技术领域
本发明属于分子标记辅助选择及动物遗传育种技术领域，具体涉及一种影响猪有效总乳头数性状的分子标记及应用。
背景技术
近些年，在猪中，随着猪产仔数性状的不断遗传改良，猪产仔数性状得到快速提高。产仔数的提高甚至已经超过了母猪能够正常饲养的能力范围，然而寄养等手段治标不治本，反而增加了管理的难度。因此，猪乳头数性状的遗传改良工作刻不容缓。乳头数更多的母猪意味着可以哺乳更多的仔猪，在许多种猪场的选留种猪时，均将乳头数作为一个重要的参考指标，以此获取更多的经济效益。然而，乳头数作为中等遗传力性状，传统的选育方法仅仅单纯的对表型进行选择如人为的将乳头数量较少的个体本身进行淘汰或者尽量不选择将其同胞和半同胞留种，实际收效甚微。分子标记辅助育种成为改良这一性状的不错选择。
目前，利用候选基因法和QTL定位两种方法已经确定了不少与乳头数相关的候选基因和QTL。候选基因有松弛素基因(Relaxin Gene，RLN)、促卵泡激素β亚基(Follicle-Stimulating Hormone Beta Subunit，FSHβ)、雌激素受体(Estrogen Receptor，ESR)、淋巴增强子结合因子1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1，LEF1)等，QTL数量更是接近200个。但是，候选基因法的由于候选基因的选择具有一定的随机性，可能是主效基因，也可能是与实际QTL处于紧密连锁不平衡状态中间接对性状起作用的基因，这给家畜育种带来了部分风险，此外候选基因法的选择还具有群体异质性；而QTL定位获得的QTL遗传距离跨度很大，往往包含上百个基因，这极大地限制了QTL定位方法在家畜重要经济性状的遗传改良中的应用。如今，全基因组关联分析(Genome-wide Association Study，GWAS)已经逐步在复杂性状的遗传改良方面显示出独特的优势，如提高奶牛产奶量等。相对候选基因法和QTL定位，GWAS可以更准确的定位和识别新基因。
此外，不少研究均表明，乳头数性状与部分繁殖性状如窝产仔数、泌乳力和断乳窝重之间有中等程度的表型相关和遗传相关，乳头数性状的遗传规律改良对母猪繁殖性能和提高生产效率同样具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种影响猪有效总乳头数性状的分子标记。
本发明的另一目的在于提供上述影响猪有效总乳头数性状的分子标记的应用。
本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述影响猪有效总乳头数性状的分子标记的引物对。
本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种影响猪有效总乳头数性状的分子标记，其SNP位点对应于国际猪基因组10.2版本参考序列10号染色体上第39602384个核苷酸位点T>C突变；
所述分子标记的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M是T或C(SEQ IDNO.1序列标注位置为236的T236-C236的核苷酸突变)，导致猪有效总乳头数性状的不同；
所述的影响猪有效总乳头数性状的分子标记在鉴定猪有效乳头数性状和猪遗传育种中的应用；
利用上述分子标记筛选高有效乳头数性状的猪品种的方法，包含如下步骤：
检测猪10号染色体上上述分子标记，所述的分子标记的5’端第236位单核苷酸是C还是T，淘汰C保留T；
所述种猪优选为纯种美系杜洛克及其合成系(广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司)；
一种用于鉴定上述影响猪有效总乳头数性状的分子标记的引物对，包含引物P001-F和P002-R，其核苷酸序列如下所示：
引物P001-F：5’-AGCCACATCTGCTACCTCA-3’，
引物P002-R：5’-TTCACAGTATGGTTTCCTT-3’；
所述的的引物对在鉴定影响猪有效总乳头数性状中的应用；
所述的的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；
所述的的引物对在提高猪有效总乳头数中的应用；
一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：
确定种猪核心群中的种猪的上述的影响猪有效总乳头数状的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组10.2版本10号染色体上第39602384位点为TT和TC基因型的种猪个体，淘汰在第39602384该位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而提高后代猪的有效总乳头数；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明研究并确定影响有效总乳头数相关的分子标记，验证其对有效总乳头数性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪有效总乳头数性状遗传改良中，从而提高后代猪的有效总乳头数，进而提高仔猪的成活率，提高企业利润，增加核心竞争力。
(2)本发明提供一种鉴定上述影响猪有效总乳头数性状的分子标记的引物对，该引物对可以用于快速鉴定上述影响猪有效总乳头数性状，能够极大地增加美系杜洛克及其合成系的有效总乳头数育种进程。
(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，能够增加猪有效总乳头数性状的遗传进展，减少育种时间，从而有效提高种猪育种的经济效益，其中，通过该分子标记辅助选择，对群体内基因型为CC的猪进行淘汰，可显著提高群体的平均有效总乳头数，每头猪的有效总乳头数提高在0.31～0.64/头之间，10000头的能繁母猪每胎就能多哺乳3100～6400头仔猪，以这些仔猪直接育肥到100kg上市计算，按照80％的屠宰率估算，则一万头母猪每胎能够多提供248～512吨猪肉，这将给企业带来巨大的经济收入和效应，增加其核心竞争力。
附图说明
图1是美系杜洛克猪在10号染色体上关于有效总乳头数性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。
图2是有关杜洛克猪有效总乳头数性状主效突变位点g.236T>C不同基因型的测序结果峰图；其中(a)：基因型为TC型的测序结果峰图；(b)：基因型为TT型的测序结果峰图；(c)：基因型为CC型的测序结果峰图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)实验动物
本实施例所使用的实验猪群群体为广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种美系杜洛克1490头，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。
本实验共选取该资源群体中美系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
杜洛克猪产仔数较少，大群平均仅为9～10头，但生长快，饲料转化率高，胴体瘦肉率高，肌内脂肪含量较高，抗逆性强。国内商品猪生产已建立起较为成熟的杂交配套体系。其中杜长大的杂交组合在我国的内销和外销市场中持续保持绝对的优势地位。因此，提高杜洛克猪的有效总乳头数的研究显得尤为重要。
(2)样本收集及表型记录
收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇中置于-20℃冰箱备用，并记录仔猪有效总乳头数。
(3)猪全基因组50K SNP判型
从上述资源群体中选取的1490头杜洛克种公猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量分数为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。
DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，最终得到42642个SNP的有效基因型数据。
(4)全基因组关联(GWAS)分析
为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与有效总乳头数性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.17×10-6，即0.05/42642(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.35×10-5，即1/42642(有效SNP数量)。
GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克中，在10号染色体中存在显著影响有效总乳头数的位点，最强关联的SNP为g.236T>C(P＝1.12×10-7)。
(5)不同基因型与有效总乳头数表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的SNP位点g.236T>C与有效总乳头数性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的有效总乳头数性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体有效总乳头数，进而加快育种进程。另外根据表1还可知，CC型比TT和CT型的平均有效总乳头数低，说明纯合子CC对平均有效总乳头数是最不利的。有效总乳头数是猪繁殖性能的重要指标，有效总乳头数多说明猪的可以哺乳的仔猪多。因此，淘汰CC基因型的猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC型的种猪，保留TT和CT型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因T的频率。
表1 分子标记的SNP位点g.236T>C与有效总乳头数的相关性
6、目的DNA序列扩增及测序
(1)引物设计
通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的10号染色体上SEQ ID NO.1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。设计的引物的DNA序列如下所示：
引物P001-F：5’-AGCCACATCTGCTACCTCA-3’，
引物P002-R：5’-TTCACAGTATGGTTTCCTT-3’；
(2)PCR扩增
10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix with Loading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
(3)DNA序列测定
最后对PCR扩增后的产物进行测序，序列测定由华大科技公司完成，基因片段测序要求为双向测通。
测序结果如下所示：
注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
实施例2 分子标记的SNP位点g.236T>C效应分析
通过对分子标记辅助选择，对群体内基因型为CC的猪进行淘汰，我们显著提高了群体的平均有效总乳头数，每头猪的有效总乳头数提高在0.31～0.64/头之间，10000头的能繁母猪每胎就能多哺乳3100～6400头仔猪，以这些仔猪直接育肥到100kg上市计算，按照80％的屠宰率估算，则一万头母猪每胎能够多提供248～512吨猪肉，这将给企业带来巨大的经济收入和效应，增加其核心竞争力。
本发明通过对SEQ ID NO.1序列中的第236个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的有效总乳头数性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种影响猪有效总乳头数性状的分子标记及应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P001-F
<400> 1
agccacatct gctacctca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P002-R
<400> 2
ttcacagtat ggtttcctt 19
<210> 3
<211> 705
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 分子标记的SNP位点的核苷酸序列
<400> 3
agccacatct gctacctcat tgcagcttga ggcaacacag gatcctgaac ccaatgagca 60
aggccaggga tcgaactcat atcctcacag acactaggtt gggttcctaa tctgctgagc 120
cacaacggga actccctggc ttctaccctt tagatgtcca tagcacttgc ttccctcacc 180
ccaattatga tgaccaaatt tgtctctaga cattgtaaag tgtcttctga ctgggmtcga 240
cctcctctcc ctcagctgag aacccttgcc tttgtgattt ggattataaa gcacttatct 300
gtttatctca ctcaatagat aggtgatttc tgtacctgtg attcttcaat tttcattttc 360
aatctcaaag ttaaatttta tgatgaatat catttgttgc atattaggag tgctattgtt 420
ttttgtatta ttttctgtaa gggtttatat cattaaatta tattcatttc aaaacattca 480
agatgttatt ggattctaat ttagaaaagt cttgggaaag aaaatggtgt ggaataatgc 540
atcatctcag gaagtcactg aaagaaatat ttgttcaatg tcaactatat agcaggtact 600
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