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1、(10)授权公告号 CN 102086440 B (45)授权公告日 2013.02.06 CN 102086440 B *CN102086440B* (21)申请号 201010565301.0 (22)申请日 2010.11.30 CGMCC No4342 2010.11.15 C12N 1/14(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12C 1/16(2006.01) (73)专利权人 中国食品发酵工业研究院 地址 100027 北京市朝阳区霄云路 32 号 (72)发明人 宋绪磊 陈洪元 李建飞 宋涛 孙志伟 江伟 唐坤甜 CN 1782080 A,2006.06。
2、.07, 全文 . US 2008161225 A1,2008.07.03, 全文 . 徐军等 . 一个抗真菌蛋白在绿色木霉中的分 泌表达 .生物化学与生物物理学报 .2003, 第 35 卷 ( 第 5 期 ),454-458. (54) 发明名称 一种产抗真菌蛋白菌株的筛选方法及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种产抗真菌蛋白菌株和该菌 株的筛选方法以及利用该菌发酵生产抗真菌蛋白 的方法。利用该方法筛选获得的菌株命名为巨大 曲霉 Aspergillus giganteus AF-11， 保藏号为 CGMCC NO.4342， 该菌株具有更高的抗真菌蛋白产 量。使用本发明提供的筛选菌种及方。
3、法生产的抗 真菌蛋白能够高效抑制啤酒制麦过程的霉菌， 尤 其是镰刀霉属， 提高麦芽质量， 和常规处理方法相 比较， 更安全， 更有效。具有很好的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘涛 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1.一种曲霉菌株， 其分类命名为Aspergillus giganteus AF-11， 已保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC NO 4342。 2. 如权利要求 1 所述曲霉菌株。
4、在啤酒大麦制麦发芽过程中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102086440 B 2 1/2 页 3 一种产抗真菌蛋白菌株的筛选方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及一株产抗真菌蛋白的菌株， 命名为 Aspergillus giganteus AF-11， 已 于 2010 年 11 月 15 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址是 ： 北 京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏编号为CGMCC NO.4342。 同时涉及获得该菌的诱变筛 选方法和利用该菌株发酵抗真菌蛋白并在啤酒大麦制麦中的应用的方法， 属于微生物制麦 技术领域。 0002 背景技术 0003 AFP。
5、(antifungal protein) 是由 Aspergillus giganteus 分泌的小分子量碱性蛋 白， 可有效抑制丝状真菌的生长， 尤其是动植物致病真菌。近几年的研究发现 AFP 对抑制 丝状真菌具有安全、 高效、 广谱、 稳定的特点， 而这些显著的特点使其最有希望成为新的抗 真菌抗生素、 安全的天然食品防腐剂、 可靠的生物农药和基因工程目的基因载体。1965 年， Olson 等从美国密歇根州农场土壤中分离筛选得到的一株 Aspergillus giganteus 菌株并 发酵液中分离得到一种由51个氨基酸组成的小分子碱性蛋白AFP(抗真菌蛋白)， 并证 明对丝状真菌具有明显。
6、的抑制作用。研究还发现 AFP 可高效抑制许多人类和动植物致病霉 菌， 而对细菌和酵母菌无抑制作用， 这种选择性抑制作用在医学和应用生物技术上引起了 人们的广泛兴趣和高度关注。2006 年， Szappanos 等研究分析了 AFP 对哺乳动物细胞功能 的影响， 通过实验发现AFP对哺乳动物细胞无细胞毒素效应和免疫反应， 并认为AFP是具有 很好应用前景和开发研究价值的新的抗真菌抗生素。 0004 目前， 啤酒大麦在制麦过程由于潮湿的环境容易污染镰刀霉、 烟曲霉和根霉等真 菌。这些受污染的麦芽不但影响酿造性能还影响食品安全， 目前一般采用制麦过程中加入 石灰水来抑制菌的污染， 但是这样也会带来。
7、食品安全的隐患。利用微生物自身产生的抗真 菌蛋白来抑制污染很少有报道， 尤其是关于 Aspergillus giganteus 的研究更是几乎没有 看到。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一株能广谱抗真菌的高产 AFP 菌株及其筛选方法。同时利用 该菌株发酵生产 AFP 的方法在制麦过程中进行有害微生物控制。本发明的目的可以通过以 下措施达到 ： 0006 1、 土壤样品取样及前处理 ： 取碱性土壤 2g， 用水浴、 乙醇和蛋白胨处理。 0007 2、 真菌培养 ： 在 28， 筛选培养基 ( 葡萄糖 10g， NH4NO31g/L， 酵母膏 1g/L， K2HPO40.5g/L， Mg。
8、SO4 7H2O 0.5g/L， 孟加拉红 0.006g/L， 链霉素 0.003g/L， 琼脂 20g/L。) 培 养 4-5 天后， 挑选可以抑制其它霉菌生长的菌株。 0008 3、 驯化诱变 ： 30条件下， 将筛选的菌株 YPD 培养基上驯化培养 4-5 天， 然后经 EMS 诱变， 挑选抑菌圈较大的菌株作为复筛菌株。 0009 4、 摇瓶复筛 ： 摇瓶发酵， 采用纸片法或者牛津杯法检测发酵液菌株抑菌圈大小。 0010 5、 选出抑菌能力最强的菌株， 发酵生产 AFP， 用考马斯亮蓝比色法测定 AFP 含量。 说 明 书 CN 102086440 B 3 2/2 页 4 0011 6、。
9、 将 AFP 用于啤酒大麦的制麦过程中， 抑制菌的污染。 0012 本发明取得以下优点和显著进步 ： 0013 1、 得到了一株高产抗真菌蛋白的菌株， 保藏号为 CGMCC NO.4342。 0014 2、 将该菌株发酵生产 AFP 用于啤酒大麦的制麦过程中， 抑制菌的污染， 减少了食 品加工过程中化学试剂石灰水的加入， 用生物的手段更加安全环保的解决了制麦污染问 题。 具体实施方式 0015 实施例 1 产抗真菌蛋白菌株的筛选 0016 1、 1.5g 土样加入 10ml 无菌生理盐水， 在 60条件下， 水浴 30min 0017 2、 去除无菌水， 加入 65乙醇处理 10min， 加入。
10、 0.1浓度的蛋白胨溶液处理 10min。 0018 3、 将 0.1ml 溶液接种到肌氨酸蔗糖培养基， 25条件下， 培养 7 天。 0019 4、 挑选不同形态特征的单菌落， 转接到MEA(蔗糖25g/L， 硝酸钠1.5g/L， 磷酸氢二 钾 0.6g/L， 氯化钾 0.4g/L， 硫酸镁 0.3g/L， 硫酸亚铁 0.08g/L， 琼脂 20g/L) 斜面固体培养基 上。 0020 5、 用 10甘油收集并保藏单菌落的孢子。 0021 6、 分离的单菌落在 MEA 培养基 pH4.525条件下培养 4 天。 0022 7、 打孔器挖取直径 25mm 的菌苔， 移至已灭菌的培养皿中， 每皿。
11、三块。 0023 8、 MEA 培养基冷却至 50， 加入供试菌孢子 1106/ml， 25， 培养 48h 0024 9、 测量抑菌能力大小， 将抑菌圈最大的Aspergillus giganteus AF-11接种保存。 0025 实施例 2AFP 发酵生产 0026 将 AF-11 接种到斜面固体培养基上， 28， 培养 4 天， 用无 10ml 菌水冲洗斜面， 制 成孢子菌悬液用于种子培养。按 10接种量， 将孢子菌悬液接种到种子培养液 ( 葡萄糖 13g/L， 蛋白胨 3g/L， 酵母浸膏 3g/L， NaCl 5g/L) 中， 28， 220rpm 培养 4 天。按 10接种 量， 将种子液接种到 2L 发酵培养中， 30， 220rpm 培养， 4 天。阳离子交换层析分离纯化提 取 AFP， 采用考马斯亮蓝比色法测定得到的 AFP 为 10.2mg。 0027 实施例 3AFP 制麦微生物控制 0028 称取1000g大麦， 在4000ml无菌水中浸泡4小时。 经浸泡的大麦在15， 发芽3 4 天。AFP 用水稀释到 16g/g 大麦浓度， 加入到大麦中。经 4 天后， 检测大麦发芽污染情 况， 可以看到污染情况明显改善， 与对照样相比， 污染霉菌总数减少 90。 说 明 书 CN 102086440 B 4 。