克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法.pdf

《克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法.pdf（37页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103459588 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103459588 A *CN103459588A* (21)申请号 201280015362.7 (22)申请日 2012.03.26 076715/2011 2011.03.30 JP C12N 1/19(2006.01) C12P 7/10(2006.01) C12N 15/09(2006.01) (71)申请人 丰田自动车株式会社 地址 日本爱知县 (72)发明人 志佐伦子 赤田伦治 星田尚司 上村毅 牟田口梢荣 德弘健郎 片平悟史 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247 。

2、代理人 曽祯 段承恩 (54) 发明名称 克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变 体酵母的乙醇的制造方法 (57) 摘要 将属于克鲁维酵母属的酵母进行改变以提高 来自木糖的乙醇收率。减弱属于克鲁维酵母属的 酵母中的选自来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH1 基因、 与该 ADH1 基因在功能上等价的基因、 来源 于马克斯克鲁维酵母的ADH4基因、 和与该ADH4基 因在功能上等价的基因中的至少一种基因。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.09.26 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2012/057704 2012.03.26 (87)PCT申请的公布数据 W。

3、O2012/133275 JA 2012.10.04 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 13 页 附图 12 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表13页 附图12页 (10)申请公布号 CN 103459588 A CN 103459588 A *CN103459588A* 1/1 页 2 1. 突变体酵母， 减弱了属于克鲁维酵母属的酵母中的选自来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH1 基因、 与该 ADH1 基因在功能上等价的基因、 来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH4 基因、 和 与该 ADH4 基。

4、因在功能上等价的基因中的至少一种基因。 2. 根据权利要求 1 所述的突变体酵母， 其特征在于， 所述属于克鲁维酵母属的酵母是 马克斯克鲁维酵母。 3. 根据权利要求 1 所述的突变体酵母， 其特征在于， 所述与 ADH1 基因在功能上等价的 基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母， 并编码以下 (a) (c) 的任 一蛋白质， (a) 包含序列号 2 的氨基酸序列的蛋白质， (b) 包含相对于序列号 2 的氨基酸序列具有 90以上的序列类似性的氨基酸序列， 并 具有醇脱氢酶活性的蛋白质， (c) 包含相对于序列号 2 的氨基酸序列缺失、 替换、 添加或插入了 1 多个氨基酸的氨。

5、 基酸序列， 并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。 4. 根据权利要求 1 所述的突变体酵母， 其特征在于， 所述与 ADH4 基因在功能上等价的 基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母， 并编码以下 (a) (c) 的任 一蛋白质， (a) 包含序列号 4 的氨基酸序列的蛋白质， (b) 包含相对于序列号 4 的氨基酸序列具有 90以上的序列类似性的氨基酸序列， 并 具有醇脱氢酶活性的蛋白质， (c) 包含相对于序列号 4 的氨基酸序列缺失、 替换、 添加或插入了 1 多个氨基酸的氨 基酸序列， 并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。 5. 乙醇的制造方法， 其包括以下工序 ： 用含木糖的培养基。

6、来培养权利要求 1 4 的任一项所述的突变体酵母的培养工序， 和 然后， 从培养基回收乙醇的回收工序。 6. 根据权利要求 5 所述的乙醇的制造方法， 其特征在于， 将所述培养工序在包含所述 突变体酵母、 含木素纤维素的生物质和糖化酶的反应体系中进行。 权 利 要 求 书 CN 103459588 A 2 1/10 页 3 克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇 的制造方法 技术领域 0001 本发明涉及利用了克鲁维酵母属 (Kluyveromyces) 酵母的突变体酵母和使用了 该突变体酵母的乙醇的制造方法。 背景技术 0002 包含木素纤维素的生物质可以作为乙醇等有用醇和 / 。

7、或有机酸的原料而被有效 地利用。包含木素纤维素的生物质包括木质系生物质和草本系生物质。木质系生物质等包 含木素纤维素的生物质主要由纤维素、 半纤维素和木质素构成。为了由包含木素纤维素的 生物质制造乙醇等液体燃料， 将纤维素和 / 或半纤维素水解 ( 糖化 ) 至构成单糖， 通过发酵 而将单糖转换为乙醇。纤维素由葡萄糖构成， 半纤维素主要由阿拉伯糖和木糖构成。因此， 在利用包含木素纤维素的生物质制造乙醇时， 期望不仅葡萄糖， 连木糖也作为发酵的底物 而被有效地利用。 0003 另外， 在由包含木素纤维素的生物质制造乙醇时， 如果能够将上述的糖化反应和 发酵反应同时 ( 不区分各反应工序地 ) 进。

8、行， 则可以实现制造成本的减低。将该方法称为 同时糖化发酵方法。同时糖化发酵中， 需要具有能够在糖化酶的反应温度区域 ( 约 40以 上 ) 发酵的耐热性、 不仅能够利用葡萄糖还能够利用 5 碳单糖木糖作为底物的微生物。 0004 作为具有耐热性的酵母， 已知马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) 等 克鲁维酵母属 (Kluyveromyces) 酵母。该克鲁维酵母属酵母能够利用木糖进行乙醇发酵， 但其收率不充分。例如， 非专利文献 1 和 2 中关于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 中的醇脱氢酶基因 ( 包含多个异构体 ) 报告了功。

9、能分析。另外， 专利文献 1 中公开了被赋 予了将木糖异构化为木酮糖的能力的重组酵母， 还记载了减少醇脱氢酶活性。 但是， 由这些 知识不能判断通过醇脱氢酶基因的缺失和 / 或破坏会对乙醇发酵能力有怎样的影响。并 且， 不能判断作为分类学上不同的种的马克斯克鲁维酵母等克鲁维酵母属酵母中的醇脱氢 酶基因的功能。 0005 现有技术文献 0006 专利文献 0007 专利文献 1 ： 日本特表 2005-514951 号公报 0008 非专利文献 0009 非专利文献 1 ： FEMS Yeast Research2,(2002)p.481-494 0010 非专利文献 2 ： FEMS Yeas。

10、t Research8,(2008)p.967-978 发明内容 0011 发明要解决的课题 0012 如上所述， 克鲁维酵母属酵母具有木糖同化性且具有耐热性， 因而被较大地期待 作为在上述的同时糖化发酵法等中有用的微生物。但是， 克鲁维酵母属酵母来自木糖的乙 说 明 书 CN 103459588 A 3 2/10 页 4 醇收率非常差， 另外也不知晓改善该收率的手段。因此， 本发明鉴于这样的事实， 目的在于 提供以提高来自木糖的乙醇收率的方式进行了改变而得的属于克鲁维酵母属的突变体酵 母、 和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法。 0013 用于解决课题的方法 0014 为了实现上述目的， 本。

11、发明者们进行了深入研究， 结果发现， 通过减弱克鲁维酵母 属酵母中的多个醇脱氢酶基因中的特定的基因， 从而该酵母中的来自木糖的乙醇收率大幅 提高， 从而完成了本发明。即， 本发明包含以下 (1) (6)。 0015 (1) 突变体酵母， 减弱了属于克鲁维酵母属的酵母中的选自来源于马克斯克鲁维 酵母的 ADH1 基因、 与该 ADH1 基因在功能上等价的基因、 来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH4 基因、 和与该 ADH4 基因在功能上等价的基因中的至少一种基因。 0016 (2) 根据 (1) 所述的突变体酵母， 其特征在于， 所述属于克鲁维酵母属的酵母是马 克斯克鲁维酵母。 0017 (3)根。

12、据(1)所述的突变体酵母， 其特征在于， 所述与ADH1基因在功能上等价的基 因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母， 并编码以下 (a) (c) 的任一 蛋白质， 0018 (a) 包含序列号 2 的氨基酸序列的蛋白质， 0019 (b) 包含相对于序列号 2 的氨基酸序列具有 90以上的序列类似性的氨基酸序 列， 并具有醇脱氢酶活性的蛋白质， 0020 (c) 包含相对于序列号 2 的氨基酸序列缺失、 替换、 添加或插入了 1 多个氨基酸 的氨基酸序列， 并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。 0021 (4)根据(1)所述的突变体酵母， 其特征在于， 所述与ADH4基因在功能上等价的基。

13、 因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母， 并编码以下 (a) (c) 的任一 蛋白质， 0022 (a) 包含序列号 4 的氨基酸序列的蛋白质， 0023 (b) 包含相对于序列号 4 的氨基酸序列具有 90以上的序列类似性的氨基酸序 列， 并具有醇脱氢酶活性的蛋白质， 0024 (c) 包含相对于序列号 4 的氨基酸序列缺失、 替换、 添加或插入了 1 多个氨基酸 的氨基酸序列， 并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。 0025 (5) 乙醇的制造方法， 其包括以下工序 ： 0026 用含木糖的培养基来培养 (1) (4) 的任一项所述的突变体酵母的培养工序， 和 0027 然后， 从培。

14、养基回收乙醇的回收工序。 0028 (6) 根据 (5) 所述的乙醇的制造方法， 其特征在于， 将所述培养工序在包含所述突 变体酵母、 含木素纤维素的生物质和糖化酶的反应体系中进行。 0029 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请 2011-076715 号的说明 书和 / 或附图所记载的内容。 0030 发明的效果 0031 本发明的突变体酵母来自葡萄糖的乙醇收率几乎不变， 来自木糖的乙醇收率大幅 提高。因此， 本发明的突变体酵母可以在包含例如来源于木质系生物质等包含木素纤维素 的生物质的木糖的培养基中高收率地制造乙醇。 说 明 书 CN 103459588 A 4 3/10 页。

15、 5 0032 本发明的乙醇的制造方法通过利用来自木糖的乙醇收率大幅提高了的突变体酵 母， 从而可以大幅提高乙醇制造效率。 附图说明 0033 图 1 是显示用含木糖的培养基培养 4 种 ADH 破坏株时的培养基中的木糖浓度变化 的特性图。 0034 图 2 是显示用含木糖的培养基培养 4 种 ADH 破坏株时的培养基中的乙醇浓度变化 的特性图。 0035 图 3 是显示用含木糖的培养基培养 4 种 ADH 破坏株时的菌体浓度变化的特性图。 0036 图 4 是显示用含葡萄糖的培养基培养 4 种 ADH 破坏株时的培养基中的木糖醇浓度 变化的特性图。 0037 图 5 是显示用含葡萄糖的培养基。

16、培养 4 种 ADH 破坏株时的培养基中的乙醇浓度变 化的特性图。 0038 图 6 是显示用含葡萄糖的培养基培养 4 种 ADH 破坏株时的菌体浓度变化的特性 图。 0039 图 7 是显示来源于酿酒酵母 (S.cerevisiae) 的 ADH1 与来源于马克斯克鲁维酵母 (K.marxianus) 的 ADH1 之间的比对 (alignment) 的图。 0040 图 8 是显示来源于酿酒酵母的 ADH1 与来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH2 之间的比 对的图。 0041 图 9 是显示来源于酿酒酵母的 ADH1 与来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH3 之间的比 对的图。 0042 图 1。

17、0 是显示来源于酿酒酵母的 ADH1 与来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH4 之间的 比对的图。 0043 图 11 是显示来源于酿酒酵母的 ADH2 与来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH1 之间的 比对的图。 0044 图 12 是显示来源于酿酒酵母的 ADH2 与来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH2 之间的 比对的图。 0045 图 13 是显示来源于酿酒酵母的 ADH2 与来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH3 之间的 比对的图。 0046 图 14 是显示来源于酿酒酵母的 ADH2 与来源于马克斯克鲁维酵母的 ADH4 之间的 比对的图。 0047 图 15 是显示来源于酿酒酵母的 ADH1 与。

18、来源于酿酒酵母的 ADH2 之间的比对的图。 具体实施方式 0048 本发明的突变体酵母具有以下特征 ： 减弱了克鲁维酵母属酵母中的特定醇脱氢酶 基因， 来自木糖的乙醇收率提高了。 0049 这里， 克鲁维酵母属酵母是包含 K.aestuarii、 K.africanus、 K.bacillisporus、 K.blattae、 多布克鲁维酵母 (K.dobzhanskii)、 湖北克鲁维酵母 (K.hubeiensis)、 乳酸 克鲁维酵母 (K.lactis)、 K.lodderae、 马克斯克鲁维酵母 (K.marxianus)、 非发酵克鲁维 说 明 书 CN 103459588 A 。

19、5 4/10 页 6 酵母 (K.nonfermentans)、 K.piceae、 中国克鲁维酵母 (K.sinensis)、 耐热克鲁维酵母 (K.thermotolerans)、 K.waltii、 威克海姆克鲁维酵母 (K.wickerhamii) 和亚罗克鲁维酵 母 (K.yarrowii) 等酵母的含义。即， 本发明的突变体酵母可以通过对这些具体的克鲁维酵 母属酵母及其突变体减弱特定的醇脱氢酶基因来制作。作为克鲁维酵母属酵母， 特别优选 使用作为耐热性酵母已知的马克斯克鲁维酵母。 作为马克斯克鲁维酵母， 不特别限定， 可以 使用在保藏机构能够分售地保存的公知株， 另外还可以使用由公。

20、知株衍生的突变株。作为 马克斯克鲁维酵母的公知株， 可列举马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株。作为由公知株衍 生的突变株， 可例示例如， 为了对马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株付与营养缺陷型而破坏 ura3 基因和 / 或 leu2 基因而得的株。 0050 本发明的突变体酵母中减弱了特定的醇脱氢酶基因。这里 “基因的减弱” 是包含 降低该基因的表达量、 降低由该基因编码的酶的活性这两方面。 例如， 通过使特定的醇脱氢 酶基因破坏或缺失的方法、 使该基因的表达控制区(启动子等)破坏或缺失的方法、 表达针 对该基因的反义 RNA 的方法等， 可以降低该基因的表达量。另外， 应用。

21、所谓转座子法、 转基 因法、 转录后基因沉默法、 RNAi 法、 无义介导的降解 (Nonsense mediated decay,NMD) 法、 核酶法、 反义法、 miRNA( 微小 RNA， micro-RNA) 法、 siRNA( 小干扰 RNA， small interfering RNA) 法等， 可以减低该基因的表达量。进而， 通过使醇脱氢酶的抑制剂作用的方法等， 可以 降低由该基因编码的酶的活性。此外， 还可以组合这些方法， 来减弱特定的醇脱氢酶基因。 0051 另外， 本发明的突变体酵母具有来自木糖的乙醇收率提高了的特征。 换言之， 本发 明的突变体酵母具有木糖代谢能力提高了。

22、的特征。这里， 木糖代谢能力是指将培养基所含 的木糖代谢而形成醇的发酵反应的效率。 因此， 木糖代谢能力的提高， 与提高该发酵反应的 反应效率成为同义。酵母的木糖代谢能力可以通过用含木糖的培养基进行培养， 对产生的 醇进行定量来评价。另外， 酵母的木糖代谢能力可以以例如培养基所含的木糖的摄入速度 ( 消耗速度 ) 为指标来评价。木糖的摄入速度可以通过经时地测定培养开始时已知浓度的 木糖的减少量来计算。 0052 减弱的醇脱氢酶基因是存在于克鲁维酵母属酵母中的多个醇脱氢酶基因中的特 定的醇脱氢酶基因。 具体地， 醇脱氢酶基因在马克斯克鲁维酵母中已知4个种类(KmADH1 KmADH4)。在马克斯。

23、克鲁维酵母中减弱的醇脱氢酶基因是它们中的 KmADH1 基因和 / 或 KmADH4基因。 在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中减弱的醇脱氢酶基因是 与 KmADH1 基因在功能上等价的 ADH 基因和 / 或与 KmADH4 基因在功能上等价的 ADH 基因。 0053 在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中， 与 KmADH1 基因在功能上 等价的 ADH 基因和与 KmADH4 基因在功能上等价的 ADH 基因可以通过现有公知的方法来鉴 定。 例如， 首先， 在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中特定多个醇脱氢酶基 因。而且， 从由这些基因编码的醇脱氢酶中， 特。

24、定具有与由 KmADH1 基因编码的醇脱氢酶的 氨基酸序列序列类似性最高的氨基酸序列的醇脱氢酶。这样特定的醇脱氢酶基因， 可以特 定为与马克斯克鲁维酵母中的 KmADH1 基因在功能上等价的基因。此外， 在特定与 KmADH4 基因在功能上等价的基因时也是同样的。这里， 序列类似性的值是指使用安装了 BLAST( 序 列局部比对查询工具， Basic Local Alignment Search Tool) 程序的计算机以默认的设定 求出的值。 0054 这里， KmADH1 基因的编码区的碱基序列和由 KmADH1 基因编码的醇脱氢酶的氨基 说 明 书 CN 103459588 A 6 5/。

25、10 页 7 酸序列分别示于序列号 1 和 2。另外， KmADH4 基因的编码区的碱基序列和由 KmADH4 基因编 码的醇脱氢酶的氨基酸序列分别示于序列号 3 和 4。 0055 此外， 存在于马克斯克鲁维酵母中的这些 KmADH1 基因和 KmADH4 基因不限于以上 的具体的碱基序列和氨基酸序列。即， KmADH1 基因和 KmADH4 基因只要编码具有醇脱氢酶 活性的蛋白质， 还包含编码含有分别相对于序列号2和4所示的氨基酸序列具有80以上、 优选为 85以上、 更优选为 90以上、 进一步优选为 95以上、 最优选为 98以上的序列 类似性的氨基酸序列的蛋白质的基因。 这里， 序列。

26、类似性的值是指使用安装了BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 程序的计算机以默认的设定求出的值。 0056 另外， KmADH1 基因和 KmADH4 基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质， 还包含编 码含有分别对序列号 2 和 4 所示的氨基酸序列缺失、 替换、 添加或插入了 1 个或多个 ( 例如 2 35 个、 优选为 2 30 个、 更优选为 2 20 个、 进一步优选为 2 10 个 ) 氨基酸的氨基 酸序列的蛋白质。 0057 进而， KmADH1 基因和 KmADH4 基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质， 则也包含 相对于分别包含序列。

27、号1和3所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸的一部分或全部 在严格条件下杂交的多核苷酸。这里， 严格条件是指具有 90左右、 优选为 95、 进一步优 选为 98的同一性的一对多核苷酸形成特异性杂交的条件 ( 温度条件、 盐浓度条件 )。 0058 乙醇制造 0059 通过利用以上所说明的突变体酵母， 可以进行以木糖等糖为底物的乙醇发酵。特 别是， 上述的本发明的突变体酵母具有优异的木糖代谢能力， 即来自木糖的乙醇收率优异， 因而适合利用了含木糖的培养基的乙醇发酵。 含木糖的培养基是克鲁维酵母属酵母能够生 长的培养基， 是指至少含有木糖作为成为乙醇合成的底物的糖成分的培养基。 此外， 含木糖。

28、 的培养基还可以含有除了木糖以外的糖成分， 例如葡萄糖。 0060 对含木糖的培养基不特别限定， 可以通过在 SD 培养基、 YPD 培养基、 YPAD 培养基、 YM 培养基和含 Yeast Nitrogen Base 的各种合成培养基中添加木糖， 或者将这些公知培养 基所含的糖成分替换成木糖来制备。 0061 另外， 还可以从木质系生物质、 草本系生物质这样的包含木素纤维素的生物质制 备含木糖的培养基。即， 将包含木素纤维素的生物质所含的纤维素、 半纤维素进行糖化处 理， 使用所得的处理物作为含木糖的培养基。 作为糖化处理不特别限定， 可以毫不限制地利 用现有公知的方法。作为糖化方法， 可。

29、列举例如， 利用稀硫酸或浓硫酸的硫酸法、 利用纤维 素酶、 半纤维素酶的酶法等。另外， 可以在糖化处理之前， 对木质系生物质、 草本系生物质 实施现有公知的前处理。 作为前处理不特别限定， 可列举例如， 将木质素用微生物分解的处 理， 木质系生物质、 草本系生物质的粉碎处理， 浸渍在离子液体、 碱溶液中缓和结构的处理， 用高温水进行蒸煮的水热处理， 利用氨的处理等。 0062 特别是， 在由马克斯克鲁维酵母制作的突变体酵母中， 耐热性特别优异， 因而可以 在例如40上、 优选为3548、 更优选为4042这样的比较高温度下进行乙醇发酵。 这样的温度区域是纤维素酶、 半纤维素酶这样的糖化酶也显示。

30、活性的温度区域。 因此， 该突 变体酵母适合利用了糖化酶的所谓同时糖化发酵。这里， 同时糖化发酵是指将利用糖化酶 的木质系生物质的糖化处理、 和来自木糖的乙醇发酵处理在同一反应体系中进行的处理。 更具体地， 将含有木质系生物质、 糖化酶和突变体酵母的溶液在例如 40这样的温度条件 说 明 书 CN 103459588 A 7 6/10 页 8 进行孵育。由此， 可以进行木质系生物质的糖化、 和来自由糖化而得的木糖、 葡萄糖的乙醇 发酵， 从而制造乙醇。另外， 此时即可以搅拌溶液， 也可以振荡溶液。 0063 另外， 在回收由培养基所含的木糖等碳源发酵生产而得的乙醇时， 不特别限定， 可 以应用。

31、现有公知的任何方法。 例如， 上述的乙醇发酵结束后， 通过固液分离操作而分离成含 乙醇的液层、 和含有突变体酵母、 固体成分的固层。然后， 将液层所含的乙醇通过蒸馏法分 离 纯化， 从而可以回收纯度高的乙醇。此外， 乙醇的纯化度可以根据乙醇的使用目的适宜 调整。 0064 实施例 0065 以下， 通过实施例更详细地说明本发明， 但本发明的技术的范围不限于以下的实 施例。 0066 实施例 1 0067 在本实施例中， 使用马克斯克鲁维酵母作为克鲁维酵母属酵母， 制作醇脱氢酶基 因的破坏株， 对来自木糖的乙醇收率进行比较研究。 0068 株的制作 0069 利用接合、 孢子形成的 ura3-l。

32、eu2- 突变株的制作 0070 使 用 作 为 马 克 斯 克 鲁 维 酵 母 DMKU3-1042 株 的 ura3- 株 的 RAK3605 株 (Nonklang,S.et al.,Appl.Environ.Microbiol.74,p.7514-7521(2008) 作为基准株。明 确了来源于马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的营养缺陷型突变株以低频率成为2倍体。 通 过紫外线突变可以获得多重营养缺陷型突变株， 其结果是在染色体 DNA 中引入突变的概率 上升。为了制作更稳定的株， 通过接合和孢子形成， 从而为了由 2 倍体简单地制作多重营养 缺陷型株而制作了以下的株。 0071。

33、 首先， 对 RAK3605 株照射紫外线照射， 获得 lys- 株 (RAK3896 株 :ura3-lys2-)、 ade- 株 (RAK3919 株 :ura3-ade2-) 和 leu- 株 (RAK3966 株 :ura3-leu2-)。 制 作 在 这 些株中将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的 URA3 随机地向染色体转化而得 的 株、 RAK4088 株 (ura3-leu2-ScURA3)、 RAK4152 株 (ura3-ade2-ScURA3)、 RAK4153 株 (ura3-lys2-ScURA3)。将 RAK4152 和 RAK415。

34、3 株在 YPD 培养基 (1%w/v 酵母提取物 ,2%w/ v 胨 ,2% 葡萄糖 ,2%w/v 琼脂 ) 上以混合的方式划线， 向 MM 培养基 (0.17%w/v yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate( 酵母氮源， 不含氨基酸， 不含 硫酸铵 ),0.5%w/v 硫酸铵 ,2%w/v 葡萄糖 ,2%w/v 琼脂 ) 复制。将在 MM 培养基中生长的 株 RAK4154 株 (ura3-/ura3-ade2-/ADE2,lys2-/LYS2ScURA3/ScURA3) 接菌到在酿酒酵母 (S.cerevisiae。

35、)中使用的SPO培养基(1%w/v醋酸钾,0.1%w/v酵母提取物,0.05%w/v葡萄 糖 ) 中使其形成孢子。 0072 为了分离制作的孢子， 获得ura-lys-ade-的3重营养缺陷型株， 向-A培养基(MM+ 尿嘧啶 , 色氨酸 , 组氨酸盐酸盐 , 蛋氨酸 , 亮氨酸 , 赖氨酸盐酸盐 ),-K 培养基 (MM+ 尿 嘧啶 , 色氨酸 , 组氨酸盐酸盐 , 蛋氨酸 , 亮氨酸 , 腺嘌呤硫酸盐 ),-U 培养基 (MM+ 色氨 酸 , 组氨酸盐酸盐 , 蛋氨酸 , 亮氨酸 , 赖氨酸盐酸盐 , 腺嘌呤硫酸盐 ) 复制， 成功地从 RAK4154 株的孢子获得了 3 株在 3 种培养。

36、基中不能增殖的株。将该株命名为 RAK4155 株 (ura3-lys2-ade2-)。通过同样的方法使 RAK4088 株与 RAK4155 株接合， 制作 RAK4156 株 (ura3-/ura3-lys2-/LYS2ade2-/ADE2leu2-/LEU2ScURA3/ScURA3)。使该株形成孢子， 制作 说 明 书 CN 103459588 A 8 7/10 页 9 RAK4174 株 (leu2-ura3-)。 0073 Ku70 破坏株的制作 0074 马克斯克鲁维酵母由于以高频率发生非同源末端结合修复， 因而不能像酿酒 酵母 (S.cerevisiae) 那样利用同源重组修复。

37、容易地进行基因破坏 (Nonklang,S.et al.,Appl.Environ.Microbiol.74,p.7514-7521(2008)。 因 此， 通 过 破 坏 非 同 源 末 端 结合修复所需的 KU70 基因来进行高频率地发生同源重组的株的制作。由 RAK4174 株 制 作 破 坏 了 KU70 的 RAK4736 株 (leu2-ura3-Kmku70:ScLEU2)(Abdel-Banat,B.M.et al.,Yeast27,29-39(2010)。 0075 ADH1 破坏株的制作 0076 马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株的 ADH1 基因中的推定开放阅读。

38、框 (open reading frame) 用 Genetyx ver.10( 株式会社 ) 预测。马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株的 ADH1 基因编码由 348 个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列信息设计 以下的一对引物。 0077 KmADH1-167-ASC ： 5 -GGGGGCACTTCGAACGCTGAAGTATCTTCATCTGGAGTATACCTTTTTTTC GCCACTGGAggcgcgcccggg-3 ( 序列号 5) 0078 KmADH1+1070c-TDHu ： 5 -TACCATATCAAAAGGGTCCTTGCTTATTTGGAAGTGTCAAC。

39、GACAATT CTACCAATGATTtggcagtattgataatgag-3 ( 序列号 6) 0079 此外， 在上述引物的碱基序列中大写字母表示ADH1的同源区。 用该引物由pST106 载体 (Ano,A.et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.73,p.633-640(2009) 合成 ScURA3， 向 RAK4736株转化。 其结果制作了RAK6148株(ura3-leu2-ku70:ScLEU2adh1:ScURA3)。 0080 ADH4 破坏株的制作 0081 马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株的 ADH4 基因中的推定开放阅读框 (o。

40、pen reading frame) 用 Genetyx ver.10( 株式会社 ) 预测。马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株的 ADH4 基因编码由 379 个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列信息设计 以下的一对引物。 0082 KmADH4-60-ASC ： 5 -CGTACACCCTCAAGCTCATCGCCCGTACACCCACATTATACTATTAATAAAC CACAAACAggcgcgcccggg-3 ( 序列号 7) 0083 KmADH4+1206c ： 5 -GAAGGATCATCCAAATGAAAAGAAAGGGACGTTAAGTTAGCATAGCTTAGT。

41、TG GACTGAGtggcagtattgataatgag-3 ( 序列号 8) 0084 此外， 在上述引物的碱基序列中大写字母表示ADH4的同源区。 用该引物由pST106 载体合成 ScURA3， 向 RAK4736 株转化。其结果制作了 RAK6150 株 (ura3-leu2-ku70:ScL EU2adh4:ScURA3)。 0085 ADH2 破坏株的制作 0086 马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株的 ADH2 基因中的推定开放阅读框 (open reading frame) 通过 Genetyx ver.10( 株式会社 ) 预测。马克斯克鲁维酵 母 DMKU3-10。

42、42 株的 ADH2 基因与 ADH1 基因同样地编码由 348 个氨基酸组成的蛋白质。利 用该碱基序列设计以下的一对引物。 0087 KmADH2-764 ： 5 -CCCACCCACCCACTGCTACA-3 ( 序列号 9) 0088 KmADH2-1c ： 5 -catttctagttgttggttgttgttt-3 ( 序列号 10) 说 明 书 CN 103459588 A 9 8/10 页 10 0089 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH2开放阅 读框 (open reading frame) 的上游部分。 0090 另外， 利用 ADH。

43、2 基因的碱基序列设计以下的一对引物。 0091 KmADH2+1045 ： 5 -GCGGACTAACTAGCCCATTAGT-3 ( 序列号 11) 0092 KmADH2-2141c ： 5 -CCCCACGCACAACGTAAACCTT-3 ( 序列号 12) 0093 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH2开放阅 读框 (open reading frame) 的下游部分。 0094 另一方面， 由酿酒酵母 (S.cerevisiae)BY4704(MATa ade2:hisGhis3200leu 20met150trp163) 按照规定方法合成。

44、 ScURA3 基因。 0095 以位于 ADH2 上游区与 ADH2 下游区之间的方式使如上所得的 ScURA3 基因融合， 向 RAK3605 株转化。其结果制作了 RAK6396 株 (ura3-adh2:ScURA3)。 0096 ADH3 破坏株的制作 0097 马克斯克鲁维酵母 DMKU3-1042 株的 ADH3 基因中的推定开放阅读框 (open reading frame)通过Genetyx ver.10(株式会社)来预测。 马克斯克鲁维酵 母 DMKU3-1042 株的 ADH3 基因编码由 375 个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列设计以 下的一对引物。 0098 Km。

45、ADH3-842 ： 5 -GGCCTGGGTTACCACTGGTCCCCTG-3 ( 序列号 13) 0099 KmADH3-1c ： 5 -tgttgcgtgatattttctgtgcctg-3 ( 序列号 14) 0100 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH3开放阅 读框 (open reading frame) 的上游部分。 0101 另外， 利用 ADH3 基因的碱基序列设计以下的一对引物。 0102 KmADH3+1076 ： 5 -TGGAACAAGGTAAGATCTTGGG-3 ( 序列号 15) 0103 KmADH3+2069c ： 。

46、5 -TTGCAGGATCCAGAATGGGTCAGTG-3 ( 序列号 16) 0104 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH3开放阅 读框 (open reading frame) 的下游部分。 0105 而且， 与上述的 ADH2 破坏株的制作步骤同样地， 使 ScURA3 以位于 ADH3 上 游区与 ADH3 下游区之间的方式融合， 向 RAK3605 株转化。其结果制作了 RAK6398 株 (ura3-adh3:ScURA3)。 0106 乙醇发酵试验 0107 对于如上制作的 ADH1 破坏株、 ADH2 破坏株、 ADH3 破坏株和 AD。

47、H4 破坏株， 进行利用 葡萄糖的乙醇发酵试验、 和利用木糖的乙醇发酵试验。 0108 前培养 0109 在加入了 YPX( 木糖 20g/L) 培养基 20ml 的 50ml 辅管中将上述破坏株接菌一铂 环， 以 30、 140 转 / 分钟振荡培养 6 8 小时。接着， 将该菌液 2.5% 在加入了 YPX 培养基 ( 木糖 :20g/L)200ml 的 500ml 三角烧瓶中以 30、 140 转 / 分钟振荡培养一夜。将培养后 的酵母离心回收， 用灭菌水洗涤 3 次， 制备 OD600=30 的酵母悬浮液。 0110 主培养 0111 在表 1 所示的条件下培养， 确认糖的利用、 菌体。

48、增殖和乙醇生产。初始的糖浓度， 葡萄糖培养为 50g/L、 木糖培养为 20g/L。 说 明 书 CN 103459588 A 10 9/10 页 11 0112 表 1. 实验条件 0113 0114 另外， 通过使用岛津制作所社制的分光光度计 UV-1800(=600) 测定菌体浓度来 评价菌体增殖。另外， 培养基中的糖、 乙醇浓度使用岛津制作所社制的 HPLC( 检测器 :RI) 来测定。 0115 结果 0116 将用含有木糖作为糖成分培养基培养上述破坏株时的 “培养基中的木糖浓度变 化” 、“培养基中的乙醇浓度变化” 、“培养基中的木糖醇浓度变化” 和 “菌体浓度变化” 示于图 1 。

49、3。如图 1 所示， 任一 ADH 破坏株与野生株相比， 木糖的利用均迟缓。特别是 ADH2 破坏 株和 ADH3 破坏株中木糖利用的迟缓显著。另外， 如图 2 所示， 在 ADH1 破坏株和 ADH4 破坏 株中， 与野生株相比， 来自木糖的乙醇收率大幅提高。但是， 在 ADH2 破坏株和 ADH3 破坏株 中， 没有发现乙醇收率的提高。另外， 如图 3 所示， 判断在 ADH1 破坏株和 ADH4 破坏株中， 具 有与野生株等同的菌体增殖能力。另一方面， 判断 ADH2 破坏株和 ADH3 破坏株与野生株相 比， 菌体增殖差。 0117 另一方面， 用含有葡萄糖作为糖成分的培养基培养上述破坏株时的 “培养基中的 葡萄糖浓度变化” 、“培养基中的乙醇浓度变化” 、“培养基中的丙三醇浓度变化” 和 “菌体浓 度变化” 示于图 4 6。如图 4 6 所示， 即使用葡萄糖培养上述破坏株， 也仅能实现与野生 型相比同程度或者较低的乙醇收率。即明确了， 对葡萄糖的摄入、 来自葡萄糖的乙醇发酵， 破坏任一 ADH 基因， 在利用葡萄糖的乙醇发酵中对乙醇生产性等没有任何影响。换言之， 显 示如果在克鲁维酵母属酵母中减弱 ADH1 基因和 ADH4 基因， 则来自木糖的乙醇收率特异性 地提高。