《一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103497904 A (43)申请公布日 2014.01.08 CN 103497904 A (21)申请号 201310428446.X (22)申请日 2013.09.18 C12N 1/19(2006.01) C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 陈坚 堵国成 王淼 刘松 万丹 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所 ( 特殊普通合伙。
2、 ) 11419 代理人 何自刚 王玉松 (54) 发明名称 一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶 原的方法 (57) 摘要 一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶 原的方法， 是用来自吸水链霉菌 CCTCC M203062 的谷氨酰胺转胺酶酶原， 构建重组表达载体 pINA1297-proTG， 并将其转化解脂耶氏酵母得到 基因工程菌， 并用基因工程菌发酵生产谷氨酰胺 转胺酶酶原。本申请构建的基因工程菌具有谷氨 酰胺转胺酶酶原表达量高的优点， 适于在工业生 产中应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产。
3、权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103497904 A CN 103497904 A 1/2 页 2 1. 一种高效表达谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌， 其特征在于， 用来自吸水链霉菌 CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原， 构建重组表达载体pINA1297-proTG， 并将其转化解 脂耶氏酵母， 得到基因工程菌 pINA1297-proTG/Y.lipolytica WSH-Z06。 2. 根据权利要求 1 所述基因工程菌， 其特征在于， 所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增自载 体 pET22b(+)/proTG 或。
4、根据 Genebank ： EU477523 合成。 3. 一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法， 其特征在于， 用来自吸水链霉菌 CCTCC M203062 的谷氨酰胺转胺酶酶原， 构建重组表达载体 pINA1297-proTG， 并将其转化解脂耶 氏酵母得到重组菌， 利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。 4. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于， 步骤如下 ： 1） 将谷氨酰胺转胺酶酶原基因和质粒 pINA1297 分别进行 SfiI 单酶切， 然后加入 KpnI 酶切， 酶切片段进行柱回收， 酶切质粒 pINA1297 进行胶回收， 将二者连接过夜， 转化大肠杆 菌感受态细胞， 。
5、使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子 ； 2） 将经验证构建成功的重组质粒 pINA1297-proTG 用 NotI 线性化， 胶回收片段转化至 解脂耶氏酵母得到重组菌 ； 3） 利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。 5. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于， 步骤如下 ： 1） 扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原的 PCR 产物 ； 2） 将回收的谷氨酰胺转胺酶酶原的 PCR 产物片段和质粒 pINA1297 分别进行 SfiI 单酶 切， 然后加入KpnI酶切， 酶切片段进行柱回收， 酶切质粒pINA1297进行胶回收， 将二者连接 过夜， 转化大肠杆菌感受态细胞， 使用卡那霉素抗性平板筛。
6、选阳性转化子 ； 3） 将经验证构建成功的重组质粒 pINA1297-proTG 用 NotI 线性化， 胶回收片段转化至 解脂耶氏酵母得到重组菌 ； 4） 利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。 6. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于， 所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增自载体 pET22b(+)/proTG。 7. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于， 所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增引物为 ： P1 ： 5 -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3 P2:5 -CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3 。 8. 根据权利要求。
7、 3 所述方法， 其特征在于， 具体步骤如下 ： 1) 谷氨酰胺转胺酶酶原引物设计 根据 pET22b(+)/proTG 基因序列设计谷氨酰胺转胺酶酶原基因的 PCR 引物 P1 和 P2 P1 ： 5 -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3 P2:5 -CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3 ； 2) 重组表达载体 pINA1297-proTG 的构建 利用引物 P1， P2， 以 pET22b(+)/proTG 质粒为模板， 扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原的 PCR产物， 按照胶回收试剂盒说明书回收PCR产物， 将回收到的片段。
8、和质粒pINA1297分别进 行 SfiI 单酶切， 50， 1h， 然后加入 KpnI 酶切， 37， 45min 后， 酶切片段进行柱回收， 酶切 质粒 pINA1297 进行胶回收， 将二者按一定比例连接过夜， 转化 E.coli JM109 感受态细胞， 使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子， 提取转化子质粒， 重组质粒经 SfiI 单酶切， 50， 权 利 要 求 书 CN 103497904 A 2 2/2 页 3 1h, 再经 KpnI 酶切， 37， 45min， 释放出大小为 5.2kb 和 1.1kb 的基因片段， 证明重组质粒 构建成功， 重组质粒命名为 p INA1297。
9、-proTG ； 3) 重组质粒 p INA1297-proTG 转化解脂耶氏酵母 将经验证构建成功的重组质粒p INA1297-proTG用NotI线性化， 胶回收片段转化至解 脂耶氏酵母中 ； 4) 转化子基因组插入片段检测 挑取 YNB 平板上解脂耶氏酵母单菌落接种于 YPD 液体培养基中， 提取菌株的基因组 DNA， 具体操作步骤按照天根提酵母基因组试剂盒说明书进行， 以 P1， P2 为引物， 基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 验证 ； 5） 利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。 权 利 要 求 书 CN 103497904 A 3 1/5 页 4 一种基因工程菌及其生产谷氨。
10、酰胺转胺酶酶原的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法， 属于酶工程技 术领域。 技术背景 0002 微生物谷氨酞胺转胺酶 (TransglutaminaseEC2.3.2.13 全称 R-glutaminyl-pept ide:amine-glutayle-transferase 简称 TGase)， 能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基 的 - 羧酰胺基与各种酰基受体发生酰胺基转移反应， 形成 -(- 谷氨酰基 ) 赖氨酸共 价键， 引起蛋白质分子内、 分子间发生交联、 蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内 谷氨酞胺基的水解。目前， 链霉菌 TG。
11、ase 已广泛用于食品工业， 适量添加 TGase 可显著改善 各类食品蛋白质的功能性质和营养价值， 应用范围包括肉制品、 水产品、 乳制品、 植物蛋白 制品等。此外， TGase 在一些非食品工业领域也具有较大的应用前景， 如组织工程、 纺织工 业及生物学研究等。然而， 依靠优势菌种选育和过程优化的传统发酵技术对 TGase 产量的 提高已十分有限， 远不能满足市场需求。 0003 在前期研究中， 本研究室筛选出一株产谷氨酰胺转胺酶 ( 简称 TGase) 的吸水 链霉菌 （Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062） ， 通过基因克隆方法， 得到了 M。
12、TG 基因序列及其上下游序列， 含 MTG 自身的启动子和终止子 （Genebank ： EU477523） ， 并 实现了 MTG 和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达 （Liu S,Zhang D,Wang M,Cui W,Chen K,Liu Y,Du G,Chen J,Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretion by Escherichia coli.FEMS Microbiol Lett324(2):98-105） 。 0004 解脂耶氏酵母。
13、于 1942 年首次被分离得到 , 先后被命名为 Candida lipolytica、 Endomycopsis lipolytica、 Saccharomycopsis lipolytica, 最 终 定 名 为 Yarrowia lipolytica( 解脂耶氏酵母 )。解脂耶氏酵母是研究的最广泛的非常规酵母之一 , 曾相继 用于工业化规模生产单细胞蛋白、 柠檬酸。由于它具有很强的分泌蛋白的能力 , 因此是一 种很有潜力的表达异源蛋白的宿主生物。由于强有力的基因扩增系统的发展， 逆转录转座 子的发现,调控型和组成型的强启动子的鉴定,近年来解脂耶氏酵母作为异源蛋白表达宿 主的研究进展很快，。
14、 迄今已有 42 个异源蛋白在解脂耶氏酵母中得到了表达， 而且大多数蛋 白的表达都能达到毫克 / 升。 发明内容 0005 为解决上述技术问题， 本发明提供了一种高效表达谷氨酰胺转胺酶酶原的基 因工程菌， 是用来自吸水链霉菌 （Streptomyces hygroscopicus） CCTCC M203062 的谷 氨酰胺转胺酶酶原 (proTG)， 构建重组表达载体 pINA1297-proTG， 并将其转化解脂耶氏 酵母 Yarrowia lipolytica WSH-Z06， 得到基因工程菌 pINA1297-proTG/Y.lipolytica WSH-Z06。 说 明 书 CN 10。
15、3497904 A 4 2/5 页 5 0006 本发明所使用菌种为解脂耶氏酵母 Yarrowia lipolytica WSH-Z06， 来源于中国 典型培养物保藏中心， 保藏编号 CCTCC NO ： M207143。 0007 本发明还提供了一种利用上述重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法， 步骤 如下 ： 0008 1） 扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原 （proTG） 的 PCR 产物 ； 0009 2） 将回收的 proTG 的 PCR 产物片段和质粒 pINA1297 分别进行 SfiI 单酶切， 然后 加入KpnI酶切， 酶切片段进行柱回收， 酶切质粒pINA1297进行胶回收， 。
16、将二者连接过夜， 转 化大肠杆菌感受态细胞， 使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子 ； 0010 3） 将经验证构建成功的重组质粒 pINA1297-proTG 用 NotI 线性化， 胶回收片段转 化至解脂耶氏酵母 ； 0011 4） 利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。 0012 proTG 可扩增自本实验室前期构建载体 pET22b(+)/proTG（已发表文章） 或根据 Genebank ： EU477523 相关信息人工合成。 0013 具体而言， 重组菌株构建方法如下 ： 0014 (1)proTG 引物设计 0015 根据 pET22b(+)/proTG 基因序列设计 proTG。
17、 基因的 PCR 引物 P1 和 P2。 0016 P1 ： 5 -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3 (SfiI) 0017 P2:5 -CGCGGATCCTTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3 (BamHI) 0018 (2) 重组表达载体 pINA1297-proTG 的构建 0019 利用引物 P1， 2， 以 pET22b(+)/proTG 质粒为模板， 扩增得到 proTG 的 PCR 产物， 按 照 Fermentas 的胶回收试剂盒说明书回收 PCR 产物， 将回收到的片段和质粒 pINA1297 分 别进行 SfiI 单酶切，。
18、 50， 1h, 然后加入 KpnI 酶切， 37， 45min 后， 酶切片段进行柱回收， 酶切质粒 pINA1297 进行胶回收， 将二者按一定比例连接过夜， 转化 E.coli JM109 感受态 细胞， 使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒， 重组质粒经 SfiI 单酶切， 50， 1h,再经KpnI酶切， 37， 45min， 释放出大小为5.2kb和1.1kb的基因片段， 证明重组 质粒构建成功， 重组质粒命名为 p INA1297-proTG。 0020 (3) 重组质粒 p INA1297-proTG 转化菌株 Y.lipolytica WSH-Z06 0021 。
19、将经验证构建成功的重组质粒p INA1297-proTG用NotI线性化， 胶回收片段转化 至菌株 Y.lipolytica WSH-Z06 中。转化方法为醋酸锂法。 0022 (4) 转化子基因组插入片段检测 0023 挑取 YNB 平板上单菌落接种于 YPD 液体培养基中， 提取菌株的基因组 DNA， 具体操 作步骤按照天根提酵母基因组试剂盒说明书进行。以 P1， 2 为引物， 基因组 DNA 为模板， 进 行 PCR 验证。 0024 本发明所用到的培养基 ： 0025 LB 培养基 ： 胰蛋白胨 10g/L、 酵母粉 5g/L、 NaCl10g/L， pH7.0 ； 0026 YPD培。
20、养基 ： 葡萄糖2.0g， 蛋白胨2.0g， 酵母菌粉1.0g， 溶于100.0ml蒸馏水中， 固 体培养基另加入琼脂 2.0g。 0027 YNB 培养基 YNB-N5000（w/v） ： 0.17% 酵母提取物 （不含氨基酸与硫酸盐） , 葡萄糖 1.0%, 硫酸铵 0.5%。其中葡萄糖单独灭菌， 然后充分混合。固体培养基需要加入 2.0% 的琼 说 明 书 CN 103497904 A 5 3/5 页 6 脂粉。 0028 PPB 培养基 （w/v） ： 蔗糖 2.0%， 酵母菌粉 0.132%， NH4Cl0.132%， KH2PO4 0.032%， MgSO4.7H2O 0.024%。
21、， 硫胺素 0.33mg/ml， 溶于终浓度为 0.02M 的柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液 （pH6.0） 中。 0029 pro-TGase 的活化 ： 0030 取 100L 含重组 pro-TGase 的发酵上清与 0.6L 的蛋白酶 K(20mg/mL) 溶液混 合均匀， 37恒温 15min。 0031 本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定 ： 0032 比色法测定酶活 ： 以 N-CBZ-GLN-GLY 为作用底物， L- 谷氨酸 - 单羟胺酸做 标准曲线。1 个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为 ： 37时每分钟催化形成 1mol L- 谷氨 酸 - 单羟胺酸的酶量 (U/mL)。 003。
22、3 试剂 A ： 100mg 的 N-CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL0.2moL/L 的 NaOH 溶液中， 加入 0.2mol/L pH6.0 的 Tris-HC 缓冲液 4mL， 0.1mol/L 羟胺 2mL， 0.01mol/L 的还原型谷胱甘肽 2mL， 并调节 pH 至 6.0。 0034 试剂 B ： 3mol/L 的 HCL， 12%TCA， 5%FeCL3按 1 ： 1 ： 1 混合。 0035 配制0-4mol/mL的L-谷氨酸-单异羟肟酸标准溶液。 取1mL试剂A与0.4mL 不同浓度的 L- 谷氨酸 - 单异羟肟酸标准溶液混合， 37水浴 10 分钟。加 0.4。
23、mL 试剂 B 终止反应， 在 525nm 比色， 绘制出标准曲线。以 0.4mL 经适当稀释的酶液代替标准溶液， 在 相同条件下保温和比色， 从标准曲线求出酶活。以 100加热 10 分钟的离心后的上清液为 空白。酶活力 (u/mL)=(6.8548OD525-0.0164) 稀释倍数 0036 本发明的优点和积极效果是 ： 0037 (1) 本发明探索了吸水链霉菌来源的微生物谷氨酰胺转胺酶酶原基因在 Y.lipolytica WSH-Z06 中的表达， 构建了高产微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌 株， 适用于工业化的生产和应用， 具有一定的理论价值和应用价值。 0038 (2) 本发明。
24、探索微生物谷氨酰胺转胺酶酶原基因工程菌构建的可操作对象， 所构 建的工程菌采用 Y.lipolytica WSH-Z06 发酵培养基， 发酵所产生的酶活达到 2.0U/mL。 附图说明 0039 图 1 基因工程菌构建图。 0040 图 2 重组表达载体 pINA1297-proTG 的双酶切验证 ； 0041 （1 ： Maker， 2 和 3 ： 质粒 pINA1297-proTG 分别经过 Sfi I、 BamH I 酶切后的片段） 。 0042 图 3 以酵母转化子基因组为模板的 PCR 电泳图 ； 0043 （1 ： 转化子 Y.l-pINA1297-proTG1， 2 ： 转化子 。
25、Y.l-pINA1297-proTG2， 3 ： 转化子 Y.l-pINA1297-proTG3， 4 ： 转化子 Y.l-pINA1297-proTG4， 5 ： 以质粒 pINA1297-proTG 为模 板， 6 ： Maker） 。 具体实施方式 0044 实施例 1 ： proTG 引物设计 0045 根据 pET22b(+)/proTG 基因序列设计 proTG 基因的 PCR 引物 P1 和 P2。 说 明 书 CN 103497904 A 6 4/5 页 7 0046 P1 ： 5 -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3 (SfiI) 0047。
26、 P2:5 -CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3 (BamHI) 0048 实施例 2 ： proTG 基因的克隆 0049 利用引物 P1， 2， 以 pET22b(+)/proTG 质粒为模板， 扩增条件为 ： 95预变性， 5min， 一个循环 ； 95变性， 30s， 58退火， 30s， 72延伸， 80s， 34 个循环 ； 72， 10min， 一个循 环 ； 12， 10min， 一个循环。PCR 扩增体系 ： 5PCR buffer（Mg2+Plus） 10L,dNTP Mix 4L， 模板 1L， 上下游引物各 0.1L， 灭菌的双蒸水。
27、 35L， Prime Star DNA 聚合酶 0.5L。采用凝胶回收试剂盒对 PCR 产物进行纯化和回收， 电泳检验回收产物的浓度。回 收产物存放在 1.5mL 的离心管中， -20冰箱保存备用。 0050 实施例 3 ： 重组表达载体 pINA1297-proTG 的构建 0051 将回收到的片段和质粒 pINA1297 分别进行 SfiI 单酶切， 50， 1h, 然后加入 BamHI 酶切， 37， 45min 后， 酶切片段进行柱回收， 酶切质粒 pINA 1297 进行胶回收， 将二 者按一定比例连接过夜， 转化 E.coli JM109 感受态细胞， 使用卡那霉素抗性平板筛选阳。
28、 性转化子。提取转化子质粒， 重组质粒经 SfiI 单酶切， 50， 1h, 再经 BamHI 酶切， 37， 45min， 释放出大小为5.2kb和1.1kb的基因片段， 证明重组质粒构建成功， 重组质粒命名为 p INA1297-proTG。实施例 4 ： 重组质粒 p INA1297-proTG 转化菌株 Y.lipolytica WSH-Z06 0052 将经验证构建成功的重组质粒p INA1297-proTG用NotI线性化， 胶回收片段转化 至菌株 Y.lipolytica WSH-Z06 中。转化方法为醋酸锂法。转化步骤如下 ： 0053 （1） 菌株 Y.lipolytica 。
29、WSH-Z06 在 YPD 固体培养基上划线， 28培养 2d ； 0054 （2） 挑一环单菌落溶于 1mlTE 中 ,10000rpm,1min, 去上清 ; 0055 （3） 加入 600l0.1mol/L pH6.0 醋酸锂 LiAc， 28水浴 1h， 注意不要晃动样品 ； 水浴结束后， 3000rpm 下离心 2min， 弃上清 ； 0056 （4） 轻轻将菌体重新悬浮于 80.0l0.1mol/l 的醋酸锂 （pH6.0） 中 ； 0057 至此， 酵母菌感受态细胞制备完成。 0058 （5） 取 40.0l 上述酵母菌感受态， 加入 2.0l 单链鱼精 DNA 和 3.0l 经。
30、 NotI 线性化的 DNA 片段 ； 28水浴 15min， 注意水浴过程中不要晃动样品 ； 0059 （6） 上述样品中加入 350.0l40%（w/v） 的 PEG4000（溶于 0.1mol/l pH6.0 乙酸 锂中） 与 16.0l1mol/l 的 DDT ； 28水浴 1h， 注意不要晃动样品 ； 0060 （7） 逐滴加入 40.0l DMSO， 轻轻混匀， 然后置于 39水浴中热休克 10min ； 0061 （8） 向上述样品中加入 600.0l0.1mol/l 的醋酸锂 （pH6.0） ， 轻轻晃动混匀 ； 0062 （9） 将酵母菌悬液稀释成不同浓度涂布 YNB 平板，。
31、 28培养 5d， 得到单菌落。 0063 实施例 5 ： 转化子基因组插入片段检测 0064 挑取 YNB 平板上单菌落接种于 25mL YPD 液体培养基中， 28， 200rpm, 培养 24h， 取 500l 菌液于装有 500l 灭过菌的甘油管中， 甘油的终浓度为 （v/v） 18%,， -80冰箱 保藏备用。同时取菌液少许， 用于提取菌株的基因组 DNA， 具体操作步骤按照天根提酵母基 因组试剂盒说明书进行。以 P1， 2 为引物， 基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 验证。扩增程序与 实例 2 中的相同。将获得的阳性转化子命名为 Y.l-pINA1297-proTG。 006。
32、5 实施例 6 ： 重组菌 Y.l-pINA1297-proTG 发酵培养， 酶活测定。 0066 取保存于甘油管中的阳性菌 Y.l-pINA1297-proTG100l 接于 25mL YPD 液体培 说 明 书 CN 103497904 A 7 5/5 页 8 养基中， 28， 200rpm, 培养 18h， 然后按 10% 的转接量接于 25mL PPB 液体培养基中， 28， 200rpm， 分别在发酵第 4 天、 第 5 天、 第 6 天取样测酶活。酶活结果如表 1。 0067 表 1 重组菌 Y.l-pINA1297-proKexTG 发酵上清活化后酶活 0068 说 明 书 CN 103497904 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 103497904 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103497904 A 10 。