（572）、Magnesium Orange TM（575）、Phycoerythrin R&B（575）、Rhodamine Phalloidin（575）、 Calcium OrangeTM（576）、Pyronin Y（580）、Rhodamine B（580）、 TAMRA（582）、Rhodamine RedTM（590）、Cy3.5TM（596）、ROX （608）、Calcium CrimsonTM（615）、AlexaTM594（615）、Texas Red （615）、Nile Red（628）、YO-PROTM-3（631）、YOYOTM-3（631）、 Rphycocyanin（642）、C-Phycocyanin（648）、TO-PROTM-3（660）、 TOTO3（660）、DiD DilC（5）（665）、Cy5TM（670）、Thiadicarbocyanine （671）、Cy5.5（694）、HEX（556）、TET（536）、Biosearch Blue （447）、CAL Fluor Gold540（544）、CAL Fluor Orange560（559）、 CAL Fluor Red590（591）、CAL Fluor Red610（610）、CAL Fluor Red 635（637）、FAM（520）、Fluorescein（520）、Fluorescein-C3（520）、 Pulsar650（566）、Quasar570（667）、Quasar670（705）以及Quasar 705（610）。括号内的数字为以纳米为单位表示的最大的发光波长。
优选为JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标记 （fluorescein-based label）。
单一标记利用以往方法可与CTO或PTO相结合。优选地，标记 以包含至少3个碳原子的间隔区（spacer）（例如，3-碳间隔区、6-碳 间隔区或12-碳间隔区）为媒介与CTO或PTO相结合。
根据本发明的优选实施例，与CTO相结合的单一标记位于5’- 末端或从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位点。选择性地，与CTO相结 合的单一标记位于3’-末端或从3’-末端隔开1-5核苷酸的位点。
根据本发明的优选实施例，与PTO相结合的单一标记位于5’- 末端或从5’-末端隔开1-5核苷酸的位点。
（ⅱ）相互作用性双重标记
上述相互作用性标记系统为能量非-放射性地（non-radioacively） 传达到供体分子及受体分子之间的信号产生系统。作为相互作用性标 记系统的代表性例子，荧光共振能量转移技术（FRET，fluorescence resonance energy transfer）标记系统包含荧光报道分子（供体分子）及 猝灭分子（受体分子）。在荧光共振能量转移技术中，能量供体为荧 光性，但是，能量受体可以是荧光性或者非-荧光性。在相互作用性标 记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团 （chromophore），能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一 形态中，能量供体为发光性（luminescent），例如，生物发光性、化学 发光性或者电化学发光性，受体为荧光性。供体分子以及受体分子在 本说明书中可分别被说明为报道分子以及猝灭分子。
优选地，表示延伸二聚物的存在（即，靶核酸序列的存在）的信 号基于相互作用性标记系统来产生，更优选为荧光共振能量转移 （FRET）标记系统（即，相互作用性双重标记系统）。
根据本发明的优选实施例，相互作用性标记与CTO相结合。
根据本发明的优选实施例，被核酸切割酶切割的切割位点位于与 CTO相结合的报道分子及猝灭分子之间，在形成延伸二聚物之前，猝 灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，通过切割延伸二聚物来使报 道分子和猝灭分子相互分离，通过测定来自标记的信号来检测延伸二 聚物是否发生切割。
本发明的相互作用性标记系统在液相及固相中有用。
利用相互作用性标记系统的情况下，步骤（d）中生成的切割位点 优选为5’→3’外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶的切割位点。
图2表示基于延伸二聚物形成的5’→3’外切核酸酶切割位点的 导入。PTO片段与CTO进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，由此生 成5’→3’外切核酸酶的切割位点。5’→3’外切核酸酶的切割位点 位于与CTO相结合的报道分子及猝灭分子之间。
形成延伸二聚物之前，猝灭分子位于适合对来自报道分子的信号 进行猝灭的位点。优选地，上述两个标记根据CTO上的距离接近或者 形成无规卷曲（coli）或发夹结构等立体结构（conformational structure） 来以三维方式接近的情况下，会发生猝灭。
5’→3’外切核酸酶通过切割延伸二聚物的5’-末端并放出荧光 报道分子来引起来自荧光报道分子的信号变化。通过测定荧光信号变 化来检测延伸二聚物是否发生切割，这将决定靶核酸序列的存在与 否。
在猝灭分子具有荧光性的情况下，优选地，利用来自猝灭分子的 信号来进行测定。
图3表示基于延伸二聚物形成的限制酶切割位点的导入。PTO片 段与CTO进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，由此生成限制酶的切 割位点。限制酶的切割位点位于与CTO相结合的报道分子及猝灭分子 之间。限制酶对切割位点进行切割，由此切割延伸二聚物，并放出荧 光报道分子，来引起来自荧光报道分子的信号的变化。通过测定荧光 信号变化来检测延伸二聚物是否发生切割，这将决定靶核酸序列的存 在与否。
图4表示基于延伸二聚物形成的RNase的切割位点的导入。PTO 片段与CTO（在模板化部位包含RNA分子）进行杂交而被延伸来形成 延伸二聚物，由此生成RNase的切割位点。RNase的切割位点位于与 CTO相结合的报道分子及猝灭分子之间。RNase对切割位点进行切割， 由此切割延伸二聚物，并放出荧光报道分子，由此引发来自荧光报道 分子的信号的变化。通过测定荧光信号变化来检测延伸二聚物是否发 生切割，这将决定靶核酸序列的存在与否。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子中的至少一个与 CTO的模板化部位相结合，更详细地，与CTO的5’-末端相结合。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子均与CTO的模板 化部位相结合。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子中的一个与CTO 的5’-末端相结合，而另一个与3’-末端相结合。
根据本发明的优选实施例，与CTO的模板化部位相结合的报道分 子或猝灭分子位于其5’-末端或者从5’-末端隔开1-5核苷酸的位点。 例如，猝灭分子可位于CTO的模板化部位的5’-末端或者从5’-末端 隔开1-5核苷酸的位点，报道分子可位于从猝灭分子隔开5-50核苷酸 的位点。
根据本发明的优选实施例，相互作用性双重标记位于适合的位点， 即，在形成延伸二聚物的情况下，维持相互作用性双重标记之间的猝 灭状态，通过切割延伸二聚物来放出标记的情况下，相互作用性双重 标记之间处于不猝灭状态。
鉴于延伸二聚物的切割期间的实时信号发生，报道分子及猝灭分 子位于相互隔开最大25核苷酸的位点，更优选为最大20核苷酸，进 而优选为最大15核苷酸，最优选为最大10核苷酸。根据本发明的优 选实施例，报道分子及猝灭分子位于相互隔开至少3核苷酸的位点， 更优选为至少4核苷酸，进而优选为至少5核苷酸，最优选为至少6 核苷酸。
在形成延伸二聚物的情况下，CTO上的报道分子及猝灭分子在结 构上隔开，以使猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭。通过切 割延伸二聚物，从猝灭分子中完全分离报道分子，由此可加大因不猝 灭而引起的信号的变化。
并且，由于生成具有标记（例如，报道分子）的切割片段，因而 在更加柔韧或方便的条件（例如，高-严格条件或固相中洗涤后的条件） 下，直接检测来自与切割片段相结合的标记的信号，由此可分析延伸 二聚物的切割。
根据本发明的优选实施例，与固定化的CTO相结合的相互作用性 双重标记中的一个，在切割延伸二聚物之后残留于固相基质上。
根据本发明的优选实施例，固定于固相基质上的CTO具有相互作 用性双重标记并利用5’→3’外切核酸酶作为核酸切割酶的情况下， 对从二聚物分离出CTO的片段赋予适当的条件，或在CTO的内部核 苷酸赋予对于5’→3’外切核酸酶活性的耐性，从而切割延伸二聚物 之后，使相互作用性双重标记中的一个确切地残留在固相基质上。
根据本发明的优选实施例，对于5’→3’外切核酸酶活性的耐性 通过带有对5’→3’外切核酸酶活性具有耐性的主链的核苷酸赋予， 包含多种硫代磷酸酯（phosphorodithioate）连接（linkage）、膦酸酯 （phosphonate）连接、磷酰胺酯（phosphoramidate）连接及2’-碳水 化合物（2’-carbohydrate）变形，更优选地包含硫代磷酸酯 （phosphorodithioate）连接、烷基磷酸三酯（alkyl phosphotriester）连 接、芳基磷酸三酯（aryl phosphotriester）连接、膦酸烷基酯（alkyl phosphonate）连接、膦酸芳基酯（aryl phosphonate）连接、氢膦酸酯 （hydrogen phosphonate）连接、烷基磷酰胺酯（alkyl phosphoramidate） 连接、芳基磷酰胺酯（aryl phosphoramidate）连接、硒代磷酸酯 （phosphoroselenate）连接、2’-O-氨基丙基（2’-O-aminopropyl）变形、 2’-O-烷基（2’-O-alkyl）变形、2’-O-芳基（2’-O-aryl）变形、2’-O-丁基 （2’-O-butyl）变形、α-异头寡脱氧核苷酸（α-anomeric Oligodeoxynucleotide）及1-（4’-硫代-β-D-呋喃核糖）（1-（4’-thio- β-D-ribofuranosyl））变形。
本发明中可利用的报道分子及猝灭分子可包含本领域公知的任何 物质，参照有关上述荧光单一标记的说明，可说明其例子。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在许多文献中：Pesce等， editors，Fluorescence Spectroscopy（Marcel Dekker，New York，1971）; White等，Fluorescence Analysis:A Practical Approach（Marcel Dekker， New York，1970）；Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，2nd Edition（Academic Press，New York，1971）； Griffiths，Color AND Constitution of Organic Molecules（Academic Press， New York，1976）;Bishop，editor，Indicators（Pergamon Press，Oxford， 1972）；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes，Eugene，1992）；Pringsheim，Fluorescence and Phosphorescence（Interscience Publishers，New York，1949）； Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，6th Edition（Molecular Probes，Eugene，Oreg.，1996）； 美国专利第3,996,345号以及第4,351,760号。
在本发明中，值得关注的是可以利用能够对广范围波长或者特定 波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。非-荧光黑猝灭分子的例子 为黑洞猝灭剂（BHQ：black hole quencher）以及4-[4-（二甲基氨基） 苯偶氮]苯甲酸（DABCYL：4-[4-（Dimethylamino）phenylazo]benzoic acid）。
用于本发明的荧光共振能量转移（FRET）标记中，报道分子包含 荧光共振能量转移（FRET）的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移 （FRET）的剩余伙伴（受体）。例如，荧光素染料（fluorescein dye） 被利用为报道分子，罗丹明染料（rhodamine dye）被利用为猝灭分子。
（ⅲ）嵌入标记（Intercalating label）
本发明可使用嵌入标记（intercalating label）来联系第二次切割反 应和表示靶核酸序列的存在的信号发生。
由于试料内的双-链核酸分子能够产生信号，因而，嵌入标记在利 用固定化的CTO的固相反应中更为有用。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定 于固相基质上，嵌入染料用作标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割 用于形成包含嵌入染料的切割片段，切割片段从固相基质放出，并在 固相基质上引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。 在这种情况下，优选地，利用限制酶或RNase来实施步骤（e）中的第 二次切割反应。
根据本发明的优选实施例，未固定于固相基质上的切割片段从固 相基质分离。
在本发明中有用的嵌入染料的例包含：SYBRTMGreen I、PO-PRO TM-1、BO-PROTM-1、SYTOTM43、SYTOTM44、SYTOTM45、 SYTOXTMBlue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、 LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PROTM1、TO-PROTM1、SYTOTM11、 SYTOTM13、SYTOTM15、SYTOTM16、SYTOTM20、SYTOTM23、 TOTOTM-3、YOYOTM3、GelStarTM以及thiazole orange。信号通过嵌 入染料特异性地夹入双-链核酸分子内来产生。
PTO以及CTO可由天然（naturally occurring）dNMPs构成。择一 性地，PTO以及CTO可包含变形核苷酸或者非-天然核苷酸，例如PNA （Peptide Nucleic Acid，参照PCT申请第WO92/20702号）以及LNA （Locked Nucleic Acid，参照PCT申请第WO98/22489号、第WO 98/39352号以及第WO99/14226号）。PTO以及CTO可包含如同脱 氧肌苷（deoxyinosine）、肌苷（inosine）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核 糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl）-3-nitropyrrole） 以及5-硝基吲哚（5-nitroindole）等的通用碱基。术语“通用碱基”意 味着分别对DNA/RNA碱基能够几乎没有区别地形成碱基对。
如上所述，PTO能够在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’ -方向隔开的位置被切割。切割位点能够位于PTO的3’-靶向部位的5’ -末端的一部分。在PTO片段包含PTO的3’-靶向部位的5’-末端的 一部分的情况下，与3’-靶向部位的5’-末端的一部分杂交的CTO的 位置能够包含通用碱基、退化性序列（degenerate sequence）或者它们 的组合。例如，PTO在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’- 方向隔开一个核苷酸的位置被切割，为了与上述核苷酸的杂交，有利 地，CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分包含通用碱基。万一，PTO 在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开两个核苷酸的 位置被切割，有利地，CTO的捕捉部位的5’-末端包含退化性序列， 沿着其3’-方向邻近的核苷酸包含通用碱基。像这样，在3’-靶向部 位的5’-末端的一部分的多个位置上产生PTO的切割的情况下，对CTO 利用通用碱基或者退化性序列将具有用处。并且，在诱导上游引物延 伸-依赖性切割的情况下，将具有相同的5’-标记部位的PTO利用到多 个靶核酸序列筛选时，3’-靶向部位的5’-末端的一部分能够生成互不 相同的PTO片段。在这种情况下，通用碱基以及退化性序列将被有用 地使用到CTO。为了实现多个靶核酸序列的筛选，在对CTO利用通用 碱基以及退化性序列的战略中使用一个类型的CTO或者最小数量的类 型的CTO。
根据本发明的优选实施例，本发明的方法在上述反复循环之间包 括变性过程，还包括反复进行上述步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）- 步骤（d）或者步骤（a）-步骤（f）的步骤，优选地，一同包含下游引 物。这种反复能够扩增靶核酸序列和/或靶信号。
根据本发明的优选实施例，本发明的方法中，步骤（a）-步骤（b） 及步骤（c）-步骤（f）或者步骤（a）-步骤（d）及步骤（e）-步骤（f） 在一个反应容器或者个别反应容器中实施。
根据本发明的优选实施例，本发明的方法在反复循环之间包括变 性过程，还包括反复进行上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步 骤（d）的步骤。
根据本发明的优选实施例，步骤（a）-步骤（f）在一个反应容器 或者个别反应容器中实施。例如，步骤（a）-步骤（b）、步骤（c）- 步骤（d）或者步骤（e）-步骤（f）能够在个别反应容器中实施。
根据本发明的优选实施例，步骤（a）-步骤（b）以及步骤（c）- 步骤（f）根据反应条件（尤其，温度）能够在一个反应容器同时或者 个别进行。
特定步骤的反复、反复时变性的介入、特定步骤的个别实施及检 测时间点能够以多种方式变更，这对于本发明所属技术领域的普通技 术人员来说是显而易见的。
利用上游引物实施反复的情况下，优选地，在下游引物的存在之 下实施反复，更优选地，根据PCR方法实施反复。利用上游探针实施 反复的情况下，优选地，在下游引物的存在之下实施反复。
本发明中要检测和/或扩增的靶核酸序列包括所有DNA（gDNA及 cDNA）分子以及RNA分子均不要求具有任何特定序列或者长度。
当把mRNA用作初期物质时，在实施退火步骤之前必需进行反转 录步骤，以上详细的内容公开在Joseph Sambrook等、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、N.Y.（2001）；以及Noonan、K.F等，Nucleic Acids Res.16:10366（1988）。为了实现反转录反应，可利用与随机六聚体或 者mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。
在本发明中可检测和/或扩增的靶核酸序列还都包含任何自然 （naturally occurring）原核细胞核酸、真核细胞（例如，原生动物和寄 生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的 高等动物）核酸、病毒（例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV： HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS）、流感病毒、EB病毒 （Epstein-Barr virus）、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等）核酸或者类 病毒核酸。
并且，本发明对核苷酸变异的检测非常有用。优选地，靶核酸序 列包含核苷酸变异。在本说明书中使用的术语“核苷酸变异”意味着 在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的 DNA序列的所有单一或者多个核苷酸置换、缺失、或者插入。这种连 续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的任意其他部位。这种核 苷酸变异可以是突变（mutant）或者多态性等位基因变异（polymorphic allele variations）。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括：单核苷 酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism）、突变（mutation）、 缺失、插入、置换以及移位。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的 多种变异（例如，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR： methylenetetrahydrofolate reductase）基因的变异）、病原体的药物耐性 相关的变异以及癌产生-相关的变异。本说明书中使用的术语核苷酸变 异包含DNA分子内特定位点上的任何变异。即，术语核苷酸变异包含 野生型及其DNA分子内特定位点上的任何突变类型。
在检测靶核酸序列的核苷酸变异的本发明中，所使用的引物或者 探针具有对靶核酸序列的上述核苷酸变异互补的序列的情况下，包含 上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中将被记载为匹配模板 （matching template）。在所使用的引物或者探针具有对靶核酸序列的 核苷酸变异非-互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序 列在本说明书中将被记载为错配模板（mismatching template）。
为了检测核苷酸变异，可将上游引物的3’-末端设计成位于靶核 酸序列中的核苷酸变异位置的对面。根据本发明的优选实施例，上游 引物的3’-末端具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。具有对 靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的上游引物的3’-末端通过被匹 配模板退火并被延伸来诱导PTO切割。作为其结果物，PTO片段通过 与CTO杂交来提供靶信号。相反，上游引物的3’-末端在错配模板中 与核苷酸变异错配的情况下，即使上游引物与错配模板杂交，为了实 现延伸反应，在需要对引物的3’-末端进行退火的条件下也不会被延 伸，由此不会产生靶信号。
择一性地，可利用对具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列 的PTO的杂交有着依赖性的PTO切割。例如，在已调节的条件下，具 有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的PTO与匹配模板杂交后被 切割。作为结果物，PTO片段通过与CTO杂交来提供靶信号。相反， 在已调节的条件下，PTO不会与具有对核苷酸变异位置非-互补的序列 的错配模板杂交，并且不会被切割。在这种情况下，优选地，对PTO 的核苷酸变异互补的序列位于PTO的3’-靶向部位的中间。
择一性地，本发明为了实现对于特定核苷酸变异的PTO的筛选性， 利用位于3’-靶向部位的5’-末端一部分的核苷酸变异区别位点 （nucleotide variation discrimination site）的PTO。为了检测核苷酸变 异，PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分位于靶核酸序列的核苷 酸变异，PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分具有对靶核酸序列 的核苷酸变异互补的序列。
具有与核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列（即， 匹配模板（match template））与PTO进行杂交的情况下，3’-靶向部 位的5’-末端一部分形成匹配模板和双链；具有与核苷酸变异区别位 点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列（即，错配模板（mismatch template））与PTO进行杂交的情况下，3’-靶向部位的5’-末端一部 分不形成错配模板和双链。
本说明书中涉及到PTO时所使用的术语“核苷酸变异区别位点 （nucleotide variation discrimination site）”是与PTO的3’-靶向部位 的5’-末端一部分的靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。
如此关注的核苷酸变异的明显的杂交模式提供了PTO的初期切割 位点上的差异，据此生成2种PTO片段，由此根据关注的核苷酸变异 的存在与否发生信号差异是值得瞩目的。
根据关注的核苷酸变异的存在与否，分别生成通过切割PTO及匹 配模板之间的混合物（hybrid）来生成的第一片段及通过切割PTO及 错配模板之间的混合物（hybrid）来生成的第二片段。第二片段包含追 加的3’-末端，以生成与第一片段不同的第二片段。
在用于检测单一核苷酸变异的实施例中，PTO的3’-靶向部位的 5’-末端具有对靶核酸序列的单一核苷酸变异互补的序列。如上所述， 与匹配模板杂交的PTO的切割，例如，在上游引物延伸-依赖性切割诱 导下，可在沿着3’-方向与PTO的3’-靶向部位的5’-末端仅邻近 （immediately adjacent）的位置被诱导。PTO片段的3’-末端具有对单 一核苷酸变异互补的核苷酸。PTO片段通过与具有包含相当于核苷酸 变异的序列的捕捉部位的CTO杂交后被延伸来形成延伸二聚物，由此 来提供靶信号。假如，同样的PTO与除核苷酸变异外对匹配模板具有 相同的序列的错配模板杂交，有可能在从PTO的3’-靶向部位的5’- 末端沿着3’-方向隔开两个核苷酸的位置产生PTO的切割。PTO片段 的3’-末端除具有与单一核苷酸变异互补的核苷酸以外还具有被追加 切割的核苷酸。在与追加被切割的核苷酸杂交的CTO的位置被设计成 对上述追加被切割的核苷酸具有非-互补的序列的情况下，PTO片段的 3’-末端不与CTO杂交，在已调节的条件下，PTO片段不会被延伸。
根据本发明的优选实施例，在PTO的3’-靶向部位的5’-末端的 一部分具有对核苷酸变异互补的序列的PTO的切割位点，在与匹配模 板或者与错配模板的杂交上依赖性地不同，由此从上述两个杂交结果 放出的PTO片段具有不同的序列，优选地，在其3’-末端一部分，更 为优选地，在其3’-末端具有不同的序列。
根据本发明的优选实施例，通过选择考虑PTO片段的3’-末端的 一部分的差异的CTO的核苷酸序列，能够区分匹配模板和错配模板。
根据本发明的优选实施例，某一种PTO片段的生成可通过CTO 上的延伸反应而明确得到检测。
根据本发明的优选实施例，第二片段与CTO的捕捉部位进行杂交 的情况下，由于CTO具有筛选的序列，因而CTO不与第二片段的追 加的3’-末端部位进行杂交，并防止第二片段延伸。
如本发明所述，通过切割延伸二聚物来检测第一片段的延伸。
根据本发明的优选实施例，优选地，PTO的3’-靶向部位的5’- 末端一部分包含位于从核苷酸变异区别位点隔开1-10以内的核苷酸的 位点的非-碱基配对部分（non-base pairing moiety）（更优选为1-5以 内的核苷酸）。
具有与变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列与PTO 进行杂交的情况下，非-碱基配对部分防止3’-靶向部位的5’-末端一 部分形成靶核酸序列和双链。
通过利用非-碱基配对部分（例如，错配核苷酸）来提高对于核苷 酸变异的PTO的区别能力。
根据本发明的优选实施例，具有与核苷酸变异区别位点互补的核 苷酸变异的靶核酸序列与PTO进行杂交的情况下，非-碱基配对部分不 抑制5’-末端一部分形成靶核酸序列和双链。
根据本发明的优选实施例，非-碱基配对部分用来放大PTO和匹配 模板的混合物上的初期切割位点及PTO和错配模板的混合物上的初期 切割位点之间的距离。
非-碱基配对部分包含在靶核酸序列之间不形成碱基对的任何部 分。优选地，非-碱基配对部分是以下内容：（ⅰ）包含人为错配碱基、 变形为无法碱基配对的非-碱基配对碱基或通用碱基的核苷酸，（ⅱ） 变形为无法碱基配对的非-碱基配对核苷酸或者（ⅲ）非-碱基配对化合 物。
例如，非-碱基配对部分包含亚烷基（alkylene group）、呋喃核糖 萘（ribofuranosyl naphthalene），脱氧呋喃核糖萘（deoxy ribofuranosyl naphthalene）、偏磷酸盐（metaphosphate）、硫代磷酸酯连接、烷基磷 酸三酯连接、芳基磷酸三酯连接、膦酸烷基酯连接、膦酸芳基酯连接、 氢膦酸酯连接、烷基磷酰胺酯连接及芳基磷酰胺酯连接。常规的碳间 隔区也被利用为非-碱基配对部分。作为非-碱基配对部分的通用碱基对 调节PTO的切割位点有用。
导入5’-末端一部分的非-碱基配对部分优选地具有1-10个部分， 更优选地具有1-5个部分，进而优选地具有1-2个部分。5’-末端一部 分的多个非-碱基配对部分能够连续或不连续地存在。优选地，非-碱基 配对部分具有2-5个连续的部分。
优选地，非-碱基配对部分是非-碱基配对化合物。
根据本发明的优选实施例，核苷酸变异区别位点及PTO的非-碱基 配对部分位于从3’-靶向部位的5’-末端隔开10以内的核苷酸的位点 （更优选为8核苷酸、7核苷酸、6核苷酸、5核苷酸、4核苷酸、3核 苷酸、2核苷酸或1核苷酸，进而优选为1核苷酸）。
根据本发明的一实施例，PTO具有阻断剂（blocker）部位，该阻 断剂部位包含对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少1 个核苷酸阻断剂（blocker）。上述阻断剂部位位于错配模板和根据PTO 的杂交而初期被切割的部位。上述阻断剂部位防止切割位点上发生的 切割及连续的切割。
阻断剂部位中所包含的的阻断剂的数量不受限制，优选为1-10阻 断剂，更优选为2-10阻断剂，进而优选为3-8阻断剂，最优选为3-6 阻断剂。存在于探针的阻断剂能够以连续或不连续的方式存在，优选 为连续的方式。作为阻断剂的核苷酸，即包含对5’→3’外切核酸酶 活性具有耐性的主链的核苷酸包含本领域公知的任何部分。例如，上 述核苷酸包含多种硫代磷酸酯连接、膦酸酯连接、磷酰胺酯连接及2’ -碳水化合物变形。根据本发明的更优选的实施例，包含对5’→3’ 外切核酸酶具有耐性的主链的核苷酸包含硫代磷酸酯连接、烷基磷酸 三酯连接、芳基磷酸三酯连接、膦酸烷基酯连接、膦酸芳基酯连接、 氢膦酸酯连接、烷基磷酰胺酯连接、芳基磷酰胺酯连接、硒代磷酸酯 （phosphoroselenate）连接、2’-O-氨基丙基变形、2’-O-烷基变形、2’-O- 芳基变形、2’-O-丁基变形、α-异头寡脱氧核苷酸及1-（4’-硫代-β-D- 呋喃核糖）变形。
不具有PTO结构的、在5’-末端部位具有核苷酸变异区别部位的 常规的线性探针（linear probe）与错配模板进行杂交的情况下，其5’ -末端部位在特定条件下可形成单链。这种探针可相当于PTO。通过本 发明的PTO试验可发生信号。这种接近法，可对具有与探针的核苷酸 变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列的检测有用。
根据本发明的优选实施例，在本发明中所利用的靶核酸序列为预- 扩增的核酸序列。利用预-扩增的核酸序列，能够大大提高本发明的靶 检测的灵敏度以及特异性。
根据本发明的优选实施例，上述方法在存在下游异物的情况下实 施。
能够同时检测（多重检测）至少两种的靶核酸序列使得本发明的 优点更为突出。
根据本发明的优选实施例，上述方法是为了检测至少两种靶核酸 序列而实施的（更优选为至少三种，进而优选为至少五种）。
根据本发明的优选实施例，上述方法为了检测至少两种靶核酸序 列而实施（更优选为至少三种，进而优选为至少五种）；上述上游寡 核苷酸包含至少两种寡核苷酸（更优选为至少三种，进而优选为至少 五种），PTO包含至少两种PTO（更优选为至少三种，进而优选为至 少五种），CTO包含至少一种CTO（更优选为至少两种，进而优选 为至少三种，最优选为至少五种）。
至少2种PTO的5’-标记部位能够具有相同的序列。例如，本发 明在靶核酸序列的筛选中实施的情况下，PTO的5’-标记部位可以具 有相同的序列。
尤其，能够将一种CTO利用到多个靶核酸序列的检测上。例如， 将在5’-标记部位具有相同的序列的PTO利用于靶核酸序列的筛选的 情况下，可以利用一种CTO。
根据本发明的优选实施例，本发明利用至少2种的下游引物来实 施。
本发明可在液相或固相中实施。
利用在固相上实现固定化的CTO的靶检测
根据本发明的优选实施例，本发明的方法在固相中实施，CTO 通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。在固相中， 测定由固相基质上提供的靶信号。
利用在固相基质上实现固定化的CTO的情况下，可利用化学标记 （例如，生物素）或者酶标记（例如碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半 乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶）。
为了实现固相反应，CTO基于其5’-末端或者3’-末端（优选为， 3’-末端）在固相基质的表面直接或者间接（优选为间接）实现固定化。 并且，CTO能够以共价键或者非共价键方式，在固相基质表面上实现 固定化。在固定化的CTO在固相基质表面间接性地实现固定化的情况 下，利用合适的连接肽。在本发明中有用的连接肽可包含利用于固相 基质表面上的探针固定化的任何连接肽。例如，具有胺基的烷基或者 芳基化合物、或者具有硫醇基的烷基或者芳基化合物可作为连接肽利 用于CTO固定化。并且，可将聚尾（poly T tail）或者聚腺苷酸尾（poly A tail）使用为连接肽。
根据本发明的优选实施例，在本发明中利用的固体基质为微阵列。 提供本发明的反应环境的微阵列包括在本发明所属的技术领域中公知 的任何微阵列。本发明的全部过程，即与靶序列的杂交、切割、延伸、 解链以及荧光的检测在微阵列上实施。在微阵列上实现固定化的CTO 会被利用为杂交阵列因素（hybridizable array element）。用于制备微阵 列的固体基质包括，金属（例如，金、金与铜的合金及铝）、金属氧 化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/SiO2晶圆、锗、砷化镓、 碳、碳纳米管、聚合物（例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯以及聚丙 烯酰胺）、琼脂糖凝胶（sepharose）、琼脂糖（agarose）及胶体（colloids）， 但是不局限于此。本发明的多个固定化CTO可固定于固体基质上的一 个寻址（addressable）部位或者多个寻址部位，固体基质可包括 2-1000000个寻址部位。为了基于如光刻法、喷墨打印法、机械点样法 及与其类似的方法等现有制备技术，生产用于特定应用的阵列而可以 组装（fabricate）固定化的CTO。
在固相中实施的本发明，由于固定化的CTO上的标记物理性地隔 开，因而即使利用一种标记也能够同时检测多个靶核酸序列。因此， 在固相中基于本发明可检测的靶核酸序列的数量不受限制。
若在固相中使用共焦检测（confocal detection）设备等，则不会受 到基于液相中存在的标记的信号的影响，由此能够仅测定固相基质上 的信号。
在本发明中，PTO片段通过切割与靶核酸序列进行杂交的PTO而 被生成，PTO片段被CTO退火，且在CTO上被延伸而形成延伸链。
并且，利用包含如下部位的追加的PTO，可提供根据追加的5’ 核酸酶切割反应来增加延伸链的数量的、在CTO上可延伸的追加的片 段，其中，上述部位包含：（ⅰ）3’-靶向部位，其包含与延伸链互补 的杂交核苷酸序列，以及（ⅱ）5’-标记部位，包含与延伸链非-互补， 但与CTO的捕捉部位互补的核苷酸序列。为了实现5’核酸酶切割反 应，优选地，包含与延伸链互补的杂交核苷酸序列，并利用存在于追 加的PTO的上游的追加的上游寡核苷酸。
上述优选实施例的特征在于，形成追加的片段依赖于延伸链的形 成。
择一性地，利用追加的PTO可提供追加的片段，其中，上述PTO 包含：（ⅰ）3’-靶向部位，其包含与CTO的模板化部位互补的杂交 核苷酸序列；以及（ⅱ）5’-标记部位，其与CTO的模板化部位非- 互补但是与CTO的捕捉部位互补的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，追加的延伸二聚物是通过延伸链的追 加生成而生成的，这将贡献于固相基质上的靶信号的扩增。
利用靶核酸序列扩增的优选实施例
优选地，本发明利用能够合成靶核酸序列的上游引物以及包含下 游的一对引物，并通过靶核酸序列的扩增来同时实施。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供一种基于PCEC（PTO 切割及延伸-依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核 酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤（a），将上述靶核酸序列与包含上游引物及下游引物引物的 一对引物以及探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）进行杂交；上述上游引物及上述下游引物分别包含与 上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’-靶 向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii） 5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’ -靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸 序列杂交；上述PTO位于上述上游引物以及上述下游引物之间；上述 PTO因其3’-末端被阻断，因而防止延伸；
步骤（b），在用于延伸上述引物以及切割上述PTO的条件下， 将步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶 相接触；在上述PTO与上述靶核酸序列杂交的情况下，上述上游引物 被延伸，上述延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的模板-依赖性 核酸聚合酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的上 述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段和捕捉和模板化寡核 苷酸（CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide）进行杂交；上 述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO 的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序 列，以及（ii）模板化部位，其包含与上述5’-标记部位以及3’-靶向 部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO 的上述捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶 来实施延伸反应；杂交于上述CTO的上述捕捉部位的上述片段，通过 被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点 （cleavage site）；
步骤（e），利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，用于生 成切割的片段；以及
步骤（f），检测上述延伸二聚物是否发生（occurrence）切割， 上述延伸二聚物发生切割表示上述靶核酸序列存在。
由于本发明的优选实施例实施上述的本发明的步骤，因此，为了 避免本说明书的过度的复杂性，省略它们之间共同的内容。
根据本发明的优选实施例，上述方法在反复循环之间包括变性过 程，还包括反复进行步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者 步骤（a）-步骤（f）的步骤。反应的反复伴随着靶核酸序列的扩增。 优选地，上述扩增根据在美国专利第4,683,195号、第4,683,202号以 及第4,800,159号中公开的聚合酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction）来实施。
根据本发明的优选实施例，上述方法是为了检测至少两种靶核酸 序列而实施。
用于靶检测的试剂盒
根据本发明的还一实施方式，本发明提供一种基于PCEC（PTO 切割及延伸-依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核 酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
（a）PTO，上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述 靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含 与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶 核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
（b）上游寡核苷酸，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互 补的杂交核苷酸序列，上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；上述 上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述 PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的上述5’-标记部位 或者上述5’-标记部位的一部分的片段；以及
（c）CTO，上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位， 其包含与上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部 分互补的核苷酸序列；以及（ii）模板化部位，其包含与上述PTO的 上述5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上 述PTO放出的上述片段与上述CTO的上述捕捉部位杂交；并且，与上 述CTO的捕捉部位杂交的上述片段被延伸来形成延伸二聚物，并生成 被核酸切割酶切割的切割位点。
由于本发明的试剂盒是为了实施如上所述的本发明的方法而构成 的，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，省略它们之间共同的 内容。
根据本发明的优选实施例，试剂盒还包含用于切割与靶核酸序列 进行杂交的PTO的具有5’核酸酶活性的酶。
根据本发明的优选实施例，试剂盒为了切割通过与CTO的捕捉部 位进行杂交的上述片段的延伸而形成的延伸二聚物，还包含核酸切割 酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶、 限制酶或核糖核酸酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是限制酶，CTO的模板化 部位包含被限制酶识别的序列，步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来 生成限制酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是核糖核酸酶，CTO的模 板化部位包含RNA序列，步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来形成 DNA-RNA混合二聚物，由此生成上述核糖核酸酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶， 通过形成延伸二聚物，在CTO上生成5’→3’外切核酸酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，被核酸切割酶切割的切割位点是用于 切割DNA二聚物、RNA二聚物或DNA-RNA混合二聚物的核酸切割 酶的切割部位。
根据本发明的优选实施例，核糖核酸酶是RNase H或ExoⅢ。
根据本发明的优选实施例，5’→3’外切核酸酶是具有5’→3’ 外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是热稳定性核酸切割酶。
根据本发明的优选实施例，延伸二聚物具有至少1种标记，上述 标记是与PTO或CTO相连接的标记或是来源于嵌入染料（intercalating dye）的标记，通过检测来自上述至少1种标记的信号来检测延伸二聚 物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，CTO具有单一标记，通过切割延伸二 聚物来形成包含单一标记的切割片段，来自延伸二聚物被切割之前的 单一标记的信号不同于来自延伸二聚物被切割之后的单一标记的信 号，这种信号之差用于检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，单一标记是荧光标记。
根据本发明的优选实施例，被核酸切割酶切割的切割位点位于与 CTO相连接的报道分子及猝灭分子之间，形成延伸二聚物之前，猝灭 分子对来自报道分子的信号进行猝灭，通过切割延伸二聚物来使报道 分子和猝灭分子相互分离，通过测定来自标记的信号来检测延伸二聚 物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子中的至少一个与 CTO的5’-末端相连接。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定 于固相基质上。
根据本发明的优选实施例，CTO具有单一标记，通过切割上述延 伸二聚物来形成包含上述单一标记的切割片段，上述切割片段从上述 固相基质放出，在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示 上述延伸二聚物发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端固定于固相基质 上，上述PTO具有单一标记，通过切割上述延伸二聚物来形成包含上 述单一标记的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出，在上述 固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物发生切 割的信号。
根据本发明的优选实施例，单一标记是荧光标记。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定 于固相基质上，嵌入染料用作标记，通过切割上述延伸二聚物来形成 包含上述嵌入染料的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出， 在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物 发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，PTO和/或CTO因其3’-末端被阻断 而防止延伸。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸是上游引物或者上游探 针。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸位于与上述PTO相邻近 的部位，以能够基于具有5’核酸酶活性的上述酶来诱导上述PTO的 切割。
根据本发明的优选实施例，上游引物通过其延伸链来诱导基于具 有5’核酸酶活性的上述酶的上述PTO的切割。
根据本发明的优选实施例，CTO的捕捉部位在其5’-末端部位包 含与上述PTO的3’-靶向部位的一部分互补的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，与PTO的3’-靶向部位的一部分互补 的核苷酸序列为1-5个核苷酸。
根据本发明的优选实施例，利用上述试剂盒来检测至少2种靶核 酸序列，上述上游寡核苷酸包含至少2种寡核苷酸，上述PTO包含至 少2种PTO，上述CTO包含至少2种CTO。
根据本发明的优选实施例，至少2种PTO的5’-标记部位具有相 同的序列或者不同的序列。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸是上游引物，上述试剂 盒是为了实现上述上游引物的上述延伸而利用模板-依赖性核酸聚合 酶。
根据本发明的优选实施例，具有5’核酸酶活性的酶是具有5’核 酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或结构特异性（FEN，flap endo/exonuclease）核酸酶。
根据本发明的优选实施例，试剂盒还包含下游引物。
在本说明书中，上述的本发明的所有试剂盒可选择性地包含，如 同缓冲液、DNA聚合酶辅因子以及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等的， 实施靶扩增PCR反应（例如，聚合酶链式反应）所需的试剂。选择性 地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种 缓冲液及试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。并且，试剂盒可包含 实施阳性对照组及阴性对照组反应时所必需的试剂。熟知本说明书的 公开事项的本技术领域的普通技术人员能够容易地决定在特定反应中 使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示 的组成成分的额外的包装体或者组分（compartment）所制备。
简要说明本发明的特征及优点如下：
（a）本发明的特征在于，在根据靶核酸序列的存在与否形成的延 伸二聚物上生成被核酸切割酶切割的切割位点。本发明检测延伸二聚 物是否发生切割，由此决定靶核酸序列的存在。
（b）多种方法可用于检测核酸切割酶引起的延伸二聚物发生切 割。鉴于延伸二聚物上的切割位点，可将单一标记、相互作用性双重 标记或嵌入标记适用于表示靶核酸序列存在的信号的产生。在这种观 点上，本发明很好地适用于靶核酸序列的实时检测。
（c）由于本发明的方法用来切割延伸二聚物，因而不受像常规方 法一样通常需要利用维持二聚物结构的条件的限制。因此，对于本发 明的方法而言，靶核酸序列的检测可在多种条件（例如，温度范围相 对大的温度）下实施。
（d）值得关注的是，可以不用考虑靶核酸序列而选择PTO的5’ -标记部位的序列以及CTO的序列。据此能够事先-设计（pre-design） 对PTO的5’-标记部位以及CTO的全部序列。虽然PTO的3’-靶向 部位需要考虑靶核酸序列来制备，但是CTO可以不用考虑靶核酸序列 的信息或者靶核酸序列而以已有方式（ready-made fashion）来制备。 这种特征能够在多重靶检测，特别是，利用在固相基质上实现固定化 的CTO的微阵列中提供突出的优点。
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅 是用于更加具体地说明本发明的，根据本发明的主旨本发明的范围不 局限于这些实施例，这对本发明所属的技术领域的普通技术人员来说 是显而易见的。
实施例
实施例1：利用5’→3’外切核酸酶的PCEC（PTO Cleavage and Extension-dependent Cleavage）试验的评价
评价了作为新试验的本发明的PCEC（PTO Cleavage and Extension-dependent Cleavage）试验是否可利用Taq DNA聚合酶的5’ →3’外切核酸酶活性来检测靶核酸序列（参照图2）。
为了实现上游引物的延伸、PTO的切割及PTO片段的延伸，利用 具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。将具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶用于切割延伸二聚物。
PTO及CTO的3’-末端用碳间隔区（carbon spacer）来阻断。PTO 不具有标记。CTO在其5’-末端具有荧光报道分子（FAM），并在模 板化（templating）部位具有猝灭分子（BHQ-1）。实施试验期间形成 的延伸二聚物具有相互作用性双重标记。延伸二聚物在其5’-末端部 位具有通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性而被切割的切割位点 （site）。由FAM标记的5’-末端通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶 活性而被切割，上述FAM从BHQ-1分离。将对淋病奈瑟菌（NG， Neisseria gonorrhoeae）基因的合成寡核苷酸用作靶模板。
本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO及CTO的序列如下：
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTT TGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO： 2）
NG-PTO-15’- ACGACGGCTAGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’（SEQ ID NO：3）
NG-CTO-15’-[FAM]CCTCCTCCTCCTCC[T （BHQ-1）]CCAGTAAAGCCTAGCCGTCGT[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：4）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记部位）
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模 板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2） 10pmole、PTO（SEQ ID NO：3）5pmole、CTO（SEQ ID NO：4）2.5pmole、 含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））1.6单元（unit） 的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时 热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃ 下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下63秒、在72℃ 下30秒的过程反复进行了60次。检测到各循环的变性步骤（95℃） 中产生的信号。变性步骤中的检测可确认信号是否根据因延伸二聚物 被切割而引起的双重标记的分离而产生。
如图10所示，有模板的情况下，检测到荧光信号。无模板或者无 PTO或CTO的情况下，未检测到信号。
这些结果表示，可通过利用5’→3’外切核酸酶活性的PCEC试 验来检测靶核酸序列。
实施例2：利用限制酶的PCEC试验的评价
本发明进一步评价了PCEC试验是否可利用限制酶来检测靶核酸 序列（参照图3）。
为了实现上游引物的延伸、PTO的切割及PTO片段的延伸，利用 具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。将热稳定性限制酶（PspGI） 用于切割延伸二聚物。
PTO及CTO的3’-末端用碳间隔区（carbon spacer）来阻断。PTO 不具有标记。CTO在其5’-末端具有荧光报道分子（Cal Fluoro Red 610），并在模板化（templating）部位具有猝灭分子（BHQ-1）。在形 成延伸二聚物时，设计CTO来对PspGI提供限制酶切割位点。实施试 验期间形成的延伸二聚物具有由限制酶切割位点划分的相互作用性双 重标记。限制酶位点的切割引起荧光报道分子（Cal Fluoro Red 610） 从猝灭分子（BHQ-1）中分离。
据本发明人所知，由荧光报道分子（Cal Fluoro Red610）标记的 延伸二聚物的5’-末端对上游寡核苷酸具有耐性，其中，上述上游寡 核苷酸与Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性独立。将对淋病奈瑟菌（NG， Neisseria gonorrhoeae）基因的合成寡核苷酸用作靶模板。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO及CTO的序列如 下：
NG-T 5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTT TGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO： 2）
NG-PTO-25’- ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’ （SEQ ID NO：5）
NG-CTO-25’-[CAL Fluor Red610]CCTCCCTCCTCC[T （BHQ-2）]CCTCCAGTAAAGCC
AAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：6）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记部位）
（粗体字是指有关PspGI的限制酶切割位点）
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模 板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2） 10pmole、PTO（SEQ ID NO：3）5pmole、CTO（SEQ ID NO：4）2pmole、 含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM、H-Taq DNA 聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））1.6单元（unit） 及PspGI（新英格兰生物实验室（New England Biolabs），美国（US）） 1单元的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位 于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物 在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下63秒、 在72℃下30秒的过程反复进行了60次。检测到各循环的变性步骤（95 ℃）中产生的信号。
有模板的情况下，检测到荧光信号。无模板或者无PTO或CTO 的情况下，未检测到信号。
这些结果表示，可通过利用限制酶的PCEC试验来检测靶核酸序 列。
对本发明的优选实施例进行了详细记述，可以进行根据本发明的 原理的变形及修正，本发明的范围基于所附的发明要求保护范围和与 其等同的内容而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员 来说是显而易见的。