技术领域
本发明涉及一种苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）超氧化物歧化酶基因启动子融合报告基因检测系统及其在检测根瘤超氧根离子积累方面的应用。
背景技术
生物固氮是生命科学的重大问题之一。生物固氮在农业生产中发挥着重要作用，为植物特别是粮食作物提供氮素，在提高作物产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染、建立生态平衡和促进农业可持续发展等方面具有重要意义。豆科植物-根瘤菌共生固氮体系是共生伙伴通过长期协同进化形成的，对于自然界氮素的生物循环和人类的农林业生产都有十分重要的意义。它是自然界固氮效率最高的体系，是农业生产的主要氮素来源。
生物固氮是生物圈中重要的生命化学反应，几乎为所有的生物直接或间接地提供了可利用的氮源。共生固氮作用由于其高效性，是生物固氮领域的研究热点之一。根瘤菌与豆科植物之间建立的共生固氮是一个由双方相关基因共同参与、识别、协同并能随环境条件和细胞内的生理状态变化而自主调节的复杂的过程。其间还有许多作用机制尚未得到阐明。随着基因组的大规模解析以及功能基因组学、合成生物学的不断发展，极大地促进人们对根瘤菌与豆科植物之间共生机理的理解。随着新的研究方法与技术手段的运用和研究工作的深入，还将会发现更多共生固氮相关基因及其调控机制，为彻底揭开共生固氮作用的奥秘，进一步定向改造和提高根瘤菌的共生固氮效率，实现非豆科植物的共生固氮奠定基础。
活性氧簇（Reactive Oxygen Species, ROS）指一个或多个不成对的电子，它们化学性质活泼，具有高度自由能，并且会以随机方式攻击或破坏核酸、蛋白质等重要生物大分子，造成生物体的生理衰老和病理变化。生物体内常见的 ROS 有过氧化氢（H2O2），羟基阴离子（OH-），超氧阴离子（O2-）以及一氧化氮（NO）等。已有研究表明ROS是豆科植物固氮根瘤发育的重要调控因子之一，但ROS在根瘤中的分布模式还不清楚，因此，开发一种系统用以检测ROS在根瘤中的分布积累情况将有助于研究豆科植物的固氮根瘤发育机理，同时这一系统亦可应用于豆科植物根瘤的发育检测评价中。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种检测根瘤中超氧根离子的启动子报告基因。
本发明的目的之二在于提供一种含有该检测根瘤中超氧根离子的启动子报告基因的表达载体。
本发明的目的之三在于提供该载体在检测根瘤超氧根离子积累情况方面的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测根瘤中超氧根离子的启动子报告基因，其特征在于该启动子报告基因具有SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。
一种表达载体，其特征在于该载体含有上述的检测根瘤中超氧根离子的启动子报告基因。
一种上述的检测根瘤中超氧根离子的启动子报告基因在检测根瘤超氧根离子积累情况方面的应用。
本发明首次构建sodB启动子和报告基因uidA融合质粒，转入苜蓿中华根瘤菌中能够直观检测根瘤中超氧根离子的分布与强度情况。
附图说明
图1为本发明的超氧化物歧化酶基因sodB启动子融合uidA报告基因特异表达载体sodBp:uidA的构建示意图。
图2为用GUS染色法分析苜蓿根瘤中超氧根离子的积累分布模式。（A-D）为接种苜蓿中华根瘤菌Rm1021后不同阶段所结根瘤。
图3为用NBT染色法验证苜蓿根瘤中超氧根离子的积累分布模式。（A-E）为接种苜蓿中华根瘤菌Rm1021后不同阶段所结根瘤。
具体实施方法
下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed.）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一:构建sodB启动子-uidA基因融合质粒
以苜蓿中华根瘤菌DNA为模板，用分别带有限制性酶切位点PstI和BamH I的上游和下游引物,运用聚合酶链式反应（PCR）方法克隆了sodB基因的启动子序列，参见序列表SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。通过限制性内切酶酶切PCR产物和带有uidA基因的质粒pRG960，再利用T4连接酶将PCR产物与质粒连接。最后运用热激法将构建质粒转化感受态大肠杆菌DH5α。
实施例二：构建质粒转移入苜蓿中华根瘤菌
采用三亲本接合转移实验转移入突变菌株：
a. 接种根瘤菌（突变型菌株）、大肠杆菌（含构建融合质粒）以及辅助载体 MT616，分别于28 ℃和37 ℃培养至OD600为1左右；
b. 取上述菌株各 1000 µL于离心管中，8000 rpm，离心 1 min，去上清保留沉淀；
c. 1 ml 0.85%灭菌后的生理盐水悬浮沉淀一次，去除抗生素；
d. 8000 rpm，离心 1 min，去除上清保留沉淀；
e. 分别用 300 µL新鲜配制的液体 LB 培养基悬浮根瘤菌、大肠杆菌和MT616沉淀；
f. 在无抗性LB平板同一位置上分别点三种菌液各 5 µL，小心混匀以防菌液溅出。将单一菌液及两两菌液混匀点样于另一平板，作为对照；
g. 待菌液自然风干后，28 ℃倒置培养 1 d，至长出菌斑；
h. 挑取不同菌斑在相应抗性平板（链霉素、新霉素和庆大霉素）上划线，28 ℃倒置培养3-4 d 后长出单菌落。对照同时在相应抗性平板上划线；
i. 挑取抗性板上长出的克隆，重新活化，保存菌种，后续实验待用。
采用电转化转移入野生型菌株中
（1）菌株的清洗
1）接种苜蓿中华根瘤菌根瘤菌Rm1021（野生型菌株）于37℃培养至OD600为1左右。
2）取上述1 mL于离心管中，8000 rpm，离心1 min，取上清保留沉淀。
3）用1ml无菌10%甘油重悬上述沉淀，混匀，8000 rpm，离心1 min，取上清保留沉淀。
4）重复3）操作5-8次。
5）用100 µL无菌10%甘油重悬上述沉淀，混匀，冰浴保存备用。
（2）电转化
1）向清洗好的菌株细胞，加入待转化的质粒DNA，冰浴10 min；同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。
2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1 kV。特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。
3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部。
4）将电极杯推入电转化仪中，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800 μL的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5 mL的离心管中。
5）37 ℃，220～250 rpm复苏3 h。
6）在相应抗性平板（链霉素和庆大霉素）进行涂板培养。
实施例三：将转入融合质粒根瘤菌接种宿主植物紫花苜蓿
（1）紫花苜蓿种子萌发：
1）将苜蓿种子加入到无菌小三角瓶中，加入 75%乙醇轻轻摇晃三角瓶，使种
子充分与乙醇接触，处理 5 min。将乙醇全部倒出。
2）迅速向三角瓶中倒入大量的无菌水，迅速摇晃。然后将三角瓶中的水倒掉，
然后重复换水三次 ，将残留的乙醇彻底洗掉。
3）向三角瓶中加入 25%的安替福民（次氯酸钠）溶液。轻轻摇晃 15 min，然
后用水洗 3-5 次后，每隔 10 分钟换水一次，重复 5 次，以便充分出去种子
表面的次氯酸钠残留。
4）向三角瓶中加入 20 mL 的无菌水，在 28 ℃摇床上摇种子直到种子完全吸涨，
大约需要 4 h。期间每隔 30 min 换水一次。
5）将吸涨好的种子平铺在 1% 水琼脂平板上，用封口膜封住平板，然后用锡
箔纸将平板包住，放于 28 ℃倒置培养直至种子萌发。
（2）蛭石苗种植实验：
将下胚轴长至1-2 cm时的苜蓿幼苗与5 mL根瘤菌生理盐水（0.85%）重悬液混合，浸泡三十分钟。将灭菌的蛭石珍珠岩混合介质装入消毒的塑料桶中，浇上150 mL FM液体培养基。然后将浸泡的幼苗连同根瘤菌悬浊液一起播种到蛭石珍珠岩上，再用少量介质覆盖，并用保鲜膜封住塑料桶口，移至人工气候室，四到五天后揭去保鲜膜。
实施例四：表达融合基因根瘤菌侵染根瘤的表型分析
用将植物组织（根瘤）放入GUS染色液中，抽真空，每次10 min，重复三次。然后将处理好的样品放入37 ℃孵育3 h，样品染上颜色后，用不同浓度的酒精漂洗，置于清水中，压片加透明剂后在显微镜下观察。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
<110> 上海大学
<120> 检测根瘤中超氧根离子的启动子报告基因及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TCTCC TGTGG CACGG TTGGG CATCA TGCTC TCGAT AACGT AAGAT AGGAC CGCAA GGCGG 60
CGCGT CGAGA CGCTT GCGCG CGCAG GCGGA AGTCA CGAAA GCAAT GAAAG TATTT TGCGT 120
GGGTT AGCGA AATTT TGGCG CTGCA TCGGT TGCCT CCCTG CGAGG CGGTG CCTAT GTTCC 180
GCTGA CAGAT TTCCC CGACG AAATC CATGC CAAGA GGAGA TGCCA CAATG GCTTT CGAAT 240
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