一种检测生物素含量的方法.pdf

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种检测生物素含量的方法。本发明所述方法包括：步骤1、将AS1.299于种子培养基中培养后去除种子培养基，稀释得AS1.299菌液；步骤2、分别向体积相同的各检测培养基中添加梯度含量生物素及相同体积的AS1.299菌液定容后培养，然后根据OD620值绘制标准曲线，得出线性方程；步骤3、取待测原料和AS1.299菌液添加至步骤2所述检测培养基中定容后培养，然后检测OD620值，通过所述线性方程计算得到待测原料的生物素含量。本发明所述方法能有效消除培养基、接种量以及原料组分造成的影响，提高微生物法检测生物素含量的精确度，可广泛应用于实际生产。

1.一种检测生物素含量的方法，其特征在于，包括：步骤1、AS1.299菌株于种子培养基培养后去除种子培养基，稀释后制得AS1.299菌液，所述种子培养基包含5%的葡萄糖、0.8%的尿素、3%玉米浆、0.14%KHPO、0.06%MgSO、2μg/mL MnSO、2μg/mL FeSO；步骤2、分别向体积相同的各检测培养基中添加梯度含量生物素溶液以及相同体积的AS1.299菌液，定容后培养，然后根据OD值绘制标准曲线，得出线性方程，所述检测培养基包含5%的葡萄糖、0.8%的尿素、16mg/100mL的天冬氨酸、8mg/100mL的丝氨酸、16mg/100mL的甘氨酸、10mg/100mL的苏氨酸、10mg/100mL的丙氨酸、14mg/100mL的精氨酸、4mg/100mL的酪氨酸、7mg/100mL的缬氨酸、3mg/100mL的甲硫氨酸、10mg/100mL的苯丙氨酸、7mg/100mL的异亮氨酸、16mg/100mL的亮氨酸、19mg/100mL的赖氨酸、2mg/100mL的脯氨酸、20μg/L的Vb、0.14%KHPO、0.06%MgSO、2μg/mLMnSO和2μg/mL FeSO；步骤3、取待测原料和AS1.299菌液添加至步骤2所述检测培养基中定容后培养，然后检测OD值，通过所述线性方程计算得到待测原料的生物素含量，所述AS1.299菌液的体积、检测培养基的体积、定容的体积和培养的时间与步骤2所述AS1.299菌液的体积、检测培养基的体积、定容的体积和培养的时间一致，所述待测原料为玉米浆或糖蜜。 2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述标准曲线线性范围为0.2-1μg/L。 3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述定容为定容至100mL。 4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述培养的时间为12-14h。 

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种检测方法，具体涉及一种检测生物素含 量的方法。

背景技术

生物素，又称维生素H、辅酶R，分子式为C6H16N2O3S，是一种维持人 体自然生长和正常人体机能所必须的水溶性维生素。生物素除了作为人体正 常生长、发育及健康所必须的营养元素外，也是微生物的生长因子，是谷氨 酸发酵中至关重要的物质。在谷氨酸发酵中，生物素含量对于控制菌体转型、 产酸期转化率以及终产量均有显著影响。

目前，味精行业中主要采用生物素亚适量法发酵工艺进行谷氨酸发酵， 即调整发酵原料用量，使发酵液中生物素含量处于亚适量，从而让菌体大量 分泌积累谷氨酸。在实际生产中，确定发酵原料用量往往先要依据经验、罐 情表现从直观上分析发酵原料中生物素含量，然后再经过多罐批的摸索才能 确定。但是，这种直观分析具有很多不确定因素，无法保证生物素含量处于 亚适量范围。此外，每批次发酵原料生物素含量都不同，更换原料后都需要 重新摸索用量。即使是同一批发酵原料，由于储存条件不当也会导致生物素 含量出现波动，这给谷氨酸发酵带来了很大程度上的困难。

因此，在发酵前需要对发酵原料生物素含量进行准确检测。目前主要的 测定方法有微生物法、高效液相色谱法和异硫氰酸荧光素标记亲和素法等。 其中，高效液相色谱法和异硫氰酸荧光素标记亲和素法精度较好，但是需要 昂贵的精密仪器和试剂，样品处理过程较复杂，难以在生产上进行推广应用。 微生物法由于灵敏度高、操作简便，在生产上得到广泛应用。

微生物法是利用生物素缺陷型菌株对生物素的依赖性建立起来的生物检 测方法，可灵敏地检测出具有生物活性的生物素，这是微生物法区别于其它 方法的最大特点。微生物法的原理是在一定条件下，生物素浓度的高低与鉴 定用菌生长量呈线性关系，通过绘制标准曲线进而求得生物素含量。但是， 传统的微生物法在实际生产上具有很大误差，甚至有时会出现数量级上的误 差，原因主要是：(1)培养基中氨基氮、无机盐、微量生长因子等含量较高， 对菌体的生长有较大影响，直接对检测造成影响；(2)每次测定过程无法保 证接种量一致；(3)检测过程中，原料中的氨基氮、Vb1对检测影响较大， 导致误差较大，从而无法有效的指导生产。这些原因使微生物法不能有效指 导生产。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测生物素含量的方法，该方法有效地消除 培养基、接种量以及原料等因素造成的影响，降低误差，提高了利用微生物 检测生物素含量的精确度。

本发明所述一种检测生物素含量的方法，具体包括：

步骤1、AS1.299菌株于种子培养基培养后去除种子培养基，稀释后制得 AS1.299菌液，所述种子培养基包含5％的葡萄糖、0.8％的尿素、3％玉米浆、 0.14％K2HPO4、0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4、2μg/mL FeSO4；

步骤2、分别向体积相同的各检测培养基中添加梯度含量生物素溶液以及 相同体积的AS1.299菌液，定容后培养，然后根据OD620值绘制标准曲线，得 出线性方程，所述检测培养基包含5％的葡萄糖、0.8％的尿素、16mg/100mL 的天冬氨酸、8mg/100mL的丝氨酸、16mg/100mL的甘氨酸、10mg/100mL的 苏氨酸、10mg/100mL的丙氨酸、14mg/100mL的精氨酸、4mg/100mL的酪氨 酸、7mg/100mL的缬氨酸、3mg/100mL的甲硫氨酸、10mg/100mL的苯丙氨 酸、7mg/100mL的异亮氨酸、16mg/100mL的亮氨酸、19mg/100mL的赖氨酸、 2mg/100mL的脯氨酸、20μg/L的Vb1、0.14％K2HPO4、0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4和2μg/mL FeSO4；

步骤3、取待测原料和AS1.299菌液添加至步骤2所述检测培养基中定容 后培养，然后检测OD620值，通过所述线性方程计算得到待测原料的生物素含 量，所述AS1.299菌液的体积、检测培养基的体积、定容的体积和培养的时 间与步骤2所述AS1.299菌液的体积、检测培养基的体积、定容的体积和培 养的时间一致。

其中，所述AS1.299菌株购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，所述标准曲线线性范围为0.2-1μg/L，步骤2所述定容为定容至 100mL，步骤2所述培养的时间为12-14h。

因为葡萄糖是菌体生长所需碳源的主要来源，尿素可为菌体生长提供无 机氮源并具有调节pH值的作用，二者对菌体生长的影响要大于其他成分的影 响，故本发明对种子培养基和检测培养基的葡萄糖、尿素初始用量进行了优 化，使菌株在培养和检测过程中基本不会受到碳源与氮源基质浓度限制，同 时保证初始用量不会对菌株的生长产生明显抑制作用，从而提高了生物素线 性范围内菌株最大生长量(对应为最大OD值)，使检测过程误差相对缩小， 提高了检测的精确度。

由于氨基氮和Vb1对菌株生长具有显著影响，而本发明待测的原料为玉 米浆或糖蜜，其中均含有一定量的氨基氮和Vb1，故本发明在检测培养基中额 外添加14中氨基酸和Vb1，使氨基氮和Vb1的量超过影响菌株生长的范围， 从而消除原料中这两个因素对检测过程中的干扰。

此外，本发明在检测之前对种子培养基培养后的菌株进行三次离心洗涤， 可有效去除种子培养基成分，去除率达99.9％以上，残余的氨基氮及微量生长 因子对检测过程的影响可以忽略，由此避免种子培养基营养成分带入到检测 培养基中，对检测造成误差。

本发明在接种前还通过玻璃珠打散菌体使之混匀，保证了接种的一致性， 并且本发明每次进行样品测定均要重新绘制标准曲线，使每次标准曲线与实 际接种的菌体数量相对应。

本发明经试验发现在对数生长阶段，标准曲线的线性相关性与选取的测 定时间点没有直接关系，则不同时间点测定OD值所得生物素含量结果具有 平行性。因此，本发明通过在对数生长期设置多时间点(5点以上)进行取样， 以降低培养过程及取样测定过程产生的误差。

由以上技术方案可知，本发明能够有效地消除培养基、接种量以及原料 等因素造成的影响，降低了误差，提高了利用微生物检测生物素含量的精确 度，该方法灵敏度高、操作简便，可广泛应用于实际生产。

具体实施方式

本发明公开了一种检测生物素含量的方法，本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改 动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发 明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明 内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。

依照本发明，所述一种检测生物素含量的方法，包括：

步骤1、AS1.299菌株于种子培养基培养后去除种子培养基，稀释后制得 AS1.299菌液，所述种子培养基包含5％的葡萄糖、0.8％的尿素、3％玉米浆、 0.14％K2HPO4、0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4、2μg/mL FeSO4；

步骤2、分别向体积相同的各检测培养基中添加梯度含量生物素溶液以及 相同体积的AS1.299菌液，定容后培养，然后根据OD620值绘制标准曲线，得 出线性方程，所述检测培养基包含5％的葡萄糖、0.8％的尿素、16mg/100mL 的天冬氨酸、8mg/100mL的丝氨酸、16mg/100mL的甘氨酸、10mg/100mL的 苏氨酸、10mg/100mL的丙氨酸、14mg/100mL的精氨酸、4mg/100mL的酪氨 酸、7mg/100mL的缬氨酸、3mg/100mL的甲硫氨酸、10mg/100mL的苯丙氨 酸、7mg/100mL的异亮氨酸、16mg/100mL的亮氨酸、19mg/100mL的赖氨酸、 2mg/100mL的脯氨酸、20μg/L的Vb1、0.14％K2HPO4、0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4和2μg/mL FeSO4；

步骤3、取待测原料和AS1.299菌液添加至步骤2所述检测培养基中定容 后培养，然后检测OD620值，通过所述线性方程计算得到待测原料的生物素含 量，所述AS1.299菌液的体积、检测培养基的体积、定容的体积和培养的时 间与步骤2所述AS1.299菌液的体积、检测培养基的体积、定容的体积和培 养的时间一致。

其中，所述标准曲线线性范围为0.2-1μg/L，所述待测原料为玉米浆或糖 蜜，步骤2所述定容为定容至100mL，步骤2所述培养的时间为12-14h。

采用本发明所述方法进行检测，线性相关度在0.99以上，相对误差小于 5％，并且相同原料经异硫氰酸荧光素标记亲和素法检测所得生物素含量与本 方法所测生物素含量接近，无明显差异，表明本发明所述方法精确度较高， 所测生物素含量数据可信。

此外，本发明对玉米浆和糖蜜分别进行了生物素标准品含量回收率检测 试验，玉米浆生物素标准品平均回收率为110％，糖蜜生物素标准品平均回收 率为95％，两者均接近100％，结果进一步表明本发明所述方法准确度较高。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明所述方法中葡萄糖和尿素初始用量分析

本发明通过初糖、初尿用量与AS1.299菌株生长的单因素试验，对种子 培养基和检测培养基的葡萄糖、尿素初始用量进行了优化，试验结果参见表1。

表1初糖、初尿用量与AS1.299菌株生长的单因素试验

结果显示，葡萄糖在5％时，AS1.299菌株达到最大生长量，并在12-14h 进入稳定时期；尿素在0.8％时，AS1.299菌株达到最大生长量，并在12-14h 进入稳定时期。因此，初糖、初尿用量分别为5％和0.8％。

实施例2：本发明所述方法检测玉米浆中生物素含量

1、试验试剂及配制

尿素溶液：配制40％含量的尿素115℃灭菌3min用于配制培养基；

生理盐水：配制0.85％NaCl溶液121℃灭菌15min备用；

玉米浆溶液：玉米浆原料由梅花生物科技集团股份有限公司生产车间提 供，将玉米浆原料充分混匀后取10g，加水稀释定容至100mL灭菌后备用；

生物素母液：配制5.000mg/L的生物素溶液灭菌后备用。

种子培养基：5％的葡萄糖、0.8％的尿素、3％玉米浆、0.14％K2HPO4、 0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4、2μg/mL FeSO4。

检测培养基：5％的葡萄糖、0.8％的尿素、4％氨基酸、0.14％K2HPO4、 0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4、2μg/mL FeSO4、20μg/L的Vb1；

4％氨基酸：16mg/100mL的天冬氨酸、8mg/100mL的丝氨酸、16mg/100mL 的甘氨酸、10mg/100mL的苏氨酸、10mg/100mL的丙氨酸、14mg/100mL的 精氨酸、4mg/100mL的酪氨酸、7mg/100mL的缬氨酸、3mg/100mL的甲硫氨 酸、10mg/100mL的苯丙氨酸、7mg/100mL的异亮氨酸、16mg/100mL的亮氨 酸、19mg/100mL的赖氨酸和2mg/100mL的脯氨酸。

2、检测方法

通过无菌操作从AS1.299活化斜面培养基上挑取2环菌体于种子培养基 中，八层纱布封口，于摇床中32℃、220r/min培养10h得到种子液，根据用 量取所需种子液分装于10mL离心管(每管装7mL)中，4000rpm、10min离 心后，弃去上清后向离心管中加入5mL无菌生理盐水，震荡悬浮后再离心弃 上清，再加入5mL无菌生理盐水，震荡悬浮后再离心弃上清，加入7mL无菌 生理盐水悬浮后将各离心管内菌液合并装入一个带玻璃珠的无菌三角瓶中， 置于回转摇床220rpm、32℃打散15min后得到菌液。

将检测培养基每瓶定容分装96mL，精确取生物素母液0、4、8、12、16、 20μL分别加入到检测培养基中，通过无菌操作向每瓶检测培养基准确加入 2000μL菌液，定容至100mL，八层纱布封口，于摇床中32℃、220r/min培养 12h，检测每瓶检测培养基中OD620，绘制横坐标为生物素含量，纵坐标为Δ OD620的标准曲线，ΔOD620＝加生物素的OD620-未加生物素的OD620，并根据 标准曲线采用EXCEL中的LINEST函数计算得到斜率，采用INTERRUPT函 数计算得到截距，最后取得线性方程。

将检测培养基每瓶定容分装96mL，精确取玉米浆溶液0、500μL分别加 入到检测培养基中，通过无菌操作向每瓶检测培养基准确加入2000μL菌液， 定容至100mL，八层纱布封口，于摇床中32℃、220r/min同样培养12h，检 测每瓶检测培养基中OD620，求得ΔOD620＝加玉米浆的OD620-未玉米浆的 OD620，根据线性方程求得所测玉米浆中生物素含量。试验重复4次，取样检 测时间点为14、16、18、20h，每次重复需重新配制菌液、绘制标准曲线。

3、试验结果

由上述方法检测玉米浆中生物素含量，试验结果具体参见表2和表3。

表2各时间点取样的ΔOD620

  生物素含量   0.2μg/L   0.4μg/L   0.6μg/L   0.8μg/L   1.0μg/L   玉米浆样品   12hΔOD620   0.127   0.215   0.310   0.396   0.491   0.237   14hΔOD620   0.132   0.234   0.331   0.436   0.509   0.251   16hΔOD620   0.133   0.244   0.338   0.445   0.528   0.265   18hΔOD620   0.138   0.257   0.360   0.464   0.574   0.271   20hΔOD620   0.136   0.258   0.364   0.470   0.592   0.276

表3标准曲线的相关性及生物素含量计算结果

结果显示，玉米浆中生物素含量为887±11μg/kg，各标准曲线的相关性 均在0.99以上，相对误差为1.2％，表明本发明所述方法具有很好的线性和较 小的相对误差，具有较高精密度。

实施例3：本发明所述方法检测糖蜜中生物素含量

1、试验试剂及配制

尿素溶液：配制40％含量的尿素115℃灭菌3min用于配制培养基；

生理盐水：配制0.85％NaCl溶液121℃灭菌15min备用；

糖蜜溶液：糖蜜原料由梅花生物科技集团股份有限公司生产车间提供， 将糖蜜原料充分混匀后取10g，加水稀释定容至100mL灭菌后备用；

生物素母液：配制5.000mg/L的生物素溶液灭菌后备用。

种子培养基：5％的葡萄糖、0.8％的尿素、3％玉米浆、0.14％K2HPO4、 0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4、2μg/mL FeSO4。

检测培养基：5％的葡萄糖、0.8％的尿素、4％氨基酸、0.14％K2HPO4、 0.06％MgSO4、2μg/mL MnSO4、2μg/mL FeSO4、20μg/L的Vb1；

4％氨基酸：16mg/100mL的天冬氨酸、8mg/100mL的丝氨酸、16mg/100mL 的甘氨酸、10mg/100mL的苏氨酸、10mg/100mL的丙氨酸、14mg/100mL的 精氨酸、4mg/100mL的酪氨酸、7mg/100mL的缬氨酸、3mg/100mL的甲硫氨 酸、10mg/100mL的苯丙氨酸、7mg/100mL的异亮氨酸、16mg/100mL的亮氨 酸、19mg/100mL的赖氨酸和2mg/100mL的脯氨酸。

2、检测方法

通过无菌操作从AS1.299活化斜面培养基上挑取2环菌体于种子培养基 中，八层纱布封口，于摇床中32℃、220r/min培养10h得到种子液，根据用 量取所需种子液分装于10mL离心管(每管装7mL)中，4000rpm、10min离 心后，弃去上清后向离心管中加入5mL无菌生理盐水，震荡悬浮后再离心弃 上清，再加入5mL无菌生理盐水，震荡悬浮后再离心弃上清，加入7mL无菌 生理盐水悬浮后将各离心管内菌液合并装入一个带玻璃珠的无菌三角瓶中， 置于回转摇床220rpm、32℃打散15min后得到菌液。

将检测培养基每瓶定容分装96mL，精确取生物素母液0、4、8、12、16、 20μL分别加入到检测培养基中，通过无菌操作向每瓶检测培养基准确加入 2000μL菌液，定容至100mL，八层纱布封口，于摇床中32℃、220r/min培养 8h，检测每瓶检测培养基中OD620，绘制横坐标为生物素含量，纵坐标为Δ OD620的标准曲线，ΔOD620＝加生物素的OD620-未加生物素的OD620，并根据 标准曲线采用EXCEL中的LINEST函数计算得到斜率，采用INTERRUPT函 数计算得到截距，最后取得线性方程。

将检测培养基每瓶定容分装96mL，精确取糖蜜溶液0、250μL分别加入 到检测培养基中，通过无菌操作向每瓶检测培养基准确加入2000μL菌液，定 容至100mL，八层纱布封口，于摇床中32℃、220r/min同样培养8h，检测每 瓶检测培养基中OD620，求得ΔOD620＝加糖蜜的OD620-未糖蜜的OD620，根 据线性方程求得所测糖蜜中生物素含量。试验重复5次，取样检测时间点为 10、12、14、16、18h，每次重复需重新配制菌液、绘制标准曲线。

3、试验结果

由上述方法检测糖蜜中生物素含量，试验结果具体参见表4和表5。

表4各时间点取样的ΔOD620

  生物素含量   0.2μg/L   0.4μg/L   0.6μg/L   0.8μg/L   1.0μg/L   糖蜜样品   8hΔOD620   0.083   0.153   0.210   0.259   0.328   0.246   10hΔOD620   0.104   0.175   0.237   0.296   0.377   0.302   12hΔOD620   0.090   0.170   0.258   0.342   0.403   0.308   14hΔOD620   0.105   0.193   0.302   0.373   0.457   0.330   16hΔOD620   0.095   0.208   0.330   0.400   0.501   0.393   18hΔOD620   0.090   0.222   0.349   0.432   0.526   0.425

表5标准曲线的相关性及生物素含量计算结果

结果显示，糖蜜中生物素含量为1507±72μg/kg，各标准曲线的相关性均 在0.99以上，相对误差为5％，表明本发明所述方法具有很好的线性和较小的 相对误差，具有较高的精密度。

实施例4：本发明所述方法准确度分析

将实施例2、3中的玉米浆和糖蜜分别用异硫氰酸荧光素标记亲和素法测 定，检测结果同实施例2、3中的结果进行比较，具体参见表6。

表6本发明所述方法准确度分析

  玉米浆生物素含量(μg/kg)   糖蜜生物素含量(μg/kg)   微生物法   887   1507   异硫氰酸荧光素标记亲和素法   895   1540

结果显示，采用异硫氰酸荧光素标记亲和素法测定的结果分别为 895μg/kg和1540μg/kg，与实施例2、3所测结果接近，无明显差异，表明本 发明所述方法准确度较高。

实施例5：本发明所述方法准确度分析

为进一步体现本发明所述方法的准确度，本发明对实施例2、3每次试验 中的玉米浆和糖蜜进行生物素标准品含量回收率检测。

回收率检测方法：通过在实施例2、3每次试验中的玉米浆和糖蜜的样品 中加入一定量的生物素标准品，用加标后检测到的含量减去样品的含量即本 底量，可以得到加标量的检测值，这个检测值与加标量的比值就是回收率， 如果检测方法存在使检测结果产生偏差的因素，加标量的检测值就会受到该 因素的影响而偏高或偏低，从而以回收率的形式体现出来。具体结果参见表7 和表8。

表7玉米浆生物素标准品回收率检测结果

  平行号   本底量(μg/kg)   加标量(μg/kg)   生物素标准品含量检测值(μg/kg)   回收率   1   887   800   1703   102％   2   878   800   1782   113％   3   907   800   1771   108％   4   877   800   1765   111％   5   886   800   1814   116％   平均值   887   800   1767   110％

表8糖蜜生物素标准品回收率检测结果

  平行号   本底量(μg/kg)   加标量(μg/kg)   生物素标准品含量检测值(μg/kg)   回收率   1   1464   1500   2724   84％   2   1585   1500   3130   103％   3   1478   1500   3008   102％   4   1399   1500   2764   91％   5   1543   1500   2953   94％   6   1574   1500   3014   96％   平均值   1507   1500   2932   95％

结果显示，玉米浆生物素标准品平均回收率为110％，糖蜜生物素标准品 平均回收率为95％，两者均接近100％，进一步表明本发明所述方法准确度较 高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。