本中请是2011年8月17日递交的、名称为“一种高产L-丙氨酸的XZ- A26菌株及构建方法与应用”的中国发明专利申请No.201110235159.8的 分案申请。
技术领域
本发明涉及一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株，属大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)，该菌株于2010年7月26日保藏在位于“北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所”的“中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.4036。本发明 还涉及该菌株的构建方法及该菌株在制备L-丙氨酸中的应用，属于生物工 程技术领域。
背景技术
L-丙氨酸在食品和医药领域有着广泛的用途。在食品领域，L-丙氨酸 的添加可明显提高食品及饮料中的蛋白质利用率，食用后能迅速恢复疲 劳，振奋精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善风味，提高含醇 饮料的质量等。L-丙氨酸具有独特的改善风味效果，它与其它氨基酸配合 能加强食品、饮料风味。它还可以改善有机酸的酸味，添加后能使有机酸 更接近天然果酸的酸味。在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6的重要原 料，同时也是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分。由L-丙氨酸组成的 复合氨基酸注射液-《14氨基酸注射液-800》是主治肝脑病新药，可治疗 肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒。L-丙氨酸还是一种 很好的利尿药。
目前L-丙氨酸的生产是以天门冬氨酸为原料，通过酶催化技术(天冬 氨酸脱羧酶)来生产。由于天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙 氨酸的生产成本及售价严重依赖于石油价格。目前国内L-丙氨酸生产厂家 均是使用酶催化技术。
微生物发酵法生产L-丙氨酸和酶催化技术相比有诸多优点：首先，用 葡萄糖代替天冬氨酸作为生产原料。酶催化技术以天冬氨酸为原材料。目 前天冬氨酸的生产是以顺酐为原料，顺酐的资源紧张和价格高涨导致天冬 氨酸的供给也存在着巨大的隐患。微生物发酵法技术是以葡萄糖为原料。 葡萄糖属于可再生生物质资源，目前主要是通过玉米淀粉制得，将来可以 从木质纤维素中提炼，成本可以长期保持在稳定的水平。利用葡萄糖为原 材料，既有很大的价格优势，又能长期维持价格的稳定。
其次，用微生物发酵法技术代替酶催化技术。酶催化技术需要对菌株 进行高密度培养，分泌出生产L-丙氨酸所需的天冬氨酸脱羧酶。该过程对 氧气的需求量很大；另外，由于天冬氨酸脱羧酶基因是克隆在质粒上进行 高表达的，因此在菌株培养过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗 传复制。这些因素导致酶催化生产工艺复杂。微生物发酵法生产工艺简 单，只需在起始阶段往发酵罐中投加葡萄糖和无机盐，并接入少量的菌 种。另外，微生物发酵法和酶催化技术相比，其最终发酵液中杂质少很 多，这既可以节约L-丙氨酸的分离提取成本，也可以节约废水处理的成 本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过生物发酵法生产高浓度L-丙氨酸的大 肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌XZ-A26，该菌株保藏号为CGMCC No.4036，其具有将糖类原料发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力，其是通过 将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌 ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙 酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基 因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌 (如附图1)。
本发明的另一个目的是提供上述菌株的构建方法，其包括下述步骤：
(1)L-丙氨酸脱氢酶基因的整合：将大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢 酶基因ldhA扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上，得质粒pXZ-A01；将含 有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒 pXZ-A01的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ-A02；将质粒pXZ-A02的DNA 扩增片段电转至带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739，筛选卡那霉素抗 性的菌落，得菌株XZ-A01；将扩增的L-丙氨酸脱氢酶基因连接至质粒 pXZ-A01的DNA片段，得到质粒pXZ-A03；然后将质粒pXZ-A03的DNA扩 增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A01，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌 落，得菌株XZ-A02；
(2)依次敲除上述所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇 脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；
丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除：将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基 因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上，得质粒pXZ-A04；将含有卡那霉素 基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A04的 DNA扩增片段上，得到质粒pXZ-A05；将质粒pXZ-A05的DNA扩增片段电 转至带有pKD46质粒的菌株XZ-A02，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株 XZ-A03；将质粒pXZ-A04的DNA扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒 pXZ-A06；然后将质粒pXZ-A06的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的 XZ-A03，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A04；
乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶 基因的敲除：按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，分别以所得菌株 XZ-A04、XZ-A06、XZ-A08和XZ-A10为起始原料，进行乙醇脱氢酶基因、 乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除，分别得到 菌株XZ-A06、XZ-A08、XZ-A10和XZ-A12；
(3)在发酵罐中连续传代培养步骤(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ- A26。
对大肠杆菌ATCC8739的代谢网络进行系统分析，设计出高效合成L- 丙氨酸的策略。为了使细胞能够积累L-丙氨酸，需要进行三个方面的改造 (如附图1)：首先，需要引入L-丙氨酸脱氢酶基因。L-丙氨酸脱氢酶能 够将丙酮酸转化为L-丙氨酸，同时消耗一个NADH。其次，需要敲除丙酮 酸竞争途径基因。由于丙酮酸在大肠杆菌中是一个关键的中间代谢节点， 因此需要将丙酮酸天然代谢途径失活，从而使代谢流全部转入L-丙氨酸的 合成。这些竞争途径包括乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇 脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因。第三，需要敲除L-丙氨 酸降解途径基因。L-丙氨酸在大肠杆菌中能够被丙氨酸消旋酶转化为D-丙 氨酸，这会大大降低L-丙氨酸的手性纯度。因此需要敲除丙氨酸消旋酶， 避免D-丙氨酸的积累。
L-丙氨酸工程菌株的构建：
根据上述的设计方案，在大肠杆菌ATCC8739的染色体上进行基因的 敲除和整合。
首先，将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌 ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，得到大肠杆菌XZ-A02。本发明所用到 的序列如核苷酸序列表。
通过PCR扩增的方法，从嗜热脂肪地芽孢杆菌的基因组DNA中扩增出 L-丙氨酸脱氢酶基因。所用引物为alaD-F/alaD-R(序列1和2)。为了 使L-丙氨酸脱氢酶基因能够在工程菌中高效、稳定地表达，将其整合至大 肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处。基因整合采用两步同源重组的 方法(如附图2)。第一步，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4) 扩增大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因(ldhA)，扩增产物包含乳酸脱氢酶编码 基因及其上下游各500个碱基，并将其克隆到pEASY-T1克隆载体(北京 全式金生物技术有限公司)上，得到质粒pXZ-A01。第二步，以pXZ-A01 质粒DNA为模板，使用引物ldhA-1/ldhA-2(序列5和6)扩增出一段DNA 片段，扩增产物包含pEASY-T1载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游的500 个左右碱基。第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基 因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒pXZ- A02。第四步，以pXZ-A02质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down (序列3和4)扩增出DNA片段I，用于第一次同源重组。首先将pKD46 质粒转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的 大肠杆菌ATCC8739，筛选卡那霉素抗性的菌落。经过PCR验证，挑选一 个正确的单菌落，将其命名为XZ-A01。第五步，将L-丙氨酸脱氢酶基因 连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒pXZ-A03。第六步，以pXZ-A03 质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增出DNA 片段II，用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒转化至XZ-A01，然后 将DNA片段II电转至带有pKD46的XZ-A01，将其转移至含有10％蔗糖的 LB液体培养基，培养24小时后在含有6％蔗糖的LB固体培养基上划线培 养。经过PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A02。本发明 的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒及构建如下表1。
表1：本发明的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒
随后，在XZ-A02中依次敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基 因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因，使L-丙氨酸脱氢酶成为唯一能够 利用丙酮酸和消耗NADH的代谢途径。基因敲除的方法和基因整合类似， 也采用两步同源重组的方法。区别在于第五步，若要进行基因敲除，将第 二步PCR扩增的产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二步同源重 组。在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A04。 所用引物为pflB-up/pflB-down(序列7和8)、pflB-1/pflB-2(序列9 和10)。在XZ-A04中进行乙醇脱氢酶基因的敲除，得到菌株XZ-A06。所 用引物为adhE-up/adhE-down(序列11和12)、adhE-1/adhE-2(序列13 和14)。在XZ-A06中进行乙酸激酶基因的敲除，得到菌株XZ-A08。所用 引物为ackA-up/pta-down(序列15和16)、ackA-1/pta-2(序列17和 18)。在XZ-A08中进行富马酸还原酶基因的敲除，得到菌株XZ-A10。所 用引物为frdB-up/frdC-down(序列19和20)、frdB-1/frdC-2(序列21 和22)。在XZ-A10中进行丙氨酸消旋酶基因的敲除，避免L-丙氨酸被转 化为D-丙氨酸，得到菌株XZ-A12。所用引物为dadX-up/dadX-down(序列 23和24)、dadX-1/dadX-2(序列25和26)。
L-丙氨酸工程菌株的优化：
L-丙氨酸工程菌XZ-A12的生长和L-丙氨酸生产相耦联(如附图 3)。采用代谢进化的方法，在发酵罐中连续传代培养L-丙氨酸工程菌， 逐步提高工程菌的生长速度、L-丙氨酸的生产速率和产量。经过300代优 化，构建出高产L-丙氨酸的工程菌XZ-A26。
本发明还有一个目的是应用大肠杆菌XZ-A26菌株(该菌株保藏号为 CGMCC No.4036菌株)发酵生产L-丙氨酸，其采用厌氧培养条件，培养温 度为30-42℃，控制pH在6.5-7.5，在培养基中培养保藏号为CGMCC No.4036的XZ-A26菌株，分离提取L-丙氨酸。
种子培养基和发酵培养基组成为：糖类原料20-150g/L，氮源1- 5g/L，NaH2PO4 1-5g/L，Na2HPO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.3-1g/L， CaCl2 2H2O 0.05-0.1g/L，微量无机盐1-5ml/L，
所述糖类原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳 糖，及木薯、玉米、甜菜、木质纤维素的水解物和糖浆中的一种或多种；
氮源为无机含氮化合物，包括氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种 或多种；微量无机盐包括可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸 盐中的一种或多种。
本发明通过代谢工程的方法，构建出能发酵生产高浓度L-丙氨酸的大 肠杆菌XZ-A26菌株，其属大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株 于2010年7月26日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)”，其保藏号为CGMCC No.4036。利用该XZ-A26菌株发酵 生产L-丙氨酸的产量高达115g/L，适合工业化生产L-丙氨酸。
附图说明
图1为L-丙氨酸工程菌合成代谢途径；
图2为菌株XZ-A26基因构建方案流程图；
图3为L-丙氨酸工程菌和L-丙氨酸生产的耦联关系图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步的说明，燕不构成对本发明实质内容 的限制。
实施例1
(XZ-A26菌株的构建)
(1)通过PCR扩增的方法，从嗜热脂肪地芽孢杆菌(来源于合肥百 迈生物技术有限公司)的基因组DNA中扩增出L-丙氨酸脱氢酶基因。所用 引物为alaD-F/alaD-R(序列1/序列2)。扩增体系为：Stratagene PfuUltra10Xbuffer 5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板 20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体 积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性30 秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟 (1个循环)。
基因整合采用两次同源重组的方法(如附图2)。第一步，使用引物 ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因 (ldhA)，扩增体系为：Stratagene PfuUltra10Xbuffer5ul、dNTP (10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra (2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性 2分钟(1个循环)；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟 (30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物包含乳酸脱氢 酶编码基因及其上下游各500个碱基，并将其克隆到pEASY-T1克隆载体 (来源于北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系为：1ul PCR扩增 产物、1ul pEASY-T1克隆载体、3ul蒸馏水，总体积为5ul。轻轻混合、 室温反应5分钟后加入50ul Trans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式 金生物技术有限公司)，冰浴20分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2 分钟。加入250ul LB培养基，200转，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂 在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落提取质粒DNA 进行验证。选取一个正确的质粒，命名为pXZ-A01。第二步，以pXZ-A01 质粒DNA为模板，使用引物ldhA-1/ldhA-2(序列5/序列6)扩增出一段 DNA片段，扩增体系为：Stratagene PfuUltra10Xbuffer5ul、dNTP(10 mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5 U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟 (1个循环)；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸5分钟(30个 循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物包含pEASY-T1载体和 乳酸脱氢酶编码基因上下游的500个左右碱基。第三步，将含有卡那霉素 基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的 PCR扩增产物。pBM001质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)经过 SmaI和SfoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有卡那霉素基因 (Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。连接体系为10ng 的第二步PCR扩增产物，30ng Km-sacB DNA片段，2ul10XT4 ligation buffer(NEB公司)，1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul。室温连接2小时，取5ul加入50ul Trans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司)，冰浴 20分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基， 200转，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上， 过夜培养后，挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。选取一个正确的质 粒，命名为pXZ-A02。第四步，以pXZ-A02质粒DNA为模板，使用引物 ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增出DNA片段I，扩增体系为： Stratagene PfuUltra10Xbuffer5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、 DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水 40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃ 变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸4分钟(30个循环)；72℃延伸 10分钟(1个循环)。DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因上游500个碱 基、Km-sacB DNA片段、乳酸脱氢酶编码基因下游500个碱基。将DNA片 段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至大 肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC 8739。电转条件为：首先准备带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739的电转化 感受态细胞；将50ul感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放 置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio- Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养 基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200转，37℃孵育2小 时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5 个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A01。第 五步，将L-丙氨酸脱氢酶基因连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒 pXZ-A03。第六步，以pXZ-A03质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA- down(序列3/序列4)扩增出DNA片段II。DNA片段II包含乳酸脱氢酶 编码基因上游500个碱基、乳酸脱氢酶编码基因下游500个碱基。DNA片 段II用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至 XZ-A01，然后将DNA片段II电转至带有pKD46的XZ-A01，电转条件为： 首先准备带有pKD46的XZ-A01的电转化感受态细胞；将50ul感受态细胞 置于冰上，加入50ngDNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的 Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数 为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后 转移至试管中，200转，37℃孵育2小时。将其转移至含有10％蔗糖的LB 液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗 糖的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，挑选一个正确的单菌 落，将其命名为XZ-A02。
(2)依次敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶 基因、富马酸还原酶基因，使L-丙氨酸脱氢酶成为唯一能够利用丙酮酸和 消耗NADH的代谢途径。基因敲除的方法和基因整合类似，也采用两步同 源重组的方法(如附图2)。区别在于第五步，若要进行基因敲除，将第 二步PCR扩增的产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二步同源重 组。具体步骤如下：第二步PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗 (EasyPure PCR Purification Kit，来源于北京全式金生物技术有限公 司)；取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2ul 10XT4 ligation Buffer (NEB公司)、1ul T4 Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至 20ul，37℃反应30分钟；加入1ul T4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，室温反应2小时；取5ul加入50ul Trans1-T1 感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司)，冰浴20分钟。 42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200转， 37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培 养后，挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。
在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除(操作步骤同上)： 将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体 上，得质粒pXZ-A04；将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因 sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A04的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ- A05；将质粒pXZ-A05的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株XZ- A02，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A03；将质粒pXZ-A04的DNA 扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒pXZ-A06；然后将质粒pXZ-A06 的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A03，培养筛选在蔗糖中不能 生长的菌落，得菌株XZ-A04；其中，丙酮酸甲酸裂解酶基因的扩增引物、 质粒pXZ-A05的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A06的DNA扩增引物为： pflB-up/pf1B-down(序列7/序列8)，质粒pXZ-A04的DNA扩增引物 为：pflB-1/pflB-2(序列9/序列10)。
在XZ-A04中进行乙醇脱氢酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行丙 酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A06，其中，所用乙醇脱氢酶基 因的扩增引物、质粒pXZ-A08的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A09的DNA扩 增引物为：adhE-up/adhE-down(序列11/序列12)，质粒pXZ-A07的 DNA扩增引物为：adhE-1/adhE-2(序列13/序列14)。
在XZ-A06中进行乙酸激酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行丙酮 酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A08。乙酸激酶基因的扩增引物、 质粒pXZ-A11的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A12的DNA扩增引物为： ackA-up/pta-down(序列15/序列16)，质粒pXZ-A10的DNA扩增引物 为：ackA-1/pta-2(序列17/序列18)。
在XZ-A08中进行富马酸还原酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行 丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A10。富马酸还原酶基因的扩 增引物、质粒pXZ-A14的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A15的DNA扩增引物 为：frdB-up/frdC-down(序列19/序列20)，质粒pXZ-A13的DNA扩增 引物为：frdB-1/frdC-2(序列21/序列22)。
在XZ-A10中进行丙氨酸消旋酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行 丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，避免L-丙氨酸被转化为D-丙氨酸，得到 菌株XZ-A12。丙氨酸消旋酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A17的DNA扩增引 物以及质粒pXZ-A18的DNA扩增引物为：dadX-up/dadX-down(序列23/序 列24)，质粒pXZ-A16的DNA扩增引物为：dadX-1/dadX-2(序列25/序 列26)。
(3)发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，氯化铵5g/L，NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O 0.1g/L，微量无 机盐5ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O1.5mg， CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl2 0.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O2 0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
500ml发酵罐发酵培养基体积为300ml，121℃灭菌15min，冷却后接 入XZ-A12，接种量为0.1％(V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为 100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5。在发酵罐中连续传代培养工程 菌，每24h将发酵罐中的菌液按1∶1000的比例转接到一个新的发酵罐 中。经过300代转接，得到菌株XZ-A26。
实施例2
(以XZ-A12菌株生产L-丙氨酸)
种子培养基和发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，氯化铵5g/L， NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O 0.1g/L，微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为： FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl2 0.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O2 0.2mg，蒸馏水定容至1L， 过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入 XZ-A12，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min，培养18h，用于发酵培 养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％ (V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH 在6.5，发酵时间为48h。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中 的组分进行测定。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司 的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))。发酵液 中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H 糖分析柱。
结果：发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量：L-丙氨酸为6g/L，乳酸、 乙酸、乙醇以及丁二酸含量均低于0.1g/L。
实施例3
(以XZ-A26菌株生产L-丙氨酸)
种子培养基和发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，氯化铵4g/L， NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O 0.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为： FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl2 0.1mg，Na2MoO4·2H2O0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L， 过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入 XZ-A26，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min，培养18h，用于发酵培 养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％ (V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH 在6.5，发酵时间为48h。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中 的组分进行测定。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司 的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))。发酵液 中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H 糖分析柱。
结果：发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量：L-丙氨酸为95g/L，乳酸含 量低于0.1g/L、乙酸含量低于0.1g/L、乙醇含量低于0.1g/L、丁二酸含 量低于0.1g/L。
实施例4
(以XZ-A26菌株生产L-丙氨酸)
种子培养基和发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，氯化铵5g/L， NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O 0.1g/L，微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为： FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl2 0.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O2 0.2mg，蒸馏水定容至1L， 过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入 XZ-A26，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min，培养18h，用于发酵培 养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％ (V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH 在6.5，发酵时间为48h。HPLC分析发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量：L- 丙氨酸为115g/L，乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸含量均低于0.1g/L。