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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610381694.7 (22)申请日 2016.06.01 (71)申请人 青岛科技大学 地址 266000 山东省青岛市崂山区松岭路 99号青岛科技大学 申请人 青岛市农业科学研究院 (72)发明人 李凤梅崔健祝倩倩刘素芹 宋云云江志训 (74)专利代理机构 青岛中天汇智知识产权代理 有限公司 37241 代理人 郝团代 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于砧用南瓜 “黄诚根2号” 。
2、杂交种子纯度鉴 定的SSR引物及方法 (57)摘要 本发明公开了用于砧用南瓜 “黄诚根2号” 杂 交种子纯度鉴定的SSR引物及方法。 所用SSR引物 为： 正向引物： 5 -GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3 和 反向引物： 5 -ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3 。 鉴定方法如下： 1)砧用南瓜幼苗基因组DNA的提 取； 2)以砧用南瓜基因组DNA为模板， 使用SSR引 物进行PCR扩增； 3)对扩增的产物进行聚丙烯酰 胺凝胶电泳； 4)对电泳结果进行分析， 同时具有 父本、 母本特异性条带的单株为真杂交种， 只有 母本特征带而无父本特征带的后代为假杂种或 自。
3、交种。 本发明的引物和方法可对 “黄诚根2号” 杂交种子和其母本、 父本种子进行有效、 快速区 分， 准确检测出杂交种子纯度。 本方法具有快速、 准确、 低成本、 操作简单等优点。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 105907869 A 2016.08.31 CN 105907869 A 1.用于鉴定砧用南瓜 “黄诚根2号” 杂交种子纯度的一对SSR引物NG32， 其特征在于包括 正向引物： 5 -GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3 ， 反向引物： 5 -ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3 。 2.一种用于砧用南瓜杂交种 “黄诚根2号” 种。
4、子纯度鉴定的方法， 包括如下步骤： 1)提取南瓜幼苗基因组DNA； 2)以南瓜基因组DNA为模板， 使用权利要求1的SSR引物NG32进行PCR扩增； 3)对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 4)对凝胶电泳结果进行分析， 只有同时具有父本、 母本特异性条带的单株为真正的杂 交种， 只有母本特征带而无父本特征带的后代为假杂种或自交种， 计算种子纯度。 3.根据权利要求2所述的基于SSR标记的砧用南瓜杂交后代纯度鉴定方法， 其特征在 于： 所述的PCR扩增的反应总体积为25 L： 基因组DNA1.0 l， 25mmolL-1MgCl22.5 l， 2.0mmolL-1dNTP2 l， NG32引。
5、物10 molL-1各为0.5 l， Taq酶0.2U0.1 l， 10PCR buffer2.5 l， ddH20补足至25 l； PCR扩增程序为： 94预变性5min； 94变性30s， 57退 火30s， 72延伸30s， 30个循环； 72延伸10min， 4保存。 4.根据权利要求2所述的基于SSR标记的砧用南瓜杂交种子的纯度鉴定方法， 其特征在 于： SSR引物在父本产生123bp的父本特异标记NG32123， 在母本产生89bp的母本特异标记 NG3289。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105907869 A 2 用于砧用南瓜 “黄诚根2号” 杂交种子纯度鉴定的SSR引物。
6、及 方法 技术领域： 0001 本发明属于分子检测领域， 具体涉及一种用于砧用南瓜杂交种 “黄诚根2号” 种子 纯度鉴定的引物及方法。 背景技术： 0002 种子质量的高低关系到农业生产安全， 而衡量种子质量的重要指标之一就是纯 度， 因此对种子进行纯度检测在农业生产及质量监管过程中尤为重要。 以形态学标记鉴定 品种的纯度和真伪， 耗时长、 受季节限制、 多态性差。 随着DNA分子标记技术的广泛应用， 使 得从基因组水平上鉴定纯度已成为种子纯度鉴定的重要方向。 目前常用的分子标记技术包 括AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)、 RAPD(Rando。
7、mamplified polymorphicDNA)、 SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)、 ISSR(Inter simplesequencerepeat)、 DAF(DNAamplifiedfingerprint)、 SSR(Simplesequence repeat)等。 SSR分子标记技术以其标记数量丰富、 多态性高、 呈共显性遗传、 重复性好、 易于 操作、 结果可靠等诸多优点成为快速、 稳定、 准确的纯度鉴定方法， 可以将呈父母本互补带 型的杂交种与其双亲、 甚至也可以将一些异源花粉造成的杂交种区分开。 基于上述特点， SSR标记逐。
8、步成为蔬菜作物品种鉴定的理想分子标记之一。 0003 南瓜是葫芦科南瓜属蔬菜作物， 属于雌雄同株异花植物。 在制种过程中的串粉及 收获后的机械混杂导致优良品种混杂， 此外母本去雄不彻底形成的自交种， 是导致种子遗 传纯度下降的主要原因。 同时， 随着南瓜选育品种数目的增多及育种材料遗传基础的日益 狭窄， 使得品种间的遗传差异越来越小， 导致品种真实性和纯度鉴定的难度不断加大， 因此 建立一套准确、 快速、 稳定、 不受环境因素影响的杂交种纯度鉴定技术体系是保障良种及时 销售和安全使用、 规范种子市场和促进我国种子产业参与国际竞争的迫切需要。 0004 砧用南瓜 “黄诚根2号” 是以S4236为。
9、母本， XR为父本育成的砧用南瓜一代杂交种。 “黄诚根2号” 具有与黄瓜亲和力强， 高抗枯萎病， 嫁接黄瓜增加瓜条亮度的特点， 已经在设 施黄瓜生产中大面积应用。 为了保证优良杂交品种的推广和产生最大的经济效益， 筛选出 对砧用南瓜 “黄诚根2号” 杂交种子纯度进行准确鉴定的SSR引物及方法， 以解决 “黄诚根2 号” 在制种过程中导致制种纯度不高的问题， 为种子生产经营企业提供了一个准确、 稳定、 快速、 实用的 “黄诚根2号” 杂交种子纯度鉴定的方法。 发明内容： 0005 本发明的目的在于提供用于砧用南瓜一代杂种 “黄诚根2号” 种子纯度鉴定的SSR 引物NG32和一种快速、 准确鉴定 。
10、“黄诚根2号” 种子纯度的方法。 0006 为实现上述目的， 本发明所采用的技术方案如下： 0007 一种用于砧用南瓜杂交种 “黄诚根2号” 种子纯度鉴定的SSR引物NG32， 序列如下所 示： 说明书 1/4 页 3 CN 105907869 A 3 0008 NG32-正向引物： 5 -GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3 (SEQIDNO:1), 0009 NG32-反向引物： 5 -ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3 (SEQIDNO:2)。 0010 一种用于砧用南瓜 “黄诚根2号” 杂交种子纯度鉴定的方法， 具体步骤如下： 0011 1)分别提取 “黄诚。
11、根2号” 及其父本、 母本幼苗基因组DNA； 0012 2)以上述提取的基因组DNA为模板， 使用SSR引物对NG32进行PCR扩增； 0013 3)对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 0014 4)对凝胶电泳结果进行分析， 只有同时具有父本、 母本特异性条带的单株为真正 的杂交种， 只有母本特征条带而无父本特征条带的后代为假杂种或自交种， 计算种子纯度。 0015 PCR扩增的25l反应体系为： 基因组DNA1 .0l， 25mmolL-1MgCl22.5l， 2.0mmolL-1dNTP2 l， NG32引物10 molL-1各为0.5 l， Taq酶0.2U0.1 l， 10PCR b。
12、uffer2.5 l， ddH20补足至25 l。 0016 PCR扩增的程序为： 94预变性5min后， 94变性30s， 57退火30s， 72延伸30s， 35个循环后， 72保持10min， 然后置于4保存。 0017 所述凝胶电泳为8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 银染检测。 0018 本发明的方法可将 “黄诚根2号” 杂交种子与其母本、 父本种子区分开来， 快速检测 出杂交种子的纯度。 本方法具有快速、 准确、 低成本， 操作简单等优点， 能够替代传统杂交种 子纯度鉴定的方法， 具有较高的商业应用价值。 附图说明 0019 图为南瓜 “黄诚根2号” 种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶。
13、电泳图谱(M： pBR322DNA/MspI分子量标准； 1， 2， 3， 4， 5， 6： 杂交种 “黄诚根2号” ； ， 7， 8： 父本 “XR” ； 9， 10： 母 本 “S4236” ； 具体实施方式 0020 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明， 但并不局限于此。 0021 实施例1 0022 砧用南瓜 “黄诚根2号” 杂交种子纯度检测方法的建立。 0023 1、 筛选纯度鉴定的SSR引物。 0024 从所公布的南瓜SSR引物在亲本(母本 “S4236” ， 父本 “XR” )间、 进行筛选， 选出共显 性差异标记条带的引物NG32， 序列如下所示： 0025 NG32-正。
14、向引物： 5 -GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3 (SEQIDNO:1) 0026 NG32-反向引物： 5 -ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3 (SEQIDNO:2) 0027 该标记带型清晰、 重复性好。 引物NG32能产生123bp的父本特异性标记NG32123和 89bp的母本特异性标记NG3289。 0028 2、 利用SSR引物NG32对 “黄诚根2号” 杂交种子进行纯度鉴定。 0029 (1)南瓜基因组DNA的提取 0030 实验材料为砧用南瓜 “黄诚根2号” 及其父本(XR)、 母本(S4236)子叶DNA。 0031 步骤如下： 0032 液。
15、氮在2ml的离心管内用研杵研磨， 在液氮快蒸发干时迅速加入2CTAB提取缓 说明书 2/4 页 4 CN 105907869 A 4 冲液700 l， 混匀后置于65水浴中温浴60min(每隔5min摇动一次)。 0033 静置至室温后在4下12000rpm离心10min， 将上清转移到新的2ml离心管。 0034 加入等体积的酚： 氯仿： 异戊醇(25： 24： 1)， 颠倒混匀， 静置3-5分钟， 在4下 12000rpm离心10min， 将上清液转入新的1.5ml离心管中。 0035 加2/3体积预冷的异丙醇， 缓慢混匀， 置于20下放置30min。 0036 在4下12000rpm离心。
16、10min， 弃上清， 加入200300 l预冷的70乙醇洗涤DNA 沉淀(两次)， 微干。 0037 加入30 l无菌水溶解。 0038 (2)PCR扩增： 采用25 l的PCR扩增体系 0039 0040 0041 PCR扩增程序如下： 0042 94预变性5min； 0043 94变性30s， 57退火30s， 72延伸40s， 35个循环； 0044 72延伸7min； 0045 4保存。 0046 (3)凝胶电泳 0047 取5 lPCR产物加入1 l6xloadingbuffer混匀， 取1 l上样于8的非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳， 150V稳压2.5h， 电泳结束后进行0.1Ag。
17、NO3银染20min； 银染后用2 NaOH、 0.4甲醛、 0.04Na2CO3显色， 显色后在灯箱上拍照分析。 0048 (4)扩增结果 0049 砧用南瓜 “黄诚根2号” 杂交种扩增出123bp和89bp两条带； 父本扩增出123bp的条 带； 母本扩增出89bp的条带(见图)。 0050 回收特异条带， 送上海生工公司测序。 杂交种子中123bp条带的序列如SEQIDNO: 3所示， 89bp条带的序列如SEQIDNO:4所示， 与父本、 母本扩增产物的序列相符。 说明书 3/4 页 5 CN 105907869 A 5 0051 说明书 4/4 页 6 CN 105907869 A 6 0001 序列表 1/1 页 7 CN 105907869 A 7 说明书附图 1/1 页 8 CN 105907869 A 8 。