本申请是如下申请的分案申请：申请日为2004年6月25日、申请号为 200480018260.6、发明名称为针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
技术领域
本实施例涉及新颖抗体，尤其涉及针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体， 而且尤其涉及III型缺失突变体EGFRvIII。本实施例也涉及针对表皮生长因子受体 的缺失突变体的人类单克隆抗体，而且尤其为EGFRvIII。本实施例也涉及这些抗体 的变体。本发明也提供这些抗体的诊断和治疗配方，及其免疫偶联物。
背景技术
自上世纪以来，已寻求有助于更好诊断和治疗人类和动物癌症的肿瘤特异分子。 除了那些基于病毒诱导癌症并包含由病毒基因规定的分子结构的癌症之外，在大多 数类型的人类癌症中，很难提供对基于分子结构资料的肿瘤特异物质的确切证据。 极少有关于基于新颖分子结构的肿瘤特异分子的实例。在恶性人类神经胶质瘤和其 它与表皮生长因子受体分子的放大或变化潜在相关的肿瘤(诸如乳腺癌和其它人类 癌症)的情况下，尚无关于具有独特序列的结构变化分子的明确论证。
表皮生长因子受体(EGFR)是原致癌基因c-erb B的170千道尔顿(kilodalton) 膜糖蛋白产物。已知EGFR基因的序列(Ullrich等人，1984)。“Human Epidermal Growth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A431 Epidermoid Carcinoma Cells.”Nature 309：418-425)。EGFR基因是最初 在鸟类红细胞增多症病毒中识别的erb B致癌基因的细胞同系物(Downward等人 (1984))。“Close Similarity of Epidermal Growth Factor Receptor and v-erb B Oncogene Protein Sequence.”Nature 307：521-527，Ullrich等人(1984)。已在各种人类肿瘤中观察 到这种致癌基因通过基因放大的活化(Haley等人(1987A))。“The Epidermal Growth Factor Receptor Gene in：Oncogenes，Genes，and Growth Factors”，Guroff，G编，第12 版，第2章，第40-76页，Wiley，N.Y.，且尤其为神经胶质源性的那些表皮生长因 子受体基因(Libermann等人，(1985)。“Amplification，Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin”，Nature 313：144-147；Wong等人，(1987)。“Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6899-6903；Yamazaki等人， (1988)。“Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth Factor Receptor Gene(c-erbB)in Human Brain Tumors.”Molecular and Cellular Biology 8：1816-1820，Maiden等人，(1988)。“Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme.” Cancer Research 4：2711-2714)。
已证实EGF-r在多种类型的人类固体肿瘤中过量表达。Mendelsohn Cancer Cells 7：359(1989)，Mendelsohn Cancer Biology 1：339-344(1990)，Modjtahedi and Dean Int′l J.Oncologv 4：277-296(1994)。例如，已在某些肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、 膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌中观察到EGFR过量表达。Modjtahedi and Dean Int′l J.Oncology 4：277-296(1994)。已证实表皮生长因子(EGF)和转化生长因 子-α(TGF-α)都结合至EGF-r，而且导致细胞增殖和肿瘤生长。
v-erb B致癌基因和正常EGFR基因之间的一个主要区别在于病毒致癌基因是正 常受体截断氨基的变型；它们缺少大部分细胞质外结构域，但保留了跨膜和酪氨酸 激酶结构域(Fung等人，(1984))。Activation of the Cellular Oncogene c-erb B by LTR Insertion：Molecular Basis for Induction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus. Cell 33：357-368；Yamamoto等人，(1983)。“A New Avain Erythroblastosis Virus， AEV-H Carries erbB Gene Responsible for the Induction of Both Erythroblastosis and Sarcoma.”Cell 34：225-232，Nilsen等人，(1985)。“c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis：Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor.”Cell 41：719-726；Gammett等人，(1986)。 “Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6053-6057)。这导致了不可以结合表皮生 长因子(EGF)，但仍可以磷酸化其它物质的蛋白质(Gilmore的，(1985))。“Protein Phosphorlytion at Tyrosine is Induced by the v-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro. Cell 40：609-618；Kris等人，(1985)。Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probe for the Kinase Activity of the Avian EGF Receptor and v-erB Protein.”Cell 40：619-625)，且导致以下推测：v-erb B蛋白质为致癌基因性的是因为激酶结构域未 经调节且结构上为活性的(Downward等人，1984)。
各种基因变化都可以发生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末端 中发生氨基酸的取代和缺失。然而，可获得的证据表明氨基截断对于致癌作用尤为 关键。氨基截断是所有v-erb B致癌基因的一个特征，包括由启动子的插入或逆转 录病毒转导引起的那些氨基截断(Nilsen等人，(1985))。“c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis：Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor.”Cell 41：719-726；Gammett等人， (1986)。“Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6053-6057)。
相反，羧基-末端缺失似乎只与由逆转录病毒转导引起的肿瘤有关，而且似乎决 定了宿主范围和肿瘤类型的特异性(Gammett等人，1986；Raines等人，(1985)。“c-erbB Activation in Avian Leukosis Virus-Induced Erythroblastosis：Clustered Integration Sites and the Arrangement of Provirus in the c-erbB Alleles.”Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82：2287-2291)。以氨基-截断鸟类c-erb B基因或感染性病毒致癌基因-人类EGF 受体的转染实验表明该缺失单独即足以产生转化蛋白质(Pelley等人，(1988))。 “Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but not Sarcomagenic：Characterization of a Replication-Competent Retrovirus Containing the Activated c-erbB.”Journal of Virology 62：1840-1844；Wells等人，(1988)。“Genetic Determinants of Neoplastic Transformation by the Retroviral Oncogene v-erbB.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7597-7601)。
EGFR基因的放大发生于40％的恶性人类神经胶质瘤中(Libermann等人， (1985)。“Amplification，Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin”，Nature 313：144-147； Wong等人，(1987)。“Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification.”Proc. Natl.Acad.Sci.USA 84：6899-6903)，受体基因的重排在许多具有基因放大的肿瘤中 较为明显。结构变化似乎优先影响基因的氨基末端一半(Yamazaki等人，(1985)。 “Amplification，Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin”，Nature 313：144-147；Maiden 等人，(1988)。“Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme.”Cancer Research 4：2711-2714)，但重排的性质当时并未在任何肿瘤中准确表征。
已报导在若干人类癌症中的大小变体EGFR基因和放大(Humphrey等人， (1988))。“Amplification and Expression of the，Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Glioma Xenografts”.Cancer Research 48：2231-2238；Bigner等人，(1988)J. Neuropathol.Exp.Neural.，47：191-205；Wong等人，(1987)。“Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6899-6903；和 Humphrey等人。表皮生长因子受体基因在人类神经胶质瘤异种移植中的放大和表 达，Cancer Res.48(8)：2231-8(1988))。然而，尚无关于细胞中经改变EGFR分子的 分子基的测定。1989年，Drs.Bigner和Vogelstein的著作说明已知为III型突变体 的EGF受体突变体的序列(也称为δ-EGFr或EGFRvIII)。此著作描述于美国专利 第6,455,498号、第6,127,126号、第5,981,725号、第5,814,317号、第5,710,010 号、第5,401,828号和第5,212,290号中。
EGFR变体是由基因重排伴随EGFR基因放大而引起的。存在八种主要的EGFr 变体，已知为：(i)EGFRvI缺少EGFR的大部分细胞外结构域，(ii)EGFRvII 由EGFR的细胞外结构域中的83aa框内缺失组成，(iii)EGFRvIII由EGFR的细 胞外结构域中的267aa框内缺失组成，(iv)EGFRvIV含有EGFR的细胞质结构域 中的缺失，(v)EGFRvV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失，(vi)EGFR.TDM/2-7 含有EGFR的细胞外结构域中的外显子2-7的重复，(vii)EGFR.TDM/18-25含有 EGFR的酪氨酸激酶结构域中的外显子18-26的重复，和(viii)EGFR.TDM/18-26 含有EGFR的酪氨酸激酶结构域中的外显子18-26的重复(Kuan等人，EGF突变体 受体vIII在治疗癌症中作为分子目标，Endocr Relat Cancer.8(2)：83-96(2001))。另 外，存在第二种更为罕见的具有第二种在外显子11和14之间的连接点引入新颖组 氨酸残基的缺失的EGFRvIII突变体(EGFRvIII/Δ12-13)(Kuan等人，EGF突变体 受体vIII在治疗癌症中作为分子目标，Endocr Relat Cancer.8(2)：83-96(2001))。
EGFRvIII是在人类癌症中表皮生长因子(EGF)受体最常见发生的变体(Kuan 等人，EGF突变体受体vIII在治疗癌症中作为分子靶标，Endocr Relat Cancer. 8(2)：83-96(2001))。在基因放大的过程中，在细胞外结构域中发生267个氨基酸缺 失，产生肿瘤特异单克隆抗体可指向的新颖连接点。EGF受体的这种变体以配位体 独立的方式有助于肿瘤通过组成型信号发出而发展。已知EGFrVIII未表达于任何正 常组织上(Wikstrand，CJ.等人，“Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.”Cancer Research 55(14)：3140-3148(1995)；Olapade-Olaopa，EO.等人″Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br J Cancer.82(1)：186-94(2000))。然而，EGFRvIII显示在肿瘤细胞中的显 著表达，例如，27～76％乳腺癌活组织检查表达EGFRvIII(Wikstrand，CJ.等人 ″Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.″Cancer Research 55(14)： 3140-3148(1995)；Ge H.等人，“Evidence of high incidence of EGFRvIII expression and coexpression with EGFR in human invasive breast cancer by laser capture microdissection and immunohistochemical analysis.”Int J Cancer. 98(3)：357-61(2002))，50～70％神经胶质癌表达EGFRvlII(Wikstrand，CJ.等人， “Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.”Cancer Research 55(14)：3140-3148 (1995)；Moscatello，G.等人，“Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in
multiple human tumors.”Cancer Res.55(23)：5536-9(1，995))，16％NSCL癌 症表达EGFRvIII(Garcia de Palazzo，IE.等人，“Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas.”Cancer Res. 53(14)：3217-20(1993))，75％卵巢癌表达EGFRvIII(Moscatello，G.等人，“Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors.”Cancer Res.55(23)：5536-9(1995))。
和68％前列腺癌表达EGFRvIII(Olapade-Olaopa，EO.等人，“Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.”Br J Cancer.82(1)：186-94(2000))。
缺失267个氨基酸并替换为甘氨酸产生可定靶抗体的独特连接。此外，鉴于 EGFRvIII在某些肿瘤中的表达及其在正常组织中的表达缺乏，EGFRvIII在肿瘤治 疗中可作为用于定靶药物的理想靶标。具体而言，EGFRvIII似乎可作为肿瘤免疫偶 联物治疗的理想候选物(例如，与抗肿瘤剂或毒素偶联的抗体)。另一种治疗过量 表达EGFRvIII的癌症的方法涉及使用特异性定靶至未分离正常EGFR的变体受体 的肿瘤特异性核酶。发现核酶在无胸腺裸鼠中显著抑制乳腺癌生长(Luo等人，Int. J.Cancer.104(6)：716-21(2003))。已描述用于整个EGFRvIII蛋白质的通用抗体。
见国际专利申请案第WO 01/62931号和Kuan等人，“EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy.”Endocr Relat Cancer.8(2)：83-96 (2001)；Kuan等人，“EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumor therapy.”Brain Tumor Pathol.17(2)：71-78(2000)；Kuan等人，“Increased binding affinity enhances targeting of glioma xenografts by EGFRvIII-specific scFv.”International Journal of Cancer.88(6)：962-969(2000)；Landry等人， “Antibody recognition of a conformational epitope in a peptide antigen： Fv-peptide complex of an antibody fragment specific for the mutant EGF receptor， EGFRvIII.”Journal of Molecular Biology.308(5)：883-893(2001)；Reist等人， “Astatine-211 labeling of internalizing anti-EGFRvIII monoclonal antibody using N-succinimidyl 5-[211At]astato-3-pyridinecarboxylate.”Nuclear Medicine and Biology.26(4)：405-411(1999)；Reist等人，“In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody：comparison with its murine parent.”Nuclear Medicine and Biology.24(7)：639-647(1997)；Wikstrand 等人，“Generation of anti-idiotypic reagents in the EGFRvIII tumor-associated antigen system.”Cancer Immunology，Immunotherapy.50(12)：639-652(2002)； Wikstrand等人，“Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.”Cancer Research. 55(14)：3140-3148(1995)；Wikstrand等人，“The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRvIII)：characterization and utilization as an immunotherapeutic target.”J.Neurovirol.4(2)：148-158(1998)；Wikstrand等人， “The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRvIII)： characterization and utilization as an immunotherapeutic target.”J.Neurovirol. 4(2)：148-158(1998)；Jungbluth等人，“A monoclonal antibody recognizing human cancers with amplification/overexpression of the human epidermal growth factor receptor.”Proc Natl Acad Sci USA.100(2)：639-44(2003)；Mamot等人， “Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)-targeted Immunoliposomes Mediate Specific and Efficient Drug Delivery to EGFR-and EGFRvIII-overexpressing Tumor Cells.”Cancer Research 63：3154-316l(2003))。然而，每一种上述抗体在 变化和/或恒定区内都具有或含有鼠科序列。
这些鼠科衍生蛋白质的存在可导致抗体的快速清除或可导致抵抗患者体内抗体 的免疫反应的产生。另外，即使在亲和力成熟之后，这些抗体仍具有2.2x10-8至 1.5x10-9级别的相对低的亲和力。(Kuan等人，“EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy.”，Endocr Relat Cancer.8(2)：83-96(2001))。
为避免使用鼠科或大鼠衍生抗体，研究者已将人类抗体功能引入啮齿动物以使 得啮齿动物可产生完全人类抗体，见例如Mendez等人，“Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice.” Nat Genet.15(2)：146-56(1997)。这种方法已结合针对野生型EGFR的成功抗体的产 生而使用，见例如Yang X等人，“Development of ABX-EGF，a fully human anti-EGF receptor monoclonal antibody，for cancer therapy.”Crit Rev Oncol Hemato 38(1)：17-23(2001)；Yang X-D等人，“Eradication of Established Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy”，Cancer Research 59(6)：1236-1243(1999)和美国专利第 6,235,883号。
发明内容
在一个实施例中，本发明包含特异性结合至EGFRvIII的经分离人类单克隆抗 体和包含序列L E E K K G N Y V V T D H C的肽(SEQ ID NO：56)。在另一个实 施例中，本发明包含特异性结合至于包含L EEKKGNYVVTDHC的序列(SEQ ID NO： 56)中含有的表位的经分离人类单克隆抗体，其中如由SPOTs排列中的丙氨酸扫描 所测定，结合所需的残余物选自由EEK、KKNYV、LEK、EKNY和EEKGN组成的 群组。
另外的实施例包括包含由VH3-33基因编码的重链可变区氨基酸序列的经分离 人类单克隆抗体。重链可变区氨基酸序列可包括由JH4b基因编码的氨基酸序列， 或由选自由D6-13和D3-9组成的群组的D基因编码的氨基酸序列。
其它实施例包括包含由A23(VK2)基因编码的轻链可变区氨基酸序列的经分离 人类单克隆抗体。轻链可变区氨基酸序列可包括由JK1基因编码的氨基酸序列。
其它实施例包括结合至EGFRvIII的经分离抗体或其片段，而且其包含选自由 标识为(SEQ ID)NO：138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗体13.1.2、 131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的重链氨基酸序列组 成的群组的重链氨基酸序列。抗体可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类 抗体。抗体或片段可与医药学上可接受的载剂或稀释剂缔合，而且可与治疗剂偶联。 治疗剂可为毒素。治疗剂可为诸如DM-1、AEFP、AURISTATIN E或ZAP的毒素。 所述药剂可经连接剂与抗体缔合。所述毒素可经第二抗体与抗体缔合。另外的实施 例包括产生抗体的杂交瘤细胞株和包含编码抗体基因的转型细胞。例如，所述细胞 可为中国地鼠卵巢细胞。
另外的实施例包括一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法，其 包含以有效量的抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。在一个实施例中，抗体包 含选自由抗体13.1.2(SEQ ID NO：138)、131(SEQ ID NO：2)、170(SEQ ID NO：4)、 150(SEQ ID NO：5)、095(SEQ ID NO：7)、250(SEQ ID NO：9)、139(SEQ ID NO：10)、 211(SEQ ID NO：12)、124(SEQ ID NO：13)、318(SEQ ID NO：15)、342(SEQ ID NO： 16)和333(SEQ ID NO：17)的重链氨基酸序列组成的群组的重链氨基酸序列。该方法 在活体内进行，而且在哺乳动物(诸如人类)体内进行，所述哺乳动物经受涉及上 皮细胞增殖的癌症，诸如肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母 细胞瘤或卵巢癌。
另外的实施例包括杀死靶细胞的方法。这可以通过使靶细胞和与毒素缔合的抗 体接触来达到。抗体结合至肽LEEKKGNY(SEQ ID NO：133)。在一个实施例中，抗 体对于肽具有大于1.3x10-9M的结合亲和力。在一个实施例中，毒素选自AEFP、 DM-1和ZAP。在一个实施例中，抗体毒素化合物对靶细胞的毒性是对无肽细胞毒 性的10倍多。在一个实施例中，抗体包含选自由抗体13.1.2(SEQ ID NO：138)、131 (SEQ ID NO：2)、170(SEQ ID NO：4)、150(SEQ ID NO：5)、095(SEQ ID NO：7)、 250(SEQ ID NO：9)、139(SEQ ID NO：10)、211(SEQ ID NO：12)、124(SEQ ID NO： 13)、318(SEQ ID NO：15)、342(SEQ ID NO：16)和333(SEQ ID NO：17)的重链氨基 酸序列组成的群组的重链氨基酸序列。在另一个实施例中，抗体经肽连接剂或第二 抗体与毒素缔合。
本发明另外的实施例包括结合至EGFRvIII的经分离抗体，且其包含重链氨基 酸序列，其包含以下互补决定区(CDR)：
(a)CDR1，由选自由标识为SEQ ID NO：138、2、4、5、7、9、10、12、13、 15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和333的CDR1区的氨基酸序列组成的群组的序列组成；
(b)CDR2，由选自由标识为SEQ ID NO：138、2、4、5、7、9、10、12、13、 15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和333的CDR2区的氨基酸序列组成的群组的序列组成；和
(c)CDR3，由选自由标识为SEQ ID NO：138、2、4、5、7、9、10、12、13、 15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和333的CDR3区的氨基酸序列组成的群组的序列组成。
在一个实施例中，抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人类或人源化抗体。在一个 实施例中，抗体与医药学上可接受的载剂、稀释剂和/或治疗剂缔合。在一个实施例 中，所述治疗剂为毒素。
在一个实施例中，所述毒素为DM-1或Auristatin E。
也包括结合至EGFRvIII的经分离抗体或其片段，而且其包含选自由标识为 (SEQ ID)NO：140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗体13.1.2、 131、170、150、095、250、139、211、123、318、342和333的轻链氨基酸序列组 成的群组的轻链氨基酸序列。抗体可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类 抗体。其可与医药学上可接受的载剂或稀释剂缔合，或与治疗剂(诸如毒素，例如 DM1或AURISTATIN E)偶联。
在一个实施例中，涵盖产生抗体的杂交瘤细胞株或转型细胞，该抗体包含选自 由标识为(SEQ ID)NO：140、19、20、21、29、23、25.26、26、28、33、31和32 的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、123、318、342和333的轻 链氨基酸序列组成的群组的轻链氨基酸序列。另外的实施例包括产生该抗体的杂交 瘤细胞株和包含编码抗体基因的转型细胞，诸如中国地鼠卵巢细胞。
另一个实施例包括一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法，其 包含以有效量的上述抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。该方法在活体内进行， 而且在哺乳动物(诸如人类)体内进行，所述哺乳动物经受涉及上皮细胞增殖的癌 症，诸如肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或卵巢癌。
另一个实施例包括结合至EGFRvIII的经分离抗体，且其包含轻链氨基酸序列， 其包含以下互补决定区(CDR)：
(a)CDR1，由选自由标识为SEQ ID NO：140、19、20、21、29、23、25、26、 28、33、31和32的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、 342和333的CDR1区的氨基酸序列组成的群组的序列组成；
(b)CDR2，由选自由标识为SEQ ID NO：140、19、20、21、29、23、25、26、 28、33、31和32的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、 342和333的CDR1区的氨基酸序列组成的群组的序列组成；和
(c)CDR3，由选自由标识为SEQ ID NO：140、19、20、21、29、23、25、26、 28、33、31和32的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、 342和333的CDR1区的氨基酸序列组成的群组的序列组成。
上段所识别的抗体可进一步包括重链氨基酸序列，其包含以下互补决定区 (CDR)：
(a)CDR1，由选自由标识为SEQ ID NO：138、2、4、5、7、9、10、12、13、 15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和333的CDR1区的氨基酸序列组成的群组的序列组成；
(b)CDR2，由选自由标识为SEQ ID NO：138、2、4、5、7、9、10、12、13、 15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和333的CDR2区的氨基酸序列组成的群组的序列组成；和
(c)CDR3，由选自由标识为SEQ ID NO：138、2、4、5、7、9、10、12、13、 15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和333的CDR3区的氨基酸序列组成的群组的序列组成。
另外的实施例包括一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法，其 包含以有效量上述抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。该方法在活体内进行， 而且在哺乳动物(诸如人类)体内进行，所述哺乳动物经受涉及上皮细胞增殖的癌 症，诸如肺癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌或胶质母细胞瘤。
其它实施例包括经分离的多聚核苷酸分子，其包含编码重链氨基酸序列的多聚 核苷酸序列或其片段，其选自由标识为SEQ ID NO：138、2、4、5、7、9、10、12、 13、15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、 342和333的重链氨基酸序列组成的群组，或包含编码轻链氨基酸序列的多聚核苷 酸序列或其片段，其选自由标识为SEQ ID NO：140、19、20、21、29、23、25、26、 28、33、31和33的抗体13.1.2、131、170、150、095、139、250、211、318、342 和333的轻链氨基酸序列组成的群组。
另外的实施例包括包含容器，含于其中的组合物和表明所述组合物可用于治疗 以EGFRvIII的表达为特征的癌症的包装说明书或标签的产品，其中所述组合物包 含如上文所述的抗体。所述癌症包括肺癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌或胶质母细 胞瘤。也包括用于检测哺乳动物组织或细胞中的EGFRvIII来筛选肺癌、结肠癌、 胃癌、肾癌、前列腺癌或卵巢癌的检定试剂盒，其中EGFRvIII为由上皮癌症表达 的抗原，试剂盒包含结合抗原蛋白质的抗体和用于指示抗体与抗原的反应的构件(如 果存在)。所述抗体可为经标记的单克隆抗体，或所述抗体可为未经标记的第一抗 体，且用于指示反应的构件包含为抗免疫球蛋白的经标记第二抗体。结合抗原的抗 体可由选自由萤光染料、酶、放射性核素和不透射线材料组成的群组的标记物来标 记。结合抗原的抗体也可结合至过量表达的wtEGFR。该试剂盒可供患者选择临床 使用。
另一个实施例包括特异性识别含有新颖Gly残基的EGFRvIII表位的抗体。
另一个实施例包括EGFRvIII的变体。所述变体可具有pFLAG插入物，可由SEQ ID NO：56氨基酸组成，且可存在于计算机模拟中。
另一个实施例包括结合至识别序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO：57)的抗体或 其变体。
另一个实施例包括特异性结合至EGFRvIII的抗体变体。所述抗体变体可进一 步结合至包含SEQ ID NO：57的肽。抗体变体可具有与肽中的残基EKNY或EEKGN 相互作用的残基。在一个实施例中，抗体变体结合至肽序列比其结合至野生型的 EGFR蛋白质紧10倍多。在一个实施例中，抗体变体特异性结合至EGFRvIII和SEQ ID NO：56肽。在一个实施例中，经分离的抗体或变体具有包含深腔的互补决定区， 其中所述腔由重链的CDR2和CDR3、轻链的CDR3和轻链CDR1的一小部分形成。 在一个实施例中，经分离的抗体或变体在5埃结合腔中具有残基31、37、95-101、 143-147、159、162-166、169-171、211-219、221和223。在一个实施例中，经分 离的抗体或变体具有包含浅槽的互补决定区，其中所述槽由重链CDR2和CDR3与 轻链CDR1、CDR2和CDR3形成。在一个实施例中，经分离的抗体或变体在5埃 结合沟槽中具有残基31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、160、 163-166、172和211-221。在一个实施例中，经分离的抗体或变体在5埃结合沟槽 中具有残基31-33、35、37、55、96-101、148、163、165、170、172、178、217和 218。在一个实施例中，经分离的抗体或变体具有一成型互补位，以使得当肽 EEKKGN(SEQ ID NO 127)的抗体决定基结合至抗体的互补位时，在选自由E2和 Y172、K3和H31、K4和H31、N6和D33、N6和Y37及N6和K55组成的群组的 两个残基之间形成至少一个键。在一个实施例中，经分离的抗体或变体具有一成型 互补位，以使得当肽EEKKGNY(SEQ ID NO 131)的抗体决定基结合至抗体的互补 位时，在选自由K4和Q95、K4和Q95、N6和Q98、G5和H31、Y7和H31及Y7 和W165组成的群组的两个残基之间形成至少一个键。在一个实施例中，抗体具有 一结构或与计算机模拟中测定的结构相互作用。
另一个实施例提供一种用于选择以特定结合特征结合至EGFRvIII的变体的方 法，所述方法包含使用分子结构以形成互补位，使用分子结构以形成表位，计算二 者之间的相互作用能并将所述能级与mAb变体的表位和第二互补位的能级相比较， 和基于能级差异选择变体。所述方法可进一步包括使用互补位的第二变体与表位之 间的相互作用能来测定第三相互作用能并比较第三相互作用能和第二相互作用能来 决定选择哪个变体。在一个实施例中变体形成并进行结合测试。
另一个实施例提供一种选择以特定结合特征结合至EGFRvIII的变体的方法， 所述方法检验与互补位相互作用的表位的残基，选择重要残基以形成识别序列，使 用所述序列以形成EGFRvIII变体，并使用所述EGFRvIII变体来选择mAb变体。
另一个实施例提供一种使抗体变体形成EGFRvIII的方法，所述方法包含分析 与互补位相互作用的表位的残基，选择表位的较重要残基以形成识别序列，使用所 述识别序列以形成EGFRvIII变体，并使用所述EGFRvIII变体来选择抗体变体。在 一个实施例中，在计算机模拟中达成抗体的选择。在一个实施例中，通过产生抵抗 EGFRvIII变体的抗体来达到经使用EGFRvIII变体来选择抗体。
在一个实施例中，其中经分离的抗体变体结合至EGFRvIII和SEQ ID NO：57 肽，抗体可进一步包含以下点突变：Tyr172Arg、Leu99Glu、Arg101Glu、Leu217Glu、 Leu99Asn、Leu99His、L99T、Arg101Asp或其某些组合。在一个实施例中，抗体为 单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
在一个实施例中，抗体或其变体结合至序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO：57)， 且所述抗体或变体具有次纳摩尔结合能力。
在又一个实施例中，抗体结合至EGFRvIII且抗体具有结合至表位的互补位， 且表位具有一组与包括E、K、N和Y的互补位相互作用的残基。在一个实施例中， 所述抗体为抗体131。
在又一个实施例中，抗体结合至EGFRvIII且抗体具有结合至具有一组与包含 E、E、K、G和N的互补位相互作用的残基的表位的互补位。在一个实施例中，表 位的主要结构为EEKKGNY(SEQ ID NO：131)。在一个实施例中，抗体为13.1.2。
在又一个实施例中，抗体结合至EGFRvIII且具有小于1.3x10-9M、小于1.0x10-9M或小于500pM的KD。在一个实施例中，与野生型的EGFR肽相比，抗体对于 SEQ ID NO：56具有特异性。在一个实施例中，抗体对野生型的EGFR肽(SEQ ID NO： 134)的非特异性结合低于抗体对EGFRVIII(SEQ ID NO：135)的特异性结合的10％。 在一个实施例中，抗体选自由131、139和13.1.2组成的群组。在一个实施例中， 抗体经内在化。在一个实施例中，至少约70％或至少约80％的抗体都发生内在化。
在一个实施例中，与对于野生型的EGFR蛋白质或其变体(SEQ ID NO：134)相 比，变体人类单克隆抗体优先结合至对于EGFRvIII蛋白质实质上独特的表位。
在一个实施例中，变体包含对应于典范类1的重链互补决定区(CDR1)。在 一个实施例中，变体包含对应于典范类3的重链互补决定区(CDR2)。
在一个实施例中，变体包含对应于典范类4的轻链互补决定区(CDR1)。
在一个实施例中，变体包含对应于典范类1的轻链互补决定区(CDR2)。在 一个实施例中，变体包含对应于典范类1的轻链互补决定区(CDR3)。在一个实 施例中，变体包含对应于典范类1的第一重链互补决定区(CDR1)、对应于典范 类3的第二重链互补决定区(CDR2)、对应于典范类4的第一轻链互补决定区 (CDR1)、对应于典范类1的第二轻链互补决定区(CDR2)和对应于典范类1的 第三轻链互补决定区(CDR3)，其中形成这些互补决定区以使得变体可结合至与 对于EGFR蛋白质相比，对于EGFRvIII蛋白质实质上独特的表位。在又一个实施 例中，提供一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法。
所述方法涉及以有效量的抗体或其片段处理表达EGFRvIII的细胞，其中所述 抗体或其片段结合至EGFRvIII，其中所述抗体与毒素结合，且其中所述抗体包含选 自由抗体13.1.2(SEQ ID NO：138)、131(SEQ ID NO：2)、170(SEQ ID NO：4)、150 (SEQ ID NO：5)、095(SEQ ID NO：7)、250(SEQ ID NO：9)、139(SEQ ID NO：10)、 211(SEQ ID NO：12)、124(SEQ ID NO：13)、318(SEQ ID NO：15)、342(SEQ ID NO： 16)和333(SEQ ID NO：17)的重链氨基酸序列组成的群组的重链氨基酸序列。该方法 在活体内在哺乳动物体内进行，所述哺乳动物可为人类，且可经受涉及上皮细胞增 殖的癌症，且所述癌症可包含肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶 质母细胞瘤或卵巢癌。所述毒素可为DM-1、AEFP、MMAE、AURISTATIN E或 ZAP。
在又一个实施例中，提供一种抑制表达EGFRvIII细胞的细胞增殖的方法。该 方法涉及以有效量的抗体或其片段处理表达EGFRvIII的细胞，其中所述抗体与毒 素结合，且其中所述抗体具有选自由标识为(SEQ ID)NO：19、20、21、29、23、25、 26、28、33、31和32的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、 342、333和318的轻链氨基酸序列组成的群组的轻链氨基酸序列，其中所述经分离 的多聚核苷酸分子将结合具有以SEQ ID NO：56识别的序列的肽。该方法在活体内 在哺乳动物体内进行，所述哺乳动物可为人类，且可经受涉及上皮细胞增殖的癌症， 且所述癌症可包含肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤 或卵巢癌。所述毒素可为DM-1、AEFP、MMAE、AURISTATIN E或ZAP。
附图说明
图1为野生型的EGFR和EGFRvIII之间的显示267氨基酸缺失和G替换的序 列比对。
图2为EGFRvIII PEP3 14-mer肽的设计图。在图2A中，具有氨基酸LEEKK 的EGFRvIII的N-末端序列。(SEQ ID NO：58)(1-5)与EGFR的N-末端序列相同， 继而为独特甘氨酸残基，继而为与EGFR中的残基273至280相同的氨基酸。图2B 代表EGFRvIII(6-272)中缺失的EGFR的氨基酸。
图3A-L提供本发明抗体的序列。对于每一种所提供的抗体，对于重链和轻链 可变区均提供多聚核苷酸和氨基酸序列。因此，对于每一种所列抗体提供四个序列。
图4为13.1.2抗体重链区与特定种系重链区比较的表格，“-”表示杂交瘤重链区 的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基酸残基来 表示。
图5为13.1.2抗体轻链区与特定种系轻链区比较的表格，“-”表示杂交瘤轻链区 的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基酸残基来 表示。
图6为各种杂交瘤衍生抗体重链区与特定种系重链区比较的表格，“-”表示杂交 瘤重链区的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基 酸残基来表示。
图7为各种杂交瘤衍生抗体轻链区与特定种系轻链区比较的表格，“-”表示杂交 瘤轻链区的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基 酸残基来表示。
图8为显示重组EGFRvIII mAb与表达EGFRvIII的细胞(NR6细胞)的结合的 代表图。菱形代表95，三角形代表133，正方形代表139，“x”代表150，星号代表 170，圆形代表221，直线代表230，和长方形代表250。
图9A显示对于人类抗-EGFR抗体(ABX-EGF)至H80的染色分析。
图9B显示对于抗体131至H80的FACS染色分析。
图9C显示对于抗体139至H80的FACS染色分析。
图9D显示对于抗体13.1.2至H80的FACS染色分析。
图9E显示对于ABX-EGF至H1477的FACS染色分析。
图9F显示对于抗体131至H1477的FACS染色分析。
图9G显示对于抗体139至H1477的FACS染色分析。
图9H显示对于抗体13.1.2至H1477的FACS染色分析。图9I显示对于ABX-EGF 至A549的FACS染色分析。
图9J显示对于抗体131至A549的FACS染色分析。
图9K显示对于抗体139至A549的FACS染色分析。
图9L显示对于抗体13.1.2至A549的FACS染色分析。
图9M为展示EGFRvIII mAb与胶质母细胞瘤细胞的结合的曲线图。实心三角 形代表结合至H1477的抗体131。实心正方形代表结合至H1477的抗体13.1.2。空 三角形代表结合至H80的抗体131。空正方形代表结合至H80的抗体13.1.2。
图9N为展示EGFRvIII mAb至人类表皮样癌细胞株A431的结合的曲线图。实 心正方形代表抗体13.1.2。实心三角形代表抗体131。
图9O为展示抗体13.1.2至NR6鼠科成纤维细胞细胞株的结合的曲线图。正方 形代表NR6。三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圆形代表具有EGFRvIII的NR6。
图9P为展示抗体131至鼠科成纤维细胞细胞株的结合的曲线图。正方形代表 NR6。三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圆形代表具有EGFRvIII的NR6。
图10A显示对于人类抗-EGFR抗体(ABX-EGF)结合至表达EGFR细胞(A431) 的FACS染色分析。
图10B显示对于抗体131至表达EGFR细胞(A431)的FACS染色分析。
图10C显示对于抗体139至表达EGFR细胞(A431)的FACS染色分析。
图10D显示对于抗体13.1.2至表达EGFR细胞(A431)的FACS染色分析。
图11A显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体13.1.2的活体外 毒性。
图11B显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体13.1.2的活体外 毒性。
图11C显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体13.1.2的活体外 毒性。
图11D显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体95的活体外毒性。
图11E显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体95的活体外毒性。
图11F显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体95的活体外毒性。
图11G显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体131的活体外毒 性。
图11H显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体131的活体外毒 性。
图11I显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于与 未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体131的活体外毒性。
图12A显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体139的活体外毒 性。
图12B显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体139的活体外毒 性。
图12C显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体139的活体外毒 性。
图12D显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒 性。
图12E显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒 性。
图12F显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒 性。
图12G显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体170的活体外毒 性。
图12H显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒 性。
图12I显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于与 未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒性。
图13A显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体211的活体外毒性。
图13B显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体211的活体外毒性。
图13C显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体211的活体外毒性。
图13D显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体250的活体外毒性。
图13E显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体250的活体外毒性。
图13F显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体250的活体外毒性。
图13G显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的AEFP结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体IgG1(消极对比)的活体外 毒性。
图13H显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的DM1结合相对于 与未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体IgG1(消极对比)的活体外 毒性。
图13I显示间接与表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)中的ZAP结合相对于与 未表达EGFRvIII(H80，正方形)的细胞结合的抗体IgG1(消极对比)的活体外毒 性。
图14A为条形图，其表明EGFRvIII抗体(13.1.2、131和139)当结合至AEFP 时抑制复制生成检定中H1477细胞的菌落形成。
图14B为条形图，其表明EGFRvIII抗体(13.1.2、131和139)当结合至DM1 时抑制复制生成检定中H1477细胞的群落形成。
图15A为显示抗-EGFRvIII抗体(13.1.2)与毒素(MMAE)在表达EGFRvIII 细胞(H1477，圆形)中相对于在未表达EGFRvIII(H80，正方形)中的直接偶联 物的活体外毒性的曲线图。图15B为显示抗-EGFRvIII抗体(13.1.2)与毒素(AEFP) 在表达EGFRvIII细胞(H1477，圆形)相对于在未表达GFRvIII(H80，正方形) 的细胞中的直接偶联物的活体外毒性的曲线图。
图15C为显示抗-EGFRvIII抗体(13.1.2)与毒素(DM1)在表达EGFRvIII细 胞(H1477)相对于在未表达GFRvIII(H80)的细胞中的直接偶联物的活体外毒性 的曲线图。
图16显示其中具有确定肿瘤异种移植的小鼠经抗-EGFRvIII(或dEGFR)抗体 (13.1.2)(直接结合至毒素(DM1、MMAE或AEFP))处理的活体内动物模型 的结果。实心正方形代表250微克dEGFR-DM1。实心顶角向上的三角形代表75微 克相同物质。实心顶角向下的三角形代表75微克dEGFR-MMAE。菱形代表250微 克相同物质。较浅的正方形代表75微克dEGFR-AEFP。空正方形代表250微克相 同物质。空心顶角向上的三角形代表dEGFR和自由DM1。空心顶角向上的抗体代 表PBS。所有使用的抗体为13.1.2。箭头表示前药处理。图17显示抗体131结构模 型的分子表面。六个CDR被遮蔽为不同的阴影以标记它们的边界。结合腔位于接 近中心处。图18显示抗体13.1.2分子表面的结构模型。六个CDR区域遮蔽为阴影 且由数字识别。长槽大概沿垂直中心线分布。图19A为13.1.2抗体和肽EEKKGN (SEQ ID NO：127)错合物的可能扩展模型。CDR区域遮蔽为阴影以指示边界。
图19B显示13.1.2抗体和肽EEKKGN(SEQ ID NO：127)错合物的可能扩展模型 中的氢键。如图18，CDR圈的阴影与残基相同。肽残基自图顶部的N-末端至C-末 端编号为1至6。由虚线指示六个氢键。氢键形成的六对氨基酸如下：E2...Y172、 K3...H31、K4...H31、N6...D33、N6...Y37和N6...K55。
图20为表明对于所选扩展模型之一的表位-抗体结合能与Kd的对数之间的关 联的曲线图。
图21描绘肽-13.1.2抗体错合物的精确扩展模型。肽以空格实心形式呈现。
图22描绘精确扩展模型中的氢键。
图23为描绘抗体-抗原结合能相对于相对亲和力的对数的线性拟合的曲线图。
具体实施方式
如上文所述，EGFRvIII为EGFR的缺失突变体，其中EGFr的细胞外结构域中 的267氨基酸缺失，且于连接处以甘氨酸进行单一氨基酸替换。这些特征显示于图 1中野生型EGFR与EGFRvIII之间的序列比对中。鉴于在缺失的连接处的甘氨酸的 氨基酸替换，理论上可能产生针对存在于EGFRvIII中而不存在于野生型的EGFR 中的新颖表位的抗体。因此，如图2中所示，设计用于免疫和筛选的肽，称为 PEP3(Kuan等人，EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy， Endocr Relat Cancer.8(2)：83-96(2001))。这种14-mer肽具有对于EGFRvIII和野生 型的EGFR常见的5个n-末端氨基酸，独特甘氨酸连接位点和野生型的EGFR(对 应于残基273-280)与EGFRvIII(对应于残基7-14)之间的保守序列中所含的8个 氨基酸残基。此外，胶质母细胞瘤细胞和以基因编码的EGFRvIII转染的细胞 (B300.19细胞)也可用于免疫和筛选(在本文有时称为B300.19/EGFRvIII转染子)。
为产生抵抗EGFRvIII的人类抗体，将转基因小鼠以胶质母细胞瘤 细胞/EGFRvIII、B300.19/EGFRvIII细胞和针对在与野生型的EGFR相比的EGFRvIII 中表示的新颖细胞外结构域中的连接区的肽(PEP3)的组合进行免疫。将来自经免疫 小鼠中的B细胞分离并用于产生胶质母细胞瘤，继而筛选以结合至EGFRvIII或使 用XenoMaxTM/SLAMTM技术直接用于筛选以结合至EGFRvIII(Babcook等人，A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities，Proc Natl Acad Sci USA.93(15)：7843-8 (1996)和美国专利第5,627,052号)。经识别结合至EGFRvIII的抗体经一系列检定 筛选以确定EGFRvIII的特异性识别。经过这个过程来产生、分离并表征结合至 EGFRvIII且对EGFRvIII具有特异性的人类单克隆抗体群体。随后独特表明表位定 位，但重叠了特异性。在活体外进一步评估所有抗体以评估其为了将细胞毒素药物 传递到细胞而通过细胞进行内在化的能力。表明有效传递药物的抗体与细胞毒素药 物直接结合，并检测其杀死活体外和活体内表达EGFRvIII的肿瘤细胞的能力。这 些研究为用于治疗患者癌症的抗体药物偶联物的下一次产生提供了基础，这些患者 的肿瘤隐藏有特异性基因病变。
通过上述过程产生完全人类抗-EGFRvIII抗体的群体。使用杂交瘤方式，产生 对于野生型的EGFR具有有限交叉反应性的几种抗体，包括对用于与PEP3结合的 ELISA呈阳性的抗体13.1、13.2、13.3和13.4。除了这些，选择抗体13.1(和尤其 为它的亚克隆13.1.2)以供进一步研究和发展。使用XenoMax方式，产生抗体群体， 包括抗体131、139、250和095，其对于与pep3寡核苷酸的结合具有高度特异性， 且与野生型的EGFR具有有限的交叉反应性。其中，131抗体具有最令人感兴趣的 特性。在图4-7中展示每一种抗体的序列(SEQ ID NO：1-33和141-144)。对各种 抗体的序列和结合能力进行比较并将结果展示于图4-10中。如图9A-9L和图 10A-10D中可见，与ABX-EGF相比，抗体131、139和13.1.2都表现出对于EGFRvIII 表达细胞(H1477)的较佳选择性。某些结果显示于图9M-9P中的曲线图中，其表明 简单与EGFRvIII细胞相比，至少两种抗体13.1.2和131表现出对于EGFRvIII表达 细胞的较佳选择性。此外，检测本实施例抗体的几种可能用途；其结果显示于图11-16 中。最后，基于预测的结构模型，形成抗体的变体以获得具有变化结合特征的抗体。
另外，本发明抗体对于结合至相同或类似表位的其它抗体的筛选极为有用。本 发明抗体可用于阐明其它抗体的交叉竞争研究中，预期其它抗体对于形成的抗原- 抗体错合物的特征具有相同或经改良的影响。
每一种对于EGFRvIII具有极高亲和力131抗体和13.1.2都通过细胞良好内在 化，且当结合至毒素时表现出可高效杀死细胞。令人感兴趣的是，不管是否产生于 XenoMouse小鼠的不同免疫中，且不管是否使用不同的技术，两种抗体都衍生于极 为类似的种系基因。然而，基于表位定位操作，每一种抗体似乎结合至EGFRvIII 分子上稍微不同的表位，且具有对于结合必要的EGFRvIII上稍微不同的残基。这 些结果表明使用种系基因对于定靶EGFRvIII的抗体疗法的产生尤为重要，且小变 化可通过基于这些结构发现进一步设计抗体和其它疗法来改良抗体的结合和影响。
高度需要结合至相同表位，或竞争与13.1.2和131抗体结合的抗体。如下文更 详细讨论，已通过SPOTs排列的丙氨酸扫描阐明对于特定抗体结合重要的残基。因 此，也高度需要共享重要结合残基的抗体。
定义
除非另外定义，本文所用的科学和技术术语将具有所属领域的一般技术人员通 常了解的含义。另外，除非本文另外要求，单数术语包括复数形式且复数术语包括 单数形式。一般而言，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学及蛋白质和寡 核苷酸或多聚核苷酸化学及杂交的术语及其技术是此项技术中已熟知且通常使用的 那些术语。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转型(例如，电击、 脂质转染)。根据生产者的说明或此项技术中通常实现的或如本文所述进行酶反应 和纯化技术。通常根据此项技术中熟知的常规方法和如本说明书通篇所引用和讨论 的各种通用和更详尽参考文献中所述来进行前述技术和程序。见，例如Sambrook 等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。本文所述的关于分析化学、合成 有机化学和药物及医药化学而使用的术语及其试验程序和技术在此项技术中已熟知 且通常使用。
标准技术用于化学合成，化学分析，医药制备、调配和传递以及治疗患者。
如本文所用的术语“经分离多聚核苷酸”意思是染色体组、cDNA或合成源的多 聚核苷酸或其某种组合，由于其来源，“经分离多聚核苷酸”(1)与所有或一部分其 中“经分离多聚核苷酸”在自然界中发现的多聚核苷酸无关，(2)可操作性地连接至 多聚核苷酸，在自然界中并未连接，或(3)在自然界中并未作为较大序列的部分而 发生。本文中提到的术语“经分离蛋白质”是指cDNA、重组RNA或合成源的蛋白质 或其某种组合，由于其来源或衍生源，“经分离蛋白质”(1)与自然界中发现的蛋白 质无关，(2)不含来自相同源的其它蛋白质，例如，不含鼠科蛋白质，(3)由来 自不同物种的细胞来表达，或(4)在自然界中并未发生。
术语“多肽”在本文中用作一般术语，是指多肽序列的天然蛋白质、片段或类似 物。因此，天然蛋白质、片段或类似物是多肽类物质。根据本发明的优选多肽包含 人类重链免疫球蛋白分子和人类κ轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋 白分子和轻链免疫球蛋白分子(诸如κ轻链免疫球蛋白分子或λ轻链免疫球蛋白分 子)的组合形成的抗体分子，且反之亦然，以及其片段和类似物。
如本文所用的应用于一种物体上的术语“天然发生”是指在自然界中可发现一种 物体的这个事实。例如，存在于可白天然源分离的有机体(包括病毒)中，而且未 经在实验室中人为或以其它方式有意改质的多肽或多聚核苷酸序列是天然发生的。
如本文所用的术语“可操作性连接”是指所述组分的位置处于可允许它们以其所 预期的方式发挥功能的关系中。对照序列“可操作连接”至编码序列是以在与对照序 列相容的条件下可达到表达编码序列的方式加以绑扎。
本文所用的术语“对照序列”是指对于实现多聚核苷酸序列所连接的编码序列的 表达和处理有必要的多聚核苷酸序列。这些对照序列的本质视其宿主生物体而不同， 在原核生物中，这些对照序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列； 在真核生物中，这些对照序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“对照序列”意 味着包括至少其存在对于例如先导序列和融合伙伴序列的表达和处理所必需的所有 组分，而且也包括其存在对于例如先导序列和融合伙伴序列有利的其它组分。
本文所提及的术语“多聚核苷酸”意思是长度至少为10个基的核苷酸的聚合形 式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的改质形式。术语包括DNA的 单链和双链形式。
本文提及的术语“寡核苷酸”包括天然发生的和由天然发生与非天然发生的寡核 苷酸连接子连接在一起的改质核苷酸。寡核苷酸是通常包含200个碱基或更短长度 的多聚核苷酸亚组。寡核苷酸优选长度为10到60个碱基，且最优长度为12、13、 14、15、16、17、18、19或20到40个碱基。寡核苷酸通常为单链，例如用作探针； 尽管寡核苷酸可为双链，例如用于构建基因突变体。本发明的寡核苷酸可为正义或 反义寡核苷酸。
本文提及的术语“天然发生的核苷酸包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提 及的术语“改质核苷酸”包括含有改质或取代糖基的核苷酸及其类似物。本文提及的 术语“寡核苷酸连接子”包括寡核苷酸连接子，诸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、 硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷酰胺酯及其类似物。 见，例如LaPlanche等人，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人，J.Am.Chem. Soc.106：6077(1984)；Stein等人，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等人， Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等人，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，第87-108页(F.Eckstein编，Oxford University Press，Oxford England(1991))；Stec等人，美国专利第5,151,510号；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)。如果需要，寡核苷酸可包括用于检测的标签。如本文所用的 术语“变体”为不同于所列举的多肽或多聚核苷酸的多肽、多聚核苷酸或分子，但只 是为了不对蛋白质活性造成不利改变。可存在表位的变体。可存在抗体的变体。在 优选实施例中，蛋白质变体结合至表位的能力未不利改变。在一个实施例中，蛋白 质变体可以与野生型mAb能力的10-500％结合。例如，蛋白质变体可以与野生型 mAb能力的10％、50％、110％、500％或大于500％结合。在一个实施例中，包括 在10-500％范围之间的结合能力。结合能力可通过多种方式反映，包括(但不限于) 变体对表位的ka、kd或KD。在一优选实施例中，表位是本说明书中所述的表位。
在一个实施例中，变体抗体可通过替换、缺失或添加5个或更少氨基酸而不同 于野生型的序列。这些变体通常可通过改质所揭示多肽序列之一，并使用例如本文 所述的代表性程序评估经改质多肽的结合特性来识别。在另一个实施例中，多肽变 体优选展示与经识别多肽至少约70％、更优至少约90％且最优至少约95％的同一 性。优选地，变体只在保守替换和/或改质上不同。变体蛋白质包括那些与本说明书 所述的蛋白质结构在结构上类似和功能相当的蛋白质。在另一个实施例中，如果蛋 白质与本说明书中所述蛋白质功能上相当，那么这种蛋白质可以是变体，只要变体 的互补位与本说明书中所述的互补位类似。在一个实施例中，任何具有与图17中所 述互补位类似形状的物质都是变体。在一个实施例中，任何具有与图18中所述互补 位类似形状的物质都是变体。在一个实施例中，任何具有与图19A和19B中所述相 互作用表面类似形状的物质都是变体。
在一个实施例中，如果核酸序列在严格条件下可选择性地与野生型的序列杂交， 那么抗体为变体。在一个实施例中，合适的适度严格条件包括在5xSSC溶液中预洗， 0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8:0)；在50℃-65℃下杂交，5xSSC，隔夜或如果为种 间同源物，则在45℃下，0.5xSSC；继而在65℃下以每次含有0.1％SDS的2x、0.5x 和0.2xSSC洗脱两次，历时20分钟。这些杂交DNA序列也属于本发明的范畴中， 由于编码的简并性，如核苷酸序列编码的抗体多肽也由杂交DNA序列所编码。本 文提及的术语“选择性杂交”意思是可检测地且特异性地结合。根据本发明的多多聚 核苷酸、寡核苷酸及其片段在一定杂交和洗脱条件下与核酸选择性杂交，所述杂交 与洗脱条件可以减小与非特异核酸的可检测结合的可测量。高度严谨条件可用于达 到如此项技术中已知且于本文中所讨论的选择性杂交条件。一般而言，本发明的多 多聚核苷酸、寡核苷酸和片段与令人感兴趣的核酸序列之间的核酸序列同源性至少 为80％，且更一般的为优选至少85％、90％、95％、99％和100％的增加的同源性。 如果在两种氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，那么这两种氨基酸序列即为同 系。例如，85％同源性意思是当两种序列进行最大匹配比对时，85％的氨基酸一致。 在最大化匹配中允许存在间隙(两种序列的任一种相匹配)；优选为5或更少的间 隙长度，2或更少为更优。或者或优选地，如本文所用的这个术语，如果使用含有 突变数据矩阵和6或更多间隙代价的ALIGN程序，两种蛋白质序列(或自长度为 至少30个氨基酸的蛋白质中衍生的多肽序列)具有多于5的比对分值，那么它们同 源。见Dayhoff，M.O.，in Atlas of Protein Sequence and Structure，第101-110页(第5 卷，National Biomedical Research Foundation(1972))和此卷的第2期增刊，第1-10 页。如果两种序列或其部分的氨基酸当使用ALIGN程序最佳比对时大于或等于50 ％一致，那么这两种序列或其部分更优同源。本文所用的术语“对应于”意思是多多 聚核苷酸序列与参考多聚核苷酸序列同源(即，一致，但非严格演化相关)，或多 多聚核苷酸序列与参考多聚核苷酸序列一致。对比而言，本文所用术语“互补”意思 是互补序列与参考多聚核苷酸序列的全部或一部分同源。例如，核苷酸序列 “TATAC”对应于参考序列“TATAC”且与参考序列“GTATA”互补。
以下术语用于描述两种或两种以上多聚核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系： “参考序列”、“比较窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分率”和“实质一致性”。“参 考序列”为已确定的序列，用作序列比较的基准；参考序列可为更大序列的亚组，例 如，如序列列表中给定的全长cDNA或基因序列的片段，或可包含完整cDNA或基 因序列。一般而言，参考序列长度至少为18个核苷酸或6个氨基酸，长度经常为至 少24个核苷酸或8个氨基酸，且长度通常为至少48个核苷酸或16个氨基酸。由于 两个多聚核苷酸或氨基酸序列可能每一个(1)包含在两个分子之间类似的序列(即， 完整多聚核苷酸或氨基酸序列的一部分)，和(2)可能进一步包含在两个多聚核苷 酸或氨基酸序列之间不同的序列，一般通过经“比较窗口”比较两个分子的序列以识 别和比较序列类似的局部区域来进行两个(或更多)分子之间的序列比较。如本文 所用的“比较窗口”是指至少18个邻接核苷酸位置或6个氨基酸的概念片段，其中多 聚核苷酸序列或氨基酸序列可与至少18个邻接核苷酸或6个氨基酸序列的参考序列 相比较，且其中多聚核苷酸序列在比较窗口中的位置与参考序列(其不包含添加或 缺失)相比，可包含20％或更少的添加、缺失、替换及其类似物(即，间隙)，以 供两个序列的最优序列比对。可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981) 的局部同系物算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同系 物比对算法，通过用于Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444 (1988)的类似方法的研究，通过这些算法的计算机执行过程(GAP，BESTFIT，FASTA 和Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的TFASTA，(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，Geneworks或Mac Vector软件封 装)，或通过观测来进行用于比对比较窗口的序列的最优序列比对，且选择由各种方 法产生的最佳序列比对(即，导致同系物于比较窗口上的最高百分比)。
术语“序列一致性”意思是两个多聚核苷酸或氨基酸序列于比较窗口上一致(即， 在核苷酸×核苷酸或残基×残基的基础上)。术语“序列一致性百分比”通过比较两个 在比较窗口上最优比对的序列，测定于两个序列中发生一致核酸基(例如，A、T、 C、G、U或I)或残基以产生匹配位置编号的所在位置的编号，将匹配位置的编号 除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，且将所得结果乘以100，以产生序 列一致性百分比。如本文所用的术语“实质一致性”表示多聚核苷酸或氨基酸序列的 特征，其中与至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上，经常于至少24-48 个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口上的参考序列相比，多聚核苷酸或氨基酸包 含至少85％序列一致，优选至少90％至95％序列一致，更通常至少99％序列一致 的序列，其中通过将参考序列与可能包括比较窗口上总计20％或更少参考序列的缺 失或添加的序列相比较来计算序列一致性百分比。参考序列可为更大序列的亚组。 与野生型的蛋白质或核酸实质上一致的氨基酸或核酸为野生型的蛋白质或核酸的变 体实例。
如本文所用的20种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub and D.R.Gren编，Sinauer Associates，Sunderland，Mass. (1991))。20种常规氨基酸(例如，D-氨基酸)，人造氨基酸(诸如α-氨基酸、α- 双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸)及其它非常规氨基酸的立体异构体也可以作 为用于本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基 谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝 氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸及其它 类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标 准用途和常规，左手方向为氨基末端方向，且右手方向为羧基末端方向。
类似地，除非另外指明，单链多聚核苷酸序列的左手端为5′端，双链多聚核苷 酸序列的左手端称为5′方向。初生RNA转录的5′至3′添加的方向称为转录方向，具 有与RNA相同的序列且为RNA转录的5′至5′端的DNA链上的序列区域称为“上游 序列”，具有与RNA相同的序列且为RNA转录的3′至3′端的DNA链上的序列区域 称为“下游序列”。
如应用于多肽的术语“实质一致性”意思是当两个肽序列诸如通过使用默认间隙 重量的GAP或BESTFIT程序最优比对时，两个肽序列共享至少80％的序列一致性， 优选为至少90％的序列一致性，更优为至少95％的序列一致性，且最佳为至少99 ％的序列一致性。优选地，非一致的残基位置通过保守氨基酸替换而不同。保守氨 基酸替换是指具有类似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸群组 为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸群 组为丝氨酸和苏氨酸；具有含氨化物侧链的氨基酸群组为天冬酰胺和谷酰胺；具有 芳香族侧链的氨基酸群组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸群 组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧链的氨基酸群组为半胱氨酸和甲硫氨 酸。优选的保守氨基酸替换基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、 赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷酰胺。实质上一致 的多肽可为变体。
变体蛋白质也包括具有微小变化的蛋白质。如本文所讨论，考虑到了本发明所 包含的抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小变化，只要氨基酸序列中的变 化保持在至少75％，更优至少80％、90％、95％，且最优为99％。尤其而言，也 考虑到了保守氨基酸的置换。
保守置换为那些发生于与其侧链相关的氨基酸家族中的置换。经基因编码的氨 基酸通常分为以下家族：(1)酸性-天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨 酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸和(4)不带电极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、半胱氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优的家族为：丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基家族；天 冬酰胺和谷酰胺为含氨化物家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族家 族，且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为脂肪族家族。例如，可合理预期以异亮氨酸或 缬氨酸经分离置换亮氨酸，以谷氨酸经分离置换天冬氨酸，以丝氨酸经分离置换苏 氨酸或以结构相关的氨基酸经分离置换氨基酸的类似置换将不会对所得分子的结合 或特性具有重要影响，尤其如果置换不涉及框架位点内部的氨基酸时。氨基酸变化 是否导致功能肽可易于通过检定多肽衍生物的特异性活性来测定。检定于下文中加 以详述。所属领域的一般技术人员可易于制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似 物。优选片段或类似物的氨基和羧基-末端发生于功能结构域的边缘附近。可通过将 核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或专有序列数据库相比较来识别结构和功能结 构域。优选地，使用计算机比较方法来识别发生于其它已知结构和/或功能地蛋白质 中的序列基元或预测蛋白质构型结构域。已知用于识别折叠为已知的三维结构的蛋 白质序列的方法。Bowie等人，Science 253：164(1991)。因此，前述实例表明，所属 领域的技术人员可识别可用于根据本发明的抗体界定结构和功能结构域的序列基元 和结构构型。
优选氨基酸替换为以下替换：(1)减少对蛋白水解作用的敏感性，(2)减少 对氧化作用的敏感性，(3)改变供形成蛋白质错合物的结合亲和力，(4)改变结 合亲和力且(5)授予或改质这些类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括 除天然发生的肽序列之外的序列的各种突变蛋白质。例如，可在天然发生的序列(优 选为形成分子间接触的结构域外部的多肽部分)中进行单一或多重氨基酸替换(优 选为保守氨基酸替换)。保守重氨基酸替换不应实质上改变亲本序列的结构特征(例 如，置换氨基酸不应破坏发生于亲本序列中的螺旋体，或干扰表征亲本序列的二级 结构的其它类型)。在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton编， W.H.Freeman and Company，New York(1984))、Introduction to Protein Structure(C. Branden和J.Tooze编，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))和Thornton等人， Nature 354：105(1991)中描述此项技术识别的多肽二级和三级结构的实例。
如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失的多肽， 但其中残留的氨基酸序列与自(例如)全长cDNA序列引出的天然发生的序列中的 对应位置一致。片段一般为至少5、6、8或10个氨基酸长，优选为14个氨基酸长， 更优为至少20个氨基酸长，通常为至少50个氨基酸长，且甚至更优为至少70个氨 基酸长。如本文所用的术语“类似物”是指包含与引出的氨基酸序列的一部分实质上 一致的至少25个氨基酸片段的多肽。类似物一般为至少20个氨基酸长，优选为至 少50个氨基酸长且可经常长至全长的天然发生多肽。片段和类似物都是变体形式。
肽类似物通常以类似于模板肽的特性而作为非肽药物用于医药工业中。这些类 型的非肽化合物称为“肽的模拟物”和“肽模拟物”，Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29 (1986)；Veber and Freidinger TINS，第392页(1985)和Evans等人，J.Med.Chetn. 30：1229(1987)。通常借助于计算机分子模型来研发这些化合物。结构类似于治疗用 肽的肽模拟物可用于产生相当的治疗或预防效果。一般而言，肽模拟物在结构上与 样式多肽类似(即，具有生物化学特性或药理学活性的多肽)，诸如人类抗体，但 其中一个或一个以上肽连接子通过此项技术中熟知的方法视情况由选自由 -CH2NH--、--CH2S--、-CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、 --CH(OH)CH2--和-CH2SO--组成的群组的连接子所置换。以相同类型的D-氨基酸系 统替换一个或一个以上统一序列的氨基酸(例如，以D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可用 于产生更稳定的肽。此外，可由此项技术中已知的方法产生包含统一序列或实质上 一致的统一序列变化的限定肽(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387 (1992))；例如，通过添加可形成环化肽的分子内双硫桥的内部半胱氨酸残基。肽 的模拟物和肽模拟物都是变体形式。
“抗体”或“抗体肽”是指完整抗体或其与供特异性结合的完整抗体竞争的结合片 段。通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶分解或化学分解来产生结合片段。结 合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链抗体。除“双特异性”或“双功能”抗体之外 的抗体应理解为其每一个结合位点一致。当过量抗体将结合至反受体的受体量减少 至少约20％、40％、60％或80％，且更通常大于约85％(如由活体外竞争性结合 检定所测量)时，抗体实质上抑制受体粘合至反受体。术语“表位”包括任何可特异 性结合至免疫球蛋白或T-细胞受体或否则与分子相互作用的蛋白质决定簇。表位簇 通常由诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链分子的化学活性表面群组组成，且通常具 有特异性三维结构特征以及特异性电荷特征。表位可为“线性”或“构型”。在线性表 位中，蛋白质与相互作用的分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一 级氨基酸序列线性发生。在构型表位，相互作用点于彼此分离的蛋白质上的氨基酸 上交叉发生。据说当解离常数≤1μM，优选≤100nM且更优≤10nM，且甚至更优≤ 1nM时，抗体特异性结合抗原。一旦确定抗原上需要的表位，就可能例如使用本发 明所述技术产生对于那个表位的抗体。或者，在发现过程中，抗体的产生和特征可 阐明所需表位的信息。基于这些信息，随后可能竞争性地筛选用于结合至相同表位 的抗体。一种达到此目的的方式是进行寻找彼此竞争性结合的抗体(例如，竞争结 合至抗原的抗体)的交叉竞争研究。一种基于其交叉竞争的用于“结合”抗体的高产 量处理描述于国际专利申请案第WO 03/48731号。如由所属领域的技术人员所了解 的，抗体可特异性结合至的任何特定物质都可以是表位。表位可包含抗体结合至的 那些残基。在一个实施例中，表位为EGFRvIII表位。在一更优实施例中，表位为 本说明书实例4中所述的表位。在一个实施例中，表位为实例14中所述的表位。在 一个实施例中，表位包含序列LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO：59)。在一个实施例 中，表位包含序列EEKKGNYWT(SEQ ID NO：57)。在一个实施例中，表位包含序 列EKNY(SEQ ID NO：60)。在一个实施例中，表位包含序列EEKGN(SEQ ID NO： 61)。所属领域的技术人员将了解到这些实际上不必在单肽上以此顺序组合，而这些 是形成与互补位相互作用的表位的残基。如所属领域的技术人员所将了解的，由产 生分子形状的残基或侧链占据的空间有助于测定表位为何。同样，与表位相关的任 何官能基、范德华相互作用、侧链的移动度等都可测定表位实际上为何。因此，表 位也可以包括能量互动。
术语“互补位”意味着描述测定对于表位的结合的结合区的通用结构。这个结构 影响结合区是否结合至表位及其结合的方式。互补位可指负责抗体或其片段结合至 表位簇的抗体的抗原位点。互补位也指抗体的独特位，和结合至表位的互补决定区 (CDR)。在一个实施例中，互补位是图17中的L1 10、L2 30、L3 50、H1 20、 H2 40和H3 60的抗体区。在一个实施例中，互补位是包含实例16中用于L1、L2、 L3、H1、H2和H3的CDR序列的抗体区。在一个实施例中，互补位是图18中的 L1，110、L2，130、L3，150、H1 120、H2 140和H3 160的抗体区。在一个实施例中， 互补位是包含实例18中用于L1、L2、L3、H1、H2和H3的CDR序列的抗体区。 在一个实施例中，互补位包含实例18中所列的序列。在一个实施例中，互补位包含 与表位相互作用的残基，如图19A和图19B中所示。实体黑色结构为肽结构。在一 个实施例中，互补位包含13.1.2mAb的残基Tyr172Arg。在一个实施例中，13.1.2mAb 的互补位包含选自由以下各残基组成的群组的至少一个残基：Tyr 172Arg、 Arg101Glu、Leu99Asn、Leu99His、Arg101Asp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、 Arg101Gln和Asn35Gly。如所属领域的技术人员所将了解的，任何抗体的互补位或 其变体都可由本申请案所陈述的方式来测定。如果残基预测可贡献10％的结合能， 就认为残基“重要”。在一个实施例中，如果残基预测可贡献2％的结合能，就认为 残基“重要”。在一个实施例中，如果残基预测可贡献50％的结合能，就认为残基“重 要”。在一个实施例中，如果残基预测与表位表面或互补位表面相互作用，就认为残 基“重要”。在一个实施例中，如果改变残基导致结合损失，就认为残基“重要”。
术语“特异性”或“优先”结合至，或类似措辞并不意味着表示抗体只可结合至那 个表位。相反，意思是抗体或其变体可结合至那个表位，其程度比抗体结合至抗体 所暴露的至少一种其它物质的程度更高。在一个实施例中，特异性结合抗体将以比 其至EGFR蛋白质更大的亲和力结合至EGFRvIII蛋白质(更紧，或较低的KD)。 例如，特异性结合抗体的结合将更紧至少增加1％、1-2％、2-5％、5-10％、10-20 ％、20-30％、30-50％、50-70％、70-90％、90-120％、120-150％、150-200％、200-300 ％、300-500％、500-1000％或更多。
氨基酸，编号，氨基酸的缩写形式，例如Leu217Gln表示编号氨基酸从第一种 氨基酸到第二种氨基酸的突变。因此，Tyr172Arg意思是当野生型的蛋白质具有172 位置的酪氨酸时，突变具有172位置的精氨酸。
本文所用的术语“药剂”表示化合物、化合物的混合物、生物高分子或从生物物 质形成的萃取物。
本文所用的“哺乳动物”指认为是哺乳动物的任何动物。哺乳动物优选人类。
含有酶(木瓜蛋白酶)的抗体的消化导致两种一致的抗原结合片段，也称为“Fab” 片段和“Fc”片段，其不具有抗原结合活性，但具有结晶能力。含有酶(胃蛋白酶) 的抗体的消化导致F(ab′)2片段，其中抗体分子的两臂保持连接，且包含两个抗原结 合位点。F(ab′)2片段具有交联抗原的能力。
本文所用的“Fv”指保持抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。这些片段 也可认为是抗体的变体。
本文所用的“Fab”指包含轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域的抗体片段。
术语“mAb”指单克隆抗体。
对于XenoMax方法产生的抗体序列的描述编码如下：“AB”-指抗体， “EGFRvIII”-指抗体的结合特异性，“X”指衍生自小鼠的XenoMouse，“G1”-指IgG1 同位型或“G2”-指IgG2同位型，最后三个数字指抗体自其衍生的单细胞编号，例如： AB-EGFRvIII-XG1-095为具有IgG1同位型XenoMouse小鼠对EGFRvIII的结合特 异性的抗体，且细胞编号为95。
术语“SC”指单细胞，且特定XenoMax方法衍生的抗体可称为SC，其后紧跟三 个数字，或只有三个数字，在本文中指抗体衍生的单细胞编号。
对于杂交瘤衍生的抗体序列的描述编码如下：“AB”-指抗体，“EGFRvIII”-指抗 体的结合特异性，“X”指衍生自小鼠的XenoMouse，“G1”-指IgG1同位型或“G2”-指 IgG2同位型，“K”指κ，“L”指λ。最后三个数字指抗体衍生的纯系，例如： AB-EGFRvIII-XGlK-13.1.2。
本文所用的“标记”或“经标记”指对多肽添加的可检测部分，例如，放射性同位 素标记、萤光标记、酶标记、化学发光标记或生物素基。放射性同位素或放射性核 素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I，萤光标记可包括罗丹明 (rhodamine)、镧系磷或FITC，且酶标记可包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、 萤光素酶、碱性磷酸酶。
如本文所用的术语“医药剂或药物”指当适当施与患者时可产生理想治疗效果的 化合物或组合物。如由The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker，S.编， McGraw-Hill，San Francisco(1985))所例示，根据此项技术中的常规用法在本文中使 用其它化学术语。
如本文所用的“实质上纯”意思是靶物质为主要存在的物质(即，以摩尔量计， 组合物中比任何其它个别物质都大量存在)，且优选地，实质上经纯化的部分为其 中靶物质占存在的所有高分子物质至少约50％(以摩尔量计)的组合物。一般而言， 实质上纯的组合物将占组合物中存在的所有高分子物质的多于约80％，更优多于约 85％、90％、95％、99％和99.9％。最优地，将靶物质纯化至基本上为均质(通过 常规检测方法检测不到组合物中的污染物质)，其中组合物基本上由单高分子物质 组成。
术语“患者”包括人类和兽医受检者。
术语“Technology”指“Selected Lymphocyte Antibody Method”(Babcook 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i93：7843-7848(1996)和Schrader，美国专利第 5,627,052号)。
术语“XenoMaxTM”指SLAM Technology与小鼠的使用(如下文所 述)。
抗体结构
已知基本抗体结构单位包含四聚物。每一四聚物由两对一致的多肽链组成，每 一对具有一个“轻链”(约25kDa)和一个“重链”(约50-70kDa)。每一个链的氨基 -末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每一个 链的羧基-末端部分界定主要负责效应子功能的恒定区。人类轻链分类为κ和λ轻链。 重链分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同位型分别界定为IgM、IgD、IgG、IgA 和IgE。在轻链和重链种可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区来连 接，其中重链也包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般见，Fundamental Immunology第7章(Paul，W.编，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))。每一轻/重 链对的可变区形成抗体结合位点。
因此，完整抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体之外，两个结 合位点相同。
这些链都展示由三个高变区连接的相对保守的框架区(FR)相同的通用结构， 也称为互补决定区或CDR。每一对两个链的CDR通过框架区比对，使得可结合至 特异性表位。从N-末端到C-末端，轻链和重链都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3和FR4结构域。每一结构域的氨基酸分配是根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 和1991))或Chothia&Lesk J.Mol.Biol 196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature 342：878-883(1989)中的定义。
双特异性或双功能抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人 造杂交抗体。双特异性抗体可通过多种包括杂交瘤的融合和Fab′片段的连接的方法 来产生。见例如Songsivilai&Lachmann Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)， Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。双特异性抗体的产生与常规抗体 的产生相比可为相对劳动密集型的工艺，而且双特异性抗体的产量和纯度通常较低。 双特异性抗体不以具有单结合位点片段的形式存在(例如，Fab、Fab′和Fv)。除了 抗体的通用结构方面之外，互补位和表位之间的更特异相互作用可通过结构方式来 检验。在一个实施例中，CDR结构形成互补位，抗体经其可结合至表位。这种互补 位的结构可通过多种方式来测定。可使用传统的结构检验方法，诸如NMR或x-射 线晶体学。这些方法可检验单独互补位，或当其结合至表位时的结构。或者，分子 模型可在计算机模拟中产生。结构可借助于市售的封装，诸如Accelrys(San Diego， CA)的InsightII模型封装，通过同系模型产生。简而言之，可利用检验抗体序列来 寻求已知结构蛋白质的数据库，诸如，蛋白质结构数据库(Protein Data Bank)。在 识别具有已知结构的同系蛋白质之后，这些同系蛋白质可用作模型模板。每一种可 能模板可经比对，由此产生这些模板中基于结构的序列比对。随后可将具有未知结 构的抗体序列与这些模板比对以产生具有未知结构抗体的分子模型。如所属领域的 技术人员将了解的，存在多种在计算机模拟中产生所述结构的替代方法，可使用其 中任何一种。例如，可使用类似于Hardman等人，颁布的采用QUANTA(Polygen Corp.，Waltham，Mass.)和CHARM(Brooks，B.R.，Bruccoleri，R.E.，Olafson，B.D.， States，D.J.，Swaminathan，S.和Karplus，M.，1983，J.Comp.Chem，.4：187)的美国专利 第U.S.Pat.No.5,958,708号中所述工艺的工艺。
不但互补位的形状对于测定可能互补位是否结合至表位及其良好程度很重要， 而且表位和互补位之间的相互作用本身是设计变体抗体的大量信息来源。如所属领 域的技术人员将了解的，存在多种研究这种相互作用的方式。一种方式是使用可能 如上文所述产生的结构模型，且随后使用诸如InsightII(Accelrys，San Diego，CA) 的程序，其具有一个可对互补位和其表位之间的构型和定位空间进行Monte Carlo 研究的扩展模块。结果是可评估表位和互补位相互作用的地点和方式。在一个实施 例中，只有表位的片段或变体用于协助测定相关的相互作用。在一个实施例中，整 个表位用于互补位和表位之间相互作用的建模。如所属领域的技术人员将了解的， 这两种不同方法具有不同的优点和不足。例如，仅使用表位片段使得可对每一侧链 的可能变体进行更为详尽的检验，而无需耗费大量时间。另一方面，通过仅使用表 位片段，或仅使用表位代替整个蛋白质，表位片段的特征与整个表位的特征可能不 同，因此可能增加在计算建模过程中误导的风险。在一个实施例中，以有限程度使 用两种方法以交叉检查结果。在一优选实施例中，如果使用表位变体，可最优化以 便表位变体包含表位的最重要残基。最重要残基的一致性可通过多种方式测定，例 如如本发明实例4和14中所述。
通过使用这些产生的结构，可测定哪些残基在表位和互补位之间的相互作用中 最重要。因此，在一个实施例中，可易于选择改变哪些残基来改变抗体的结合特征。 例如，从扩展模型显而易见，表位中某些残基的侧链可在空间上阻止表位的结合， 由此将这些残基改变为具有较小侧链一致的残基。
这可以多种方式来测定。例如，只需观察两个模型来评估基于官能基和邻近基团 的相互作用。或者，如上文所述，可进行表位和互补位的重复组对，以获得更为有 利的能量相互作用。也可测定多种抗体变体的这些相互作用来测定其中抗体可结合至 表位的替代方式。也可将各种模型组合来测定如何改变抗体结构来获得具有所需特 定特征的抗体。
上述测定的模型可通过各种技术来测试。例如，相互作用能可由上文讨论的程序 来测定以决定需进一步检验哪种变体。又，使用库仑和范德华相互作用来测定表位和 变体互补位的相互作用能。也使用针对突变的位点来观察抗体结构中的预定变化实 际上是否可导致结合特征的所需变化。或者，可改变表位来证实模型正确或用于测 定可能在互补位和表位之间发生的一般结合主题。
上述用于建模结构的方法可用于测定蛋白质结构中的何种变化将导致抗体的特 定所需特征。这些方法可用于测定蛋白质结构中的何种变化不会导致抗体的所需特 征。
如所属领域的技术人员将了解的，尽管这些模型将为形成本发明的抗体及其变 体提供必要的向导，但仍需要进行计算机模拟模型中的常规测试，可能通过活体外 研究。此外，如所属领域的技术人员将了解的，任何改质也会对抗体活性具有另外 的副效应。例如，尽管预期导致更大结合的改变可引起更大的结合，也可引起其它 会减少或改变抗体活性的结构变化。对于是否为这种情况的测定在所属领域中很常 见，而且可通过多种方式来进行测定。例如，如实例21中，活性可通过ELISA测 试来测试。或者，可以通过使用表面等离子体共振装置来测试样品。
抗体结合和供优良结合的变体抗体
在一个实施例中，上述模型用于增加抗体对其表位的结合能力。抗体可更易于 结合至表位，且因此具有较高的缔合常数(ka)。或者，抗体可较慢自表位离解， 且因此具有较低的离解常数(KD)，或表位-互补位的KD值较小，因此使得表位和 互补位之间的结合程度更高。
在某些实施例中，设计变体抗体以相反特征结合。即，抗体不紧密结合或可能 不快速结合。
在其它实施例中，变体抗体的KD与野生型的抗体不同，但变体抗体对于特定表 位更具特异性。这意味着经设计抗体的互补位具有较低结合至其它表位的风险。抗 体可具有已改变的其它特征。例如，变体对非特异性抗体结合更具免疫性，或即使 当抗体以高浓度存在时，在溶液中仍保持溶剂化。这种变体可存在于所讨论的抗体 中。例如，尽管下文检验的某些变体抗体的较高浓度导致了Biacore实验中较慢的结 合组分(例如，13.1.2mAb)，但某些变体即使在相同浓度下仍不展示所述较慢组分， 例如L217N-2.1。可形成由上文测定的模型预测的变体，且随后经测试来测定其实际 上是否以所需特征结合。可选择与表位具有较大总相互作用能的突变体以供进一步 测试。相互作用能可以多种方式测定，其中之一如上文所述。
这些变体可以多种方式测试。示范性的选择包括，而且不限于KinExA(例如， Lackie颁布的专利第5,372,783号，1994年12月13日)(Sapidyne Instruments Inc.，ID， Boise)、表面等离子体共振(SPR)(e.g.，BIACORETM Biacore，Inc.，Pistcataway，N.J.)、停 流萤光、共振镜和萤光偏振。许多这些选择不但可以记录数据，而且可以提供用于将 数据拟合为各种理论曲线并由此测定ka、kd和KD以及其它特性的现成构件。重要的 是，应注意到这些曲线拟合为结果数据并不排除存在一些偏差的可能性。因此，相 关的缔合、离解和平衡常数不但可以通过这些曲线拟合机理来观察，也可以根据所 属领域的技术人员的知识直接相互比较。
人类抗体和抗体的人源化
人类抗体避免了与具有鼠科或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的问题。这些鼠 科或大鼠衍生蛋白质的存在可导致抗体的快速清除或可导致抵抗患者体内抗体的免 疫反应的产生。为避免使用鼠科或大鼠衍生抗体，可通过将人类抗体功能引入啮齿 动物以便于啮齿动物产生完全人类抗体来产生完全人类抗体。
克隆和重构YAC中兆碱基尺寸的人类基因座及将其引入小鼠种系的能力为说 明极大或经原始映射的基因座的功能组分以及产生人类疾病的有用模型提供了有力 途径。此外，使用这种技术将小鼠基因座替换为其人类等效物可为发育期间的人类 基因产物的表达和调节、它们与其它系统的信息传递及其在疾病诱发和进展中的关 联提供独特见解。
这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人类免疫球蛋白 (Ig)基因座引入内源Ig基因已失活的小鼠中提供机会来研究抗体的程序化表达和 组合及其在B-细胞发育中的作用中的潜在机理。此外，这种策略可为产生完全人类 单克隆抗体(mAb)-一种在人类疾病种实现抗体治疗前景的重要里程碑提供理想来 源。预期完全人类抗体可将免疫和过敏反应本质最小化为小鼠或小鼠衍生mAb，且 因此增加了经投予抗体的功效和安全性。使用完全人类抗体预期可为治疗慢性和复 发性人类疾病提供实质好处，诸如炎症、自身免疫力和癌症，这些都需要反复投予 抗体。
一种针对这个目的的方法是设计不足以用于具有人类Ig基因座大片段的小鼠 抗体生产的小鼠品系，以预期这些小鼠可在无小鼠抗体的情况下产生人类抗体的大 指令系统。大的人类Ig片段可保持大的可变基因多样性以及对抗体生产和表达的合 适调节。通过采用用于抗体多样化和选择的小鼠工具和对于人类蛋白质免疫耐受性 的缺乏，这些小鼠品系中再现的人类抗体指令系统应产生对于任何感兴趣的抗原(包 括人类抗原)都具有高亲和力的抗体。使用杂交瘤技术，可易于生产和选择具有所 需特异性的抗原-特异性人类mAb。如1994年所公开的，结合第一代XenoMouse 品系表明这种一般策略(见Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。XenoMouse 品系设计为具有分别含有人类重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小 的种系构型片段的酵母人工染色体(YAC)，其含有核可变核恒定区序列Id。含有 YAC的人类Ig经证明与供抗体重排和表达的小鼠系统相容且可替换为失活的小鼠 Ig基因。这可由其诱发B-细胞发育、产生完全人类抗体的类似成人的人类指令系统 和产生抗原-特异性人类mAb能力来证实。这些结果也表明，引入含有较大编号V 基因的人类Ig基因座的较大部分、另外的调节元素和人类Ig恒定区可实质上概括 完整指令系统，其以对于感染和免疫的人类体液反应为特征。Green等人的著作最 近由引入大于约80％的人类抗体指令系统扩展至分别引入兆碱基大小的人类重链 基因座和κ轻链基因座的种系构型YAC片段。见Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)和美国专利申请案第08/759,620号，申请于1996年12月3日。
XenoMouse小鼠的产生于以下专利中进一步讨论和叙述：美国专利申请案第 07/466,008号，申请于1990年1月12日；第07/610,515号，申请于1990年11月 8日；第07/919,297号，申请于1992年7月24日，第07/922,649号，申请于1992 年7月30日；第08/031,801号，申请于1993年3月15日；第08/112,848号，申 请于1993年8月27日；第08/234,145号，申请于1994年4月28日；第08/376,279 号，申请于1995年1月20日；第08/430,938号，申请于1995年4月27日；第 08/464,584号，申请于1995年6月5日；第08/464,582号，申请于1995年6月5 日；第08/463,191号，申请于1995年6月5日；第08/462,837号，申请于1995年 6月5日；第08/486,853号，申请于1995年6月5日；第08/486,857号，申请于 1995年6月5日；第08/486,859号，申请于1995年6月5日；第08/462,513号， 申请于1995年6月5日；第08/724,752号，申请于1996年10月2日和第08/759,620 号，申请于1996年12月3日和美国专利第6,162,963号、第6,150,584号、第6,114,598 号、第6,075,181号和第5,939,598号和日本专利第3068180B2号、第3068506B2 号和第3068507B2号。也可见Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)和 Green and Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)。
也可见欧洲专利第EP0463151B1号，于1996年6月12日授权公开，国际专 利申请案第WO 94/02602号，于1994年2月3日公开，国际专利申请案第WO 96/34096号，于1996年10月31日公开，第WO 98/24893号，于1998年6月11 日公开，第WO 00/76310号，于2000年12月21日公开，第WO 03/47336号。在 另一种方法中，其它公司，包括GenPharm International公司已使用“微基因座”方法。 在微基因座方法中，外源Ig基因座通过包含来自Ig基因座的物质(个别基因)来 模仿。因此，一种或一种以上VH基因、一种或一种以上DH基因、一种或一种以上 JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选为γ恒定区)形成为用于插入动物体内的构 造。这种方法描述于以下专利中：Surani等人的美国专利第5,545,807号和每一专利 都属于Lonberg和Kay的美国专利第5,545,806号、第5,625,825号、第5,625,126 号、第5,633,425号、第5,661,016号、第5,770,429号、第5,789,650号、第5,814,318 号、第5,877,397号、第5,874,299号和第6,255,458号，Krimpenfort和Berns的美 国专利第5,591,669号和第6,023.010号，Berns等人的美国专利第5,612,205号、第 5,721,367号和5,789,215号，及Choi和Dunnand的美国专利第5,643,763号，以及 GenPharm International美国专利申请案第07/574,748号，申请于1990年8月29日、 第07/575,962号，申请于1990年8月31日、第07/810,279号，申请于1991年12 月17日、第07/853,408号，申请于1992年3月18日、第07/904,068号，申请于 1992年6月23日、第07/990,860号，申请于1992年12月16日、第08/053,131号， 申请于1993年4月26日、第08/096,762号，申请于1993年7月22日、第08/155,301 号，申请于1993年11月18日、第08/161,739号，申请于1993年12月3日、第 08/165,699号，申请于1993年12月10日、第08/209,741号，申请于1994年3月 9日。也可见欧洲专利第0546073B1号，国际专利申请案WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、 WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884及美国专利第5,981,175号。进一步见 Taylor等人，1992年；Chen等人，1993年；Tuaillon等人，1993年；Choi等人， 1993年；Lonberg等人，(1994)；Taylor等人，(1994)和Tuaillon等人，(1995)Fishwild 等人，(1996)。
Kirin也已表明自小鼠中产生人类抗体，其中已通过微细胞融合引入大片染色体 或整个染色体。见欧洲专利申请案第773288号和第843961号。Xenerex Biosciences 正在研发一种用于潜在产生人类抗体的技术。在这种技术中，以人类淋巴细胞(例 如，B和/或T细胞)重新构成SCID小鼠。小鼠随后经抗原免疫，且可产生对抗抗 原的免疫反应。见美国专利第5,476,996号、第5,698,767号和第5,958,765号。
人类抗-小鼠抗体(HAMA)反应已将工业生产导向制备嵌合或其它人源化抗体。 尽管嵌合抗体具有人类恒定区和鼠科可变区，仍希望可观察到某些人类抗-嵌合抗体 (HACA)反应，尤其在抗体的慢性或多-剂量使用中。因此，为了使HAMA或HACA 反应的考虑和/或影响失效，仍希望提供对抗EGFRvIII的完整人类抗体。
抗体治疗
如本文所述，EGFRvIII抗体的功能似乎对其操作模式的至少一部分很重要。例 如，就功能而言，意思是EGFRvIII抗体在以EGFRvIII操作中的活性。因此，在某 些方面，希望结合作为对抗EGFRvIII的治疗候选物的抗体的产生，抗体可固定补 充物并补充细胞毒性淋巴细胞，由此参与到CDC和ADCC中。存在多种具有相同 功能的抗体同位型，包括(但不限于)以下：鼠科IgM、鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、 鼠科IgG3、人类IgM、人类IgG1、人类IgG3和人类IgA。又，希望结合作为对抗 EGFRvIII的治疗候选物的抗体的产生，抗体可通过Fc受体接合于诸如自然杀手 (NK)细胞的效应细胞来活化依赖抗体介导的细胞毒反应(ADCC)。存在多种可 ADCC的抗体同位型，包括(但不限于)以下：鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、 人类IgG1和人类IgG3。应了解，产生的抗体不必一开始就具有这种同位型，但是 相反地，产生的抗体可具有任何同位型且抗体可为随后使用此项技术中熟知的常规 技术转换的同位型。这些技术包括使用直接重组技术(例如，见美国专利第4,816,397 号)和细胞-细胞融合技术(例如，见美国专利第5,916,771号和第6,207,418号)。
在细胞-细胞技术中，制备具有含有任何所需同位型的重链的骨髓瘤或其它细胞 株和另一种具有轻链的骨髓瘤或其它细胞株。随后这些细胞可经融合，且可分离表 达细胞株的完整抗体。
例如，本文讨论的某些抗-EGFRvIII抗体为人类抗-EGFRvIII IgG1抗体。如果这 种抗体具有对EGFRvIII分子的所需结合，同位型应易于转换以产生人类IgM、人 类IgG3或人类IgGA，尽管仍具有相同的可变区(其界定了抗体的特异性及其某些 亲和力)。这些分子(包括IgG1)随后将可固定补充物并参与CDC，且如果包含 IgG1或IgG3恒定区，这些分子也将可通过补充细胞毒性淋巴细胞参与依赖抗体介 导的细胞毒反应(ADCC)。
因此，由于产生了达到上文所述所需“结构”属性的抗体候选物，因此，其通常 通过同位型转换可具有至少某些所需“功能”属性。其它治疗的设计和产生
基于本文中关于EGFRvIII产生和表征的抗体活性，促进了除抗体部分之外的 其它治疗形态的设计。
这些形态包括(但不限于)高级抗体疗法(诸如双特异性抗体、免疫毒素和放 射性同位素标记的疗法)、肽疗法的产生、基因疗法，尤其为内抗体、抗致敏疗法 和小分子。
例如，结合高级抗体疗法的产生，其中补充物固定和细胞毒性淋巴细胞的补充 为理想属性，可能通过使用双特异性、免疫毒素或放射性同位素标记来增强细胞杀 死。
例如，结合双特异性抗体，可产生包含以下的双特异性抗体：(i)两种抗体， 一种具有对EGFRvIII的特异性且另一种具有对结合在一起的第二种分子的特异性； (ii)一条链对EGFRvIII具有特异性且第二条链对第二种分子具有特异性的单抗体； 或(iii)对于EGFRvIII和另一种分子具有特异性的单链抗体。这些双特异性抗体可 使用熟知技术产生，例如，结合(i)和(ii)，例如见Immunol Methods 4：72-81(1994) 和上述的Wright and Harris，及结合(iii)，例如见Traunecker等人，Int.J.Cancer (Suppl.)7：51-52(1992)。在每一种情况下，第二种特异性可赋予Fc链活化受体，包 括(但不限于)CD16或CD64(例如见，Deo等人，18：127(1997))、CD3(Micromet′s BiTE技术)或CD89(例如见，Valerius等人，Blood 90：4485-4492(1997))。根据前述 制备的双特异性抗体可能杀死表达EGFRvIII的细胞，且尤其是其中本发明的 EGFRvIII抗体有效的那些细胞。
结合免疫毒素，抗体可使用此项技术中熟知的技术改质而作为免疫毒素。
例如见Vitetta Immunol Today 14：252(1993)。也例如见美国专利第5,194,594号。 结合制备放射性同位素标记的抗体，这些经改质抗体也可易于使用此项技术中熟知 的技术来制备。例如见Junghans等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 中(第2版，Chafner and Longo编，Lippincott Raven(1996))。也见美国专利第4,681,581 号、第4,735,210号、第5,101,827号、第5,102,990号(RE 35,500)、第5,648,471号 和第5,697,902号。每一种免疫毒素和放射性同位素标记的分子都可能杀死表达 EGFRvIII的细胞，且尤其是其中本文所述抗体有效的那些细胞。
可设计抗体更快速结合，或更慢自表位离解，且因此可将抗体本身设计为治疗 剂。例如，抗体的经改变特征可用于对患者投予治疗剂。治疗免疫偶联物
如所了解的，与药物、毒素或其它分子(免疫偶联物或免疫毒素)结合的抗体 在定靶杀死表达可通过特异性结合分子(诸如抗体)特异性结合的分子的细胞中极 为有用。如上文所述，尚未已知在任何正常组织上表达过EGFRvIII。此外，EGFRvIII 显示显著表达于多种人类肿瘤中。因此，EGFRvIII是用于以免疫毒素定靶的最受瞩 目的分子。
已出现许多关于试图特异性定靶具有单克隆抗体-药物偶联物的肿瘤细胞的报 导(Sela等人，Immunoconjugates 189-216中(C.Vogel，ed.1987)；Ghose等人，Targeted Drugs 1-22中(E.Goldberg编，1983年)；Diener等人，Antibody Mediated Delivery Systems 1-23中(J.Rodwell编，1988年)；Pietersz等人，Antibody Mediated Delivery Systems 25-53中(J.Rodwell编，1988年)；Bumol等人，Antibody Mediated Delivery Systems 55-79中(J.Rodwell编，1988年))。细胞毒素药物，诸如氨甲喋呤、柔红 霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C和苯丁酸氮 芥已与多种鼠科单克隆看体结合。在某些情况下，通过中间体载剂分子将药物分子 连接至抗体分子，这些中间体载剂分子诸如血白蛋白(Garnett等人，Cancer Res. 46：2407-2412(1986)；Ohkawa等人，Cancer Immumol.Immunother.23：81-86(1986)； Endo等人，Cancer Res.47：1076-1080(1980))、右旋糖酐(Hurwitz等人，Appl.Biochem. 2：25-35(1980)；Manabi等人，Biochem.Pharmacol.34：289-291(1985)；Dillman等人， Cancer Res.46：4886-4891(1986)；Shoval等人，Proc.Natl.Acad.Sci.85：8276-8280 (1988))或多聚谷氨酸(Tsukada等人，J.Natl.Canc.Inst.73：721-729(1984)；Kato等 人，J.Med.Chem.27：1602-1607(1984)；Tsukada等人，Br.J.Cancer 52：111-116 (1985))。
已采用多种连接子技术以用于制备这些免疫偶联物，且已研究了可离解和不可 离解连接子。然而，在大部分情况下，如果药物分子可从在定靶位点为非改质形式 的偶联物释放出来，就只能观察到药物的完全细胞毒性潜能。
已用于制备抗体-药物偶联物的可离解连接子之一为基于顺-丙烯三羧酸的酸- 不稳定连接子，其利用不同细胞内间隔的酸性环境，诸如在受体调节的内吞作用中 遇到的内体和溶酶体。Shen和Ryser引入这种方法来制备柔红霉素与大分子载剂的 偶联物(Biochem.Biophys.Res.Commun.102：1048-1054(1981))。Yang和Reisfeld 使用相同技术将柔红霉素偶联至抗-黑素瘤抗体(J.Natl.Canc.Inst.80：1154-1159 (1988))。近来，Dillman等人也使用酸不稳定连接子以类似方式制备柔红霉素与抗 -T细胞抗体的偶联物(Cancer Res.48：6097-6102(1988))。
由Trouet等人研究的另一种方法涉及将柔红霉素经肽空间臂连接至抗体(Proc. Natl.Acad.Sci.79：626-629(1982))。这是在通过溶菌酶肽酶的作用无药物从这种偶 联物中释放出来的前提下进行的。
然而，在活体外细胞毒性测试中已揭示，抗体-药物偶联物很少达到与自由非偶 联药物相同的细胞毒性效能。这表明，药物分子从抗体释放出来的机理效率很差。 在免疫毒素的范围内，经单克隆抗体与催化活性蛋白质毒素之间的双硫桥形成的偶 联物显示比含有其它连接子的偶联物更具细胞毒性。见，Lambert等人，J.Biol.Chem. 260：12035-12041(1985)；Lambert等人，Immunotoxins 175-209中(A.Frankel编， 1988)；Ghetie等人，Cancer Res.48：2610-2617(1988)。这归因于对抗体分子与毒素 之间的双硫键的有效离解有利的谷胱甘肽的高细胞内浓度。尽管如此，仅有少量关 于使用双硫桥制备药物和大分子之间的偶联物的报导实例。Shen等人描述了氨甲喋 呤转化为巯乙基酰胺衍生物，继而经双硫键与聚-D-赖氨酸偶联(J.Biol.Chem. 260：10905-10908(1985))。此外，一报导描述了含三硫化物的毒素药物刺孢霉素与 抗体的偶联物的制备(Menendez等人，Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer，San Diego，Abstract 81(1989))。另一报导描 述了含三硫化物的毒素药物刺孢霉素与抗体的偶联物的制备(Hinman等人，53 Cancer Res.3336-3342(1993))。
缺少二硫化物连接的抗体-药物偶联物的一个原因是带有含有可易于用于将药 物经二硫化物桥连接至抗体的部分的硫原子的细胞毒素药物的不可利用性。此外， 现存药物在其细胞毒性潜能不减少的情况下，其难于进行化学改质。
现存抗体-药物偶联物的另一主要不足在于因为有限数目的定靶抗原及静止癌 药物(如氨甲喋呤、柔红霉素和长春新碱)的相对适度细胞毒性，其不能将足够浓 度的药物传递到定靶位点。为了达到显著的细胞毒性，有必要将大量的药物分子直 接或通过聚合载剂分子连接至抗体。然而，这些高度改质的抗体通常展示出对于定 靶抗原削弱的结合且快速从血流中活体内清除。
Maytansinoid为高度细胞毒素药物。美登素首先由Kupchan等人自东非灌木齿 叶美登木中分离，且其显示比常规癌症化学治疗剂(如氨甲喋呤、柔红霉素和长春 新碱)大100到1000倍的细胞毒性(美国专利第3,896,111号)。后来发现某些微 生物也产生maytansinoid，诸如异戊酸美登素酯和异戊酸美登素酯的C-3酯(美国 专利第4,151,042号)。也已报导异戊酸美登素酯的合成C-3酯和异戊酸美登素酯 的类似物(Kupchan等人，J.Med.Chem.21：31-37(1978)；Higashide等人，Nature 270：721-722(1977)；Kawai等人，Chem.Pharm.Bull.32：3441-3451(1984))。C-3 酯由其制备的异戊酸美登素酯的类似物的实例包括芳族环上(例如，脱氯)或在C-9、 C-14(例如，羟基化甲基)、C-15、C-18、C-20和C-4，5处经改质的异戊酸美登素酯。
天然发生和合成C-3酯可分为两个群组：
(a)具有简单羧酸的C-3酯(美国专利第4,248,870号、第4,265,814号、第 4,308,268号、第4,308,269号、第4,309,428号、第4,317,821号、第4,322,348号和 第4,331,598号)和
(b)具有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯(美国专利第4,137,230号、第 4,260,608号、第5,208,020号和Chem.Pharm.Bull.12：3441(1984))。
发现群组(b)的酯的细胞毒性比群组(a)的酯的细胞毒性大得多。
美登素为有丝分裂抑制剂。已报导以美登素活体内处理L1210细胞导致67％的 细胞聚集于有丝分裂中。已报导未经处理的比对细胞显示3.2％至5.8％之间的有丝 分裂指数(Sieber等人，43 Comparative Leukemia Research 1975，Bibl.Haemat. 495-500(1976))。海胆卵和蛤蜊卵的实验已表明，美登素通过抑制微管蛋白质(微 管蛋白)的聚合干扰微管形成来抑制有丝分裂(Remillard等人，Science 189：1002-1005(1975))。
活体外，已发现以10-3 to 10-1μg/μl剂量的美登素即可抑制P388、L1210和 LY5178鼠科白血病细胞悬浮液，其中P388细胞株最敏感。也已显示美登素是人类 鼻咽癌细胞活体外生长的活性抑制剂，且报导人类急性淋巴母细胞白血病细胞株 CEM可由低至10-7mg/ml的浓度抑制(Wolpert-DeFillippes等人，Biochem. Pharmacol.24：1735-1738(1975))。
活体内，美登素也显示具有活性。显示在50至100倍剂量范围内抑制P388淋 巴母细胞白血病系统的肿瘤生长，这表明具有高治疗指数；L1210小鼠白血病系统、 人类Lewis肺癌系统和人类B-16黑素癌系统也显示显著抑制活性(Kupchan，Ped. Proc.33：2288-2295(1974))。
目前偶联maytansinoids和细胞结合剂(诸如抗体)的方法包括两个反应步骤。 首先将细胞结合剂(例如抗体)以交联试剂(诸如N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙 酸酯(SPDP))改质以将二硫代吡啶基引入抗体(Carlsson等人，Biochem.J. 173：723-737(1978)；美国专利第5,208,020号)。在第二个步骤中，将具有硫醇基 的反应性maytansinoid(诸如DM1(形式上称为N2′-去乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙 基))-美登素)作为起始试剂添加至经改质抗体中，导致改质抗体中硫代吡啶基的 置换，及由二硫化物连接的细胞毒性maytansinoid/抗体偶联物的产生(美国专利第 5,208,020号)。在美国专利第6,441,163号中描述用于偶联maytansinoids的一步骤 工艺。
由ImmUnogen Corporation(Cambridge，MA)可获得基于Maytansinoid的免疫毒 素技术。另一种重要的毒素技术是基于auristatin毒素。Auristatins衍生自由印度洋 海的海兔获得的海兔毒素Dolastatin 10，作为有效的细胞生长抑制物质。见美国专 利第4,816,444号和第4,978,744号。关于其它的海兔毒素，也见美国专利第4,414,205 号(Dolastatin-1、2和3)、第5,076,973号(Dolastatin-3)、第4,486,414号(Dolastatin-A 和B)、第4,986,988号(Dolastatin-13)、第5,138,036号(Dolastatin-14)和第4,879,278 号(dolastatin-15)。由Dr.Pettit和亚利桑那州大学的同事分离和合成的各种auristatine 衍生物已经测试且显示出对细胞的高度毒性。见Pettit等人，抗肿瘤剂337。海兔毒 素10结构改质的合成。Anticancer Drug Des.10(7)：529-44(1995)，Woyke等人。有 效海兔毒素10结构改质auristatin PHE的细胞外活性和后抗真菌作用。Antimicrobial Agents and Chemotherapy.45：3580-3584(2001)，Pettit等人。海兔毒素10和肽衍生 物对抗新生隐球菌的特异性活性。Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42：2961-2965(1998)，Woyke。新生隐球菌细胞周期期间微管的三维显影和auristatin PHE对微管整体性和核位置的影响。Submitted，Antimicrobial Agents and Chemotherapy。
近来，已研发在作为有效负载在抗体上传递时似乎相当有效的其它auristatin衍 生物。例如，已显示单甲基auristatin E(MMAE)在与肿瘤特异性抗体偶联时作为 对于肿瘤细胞的有效毒素。Doronina等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在线可得)； Francisco等人，cAC10-vcMMAE，an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity.Blood.(2003)May 8[E印刷前公开].Epub 2003 Apr 24(在线可得)。除auristatin分子的毒性之外，研究已显示经肽连接的偶联 物更稳定，且因此在缓冲剂和血浆中比其它连接子技术对正常组织的特异性更大且 毒性更小。Doronina等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在线可得)；Francisco等 人，cAC 10-vcMMAE，an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity.Blood.(2003)May 8[E印刷前公开].′Epub 2003 Apr 24 (在线可得)。
这些连接子基于支链肽设计且包括例如mAb-缬氨酸-瓜氨酸-MMAE和mAb-苯 丙氨酸-赖氨酸-MMAE偶联物。Doronina等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在线 可得)；Francisco等人，cAC 10-vcMMAE，an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity.Blood.(2003)May 8[E印刷前 公开].′Epub 2003 Apr 24(在线可得)。这些设计和偶联技术由以下所述，例如King 等人的Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared with branched peptide linkers：inhibition of aggregation by rnethoxytriethyleneglycol chains.J Med Chem. 45(19)：4336-43(2002)和Dubowchik等人的Cathepsin B-sensitive dipeptide prodrugs. 2.Models of anticancer drugs paclitaxel(Taxol)，mitomycin C and doxorubicin.Bioorg Med Chem Lett.8(23)：3347-52(1998)。基于前述的Auristatin E-基免疫毒素技术由 Seattle Genetics Corporation(Seattle，WA)可得。
存在大量由自然源萃取物及半合成和合成类似物获得的影响微管的新颖化合 物，其似乎具有作为用于产生免疫偶联物的毒素的潜能。(见newmedinc.com网站)。 这些分子及使用这些分子的药物实例包括以下：秋水仙碱-位点结合剂(Curacin)、风 车子素(AVE806，风车子素A-4前药(CA4P)，Oxi-4503)、隐藻素(LY355703)、 Discodermolide、Dolastatin和Analogs(Auristatin PHE、Dolastatin 10、ILX-651、 Symplostatin 1、TZT-1027)、埃博霉素(BMS-247550、BMS-310705、EPO906、KOS-862、 ZK-EPO)、榴塞洛素(Eleutherobin)、FR182877、Halichondrin B(E7389)、月苄三 甲氯铵(Halimide)(NPI-2352和NPI-2358)、Hemiasterlins(HTI-286)、Laulimalide、 Maytansinoids(″DM1″)(Bivatuzumab美登素、Cantuzumab美登素、 huN901-DM1/BB-10901TAP、MLN591DM1、My9-6-DM1、曲妥珠单抗(Trastuzumab) -DM1)、PC-SPES、Peloruside A、白藜芦醇(Resveratrol)、S-烯丙基巯基半胱氨酸 (SAMC)、海绵素(Spongistatin)、维提岛酰胺(Vitilevuamide)、分子发动机-驱 动蛋白(Molecular Motor-Kinesins)(SB-715992)、设计的秋水仙碱-位点结合剂 (A-289099，A-293620/A-318315，ABT-751/E7010，D-24851/D-64131，ZD6126)、其它 新颖纺锤体毒素(2-甲氧雌二醇(2-ME2)，苯并咪唑氨基甲酸酯(ANG 600系列，甲苯 咪唑)，CP248/CP461，HMN-214，R440，SDX-103，T67/T607)。此外，在1998年的 Mayer，A.M.S.Marine Pharmacology：Antitumor and Cytotoxic Compounds.The Pharmacologist.41(4)：159-164(1999)中评论了其它的鼠科衍生毒素。
治疗投予和配方
延长的作用时间可以通过交替的非经肠途径(诸如，静脉内、皮下或肌肉内注 射)使得给料进程较不频繁且更为便利。
当用于活体内投予时，本文所述的抗体配方应该是无菌的。例如，这可易于通 过在冻干和重组之前或之后经无菌过滤膜过滤来实现。抗体通常以冻干形式储存或 储存在溶液中。治疗抗体组合物通常放置在具有无菌存取入口的容器中，例如，具 有可回收配方的接合器(诸如皮下注射针可穿过的塞子)的静脉内溶液袋或小瓶。
抗体投予的路径是根据已知方法，例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、 眼内、动脉内、鞘内、吸入或病灶内途径，或通过如下文所述的缓释系统注射或灌 输。抗体优选通过灌输或通过大丸剂注射连续投予。
治疗学上采用的抗体的有效量取决于(例如)治疗对象，投药途径和患者的病 况。因此，对于治疗学家而言，优选视需要滴定剂量并改良投药路径以获得最优的 治疗效果。理论上，临床医师将投予抗体，直到达到理想效果的剂量。这种疗法的 进程易于通过常规的检定或通过本文所述的检定来控制。
如本文所述的抗体可在含有医药学上可接受的载剂的混合物中制备。治疗组合 物可优选以液体或粉末气溶胶(经冻干)的形式经静脉内或经鼻或肺投予。组合物 也可以视需要非经肠或经皮下投予。当进行全身性投予时，治疗组合物应该是无菌， 无热源且在非经肠可接受的具有应有pH值、等渗性和稳定性的溶液中。这些条件 为所属领域的技术人员所已知。简而言之，通过将具有所需纯度的化合物与生理学 上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备化合物剂量配方以供储存和投予。这 些材料在所采用的剂量和浓度时对于接受者是无毒性的，且其包括缓冲剂，诸如 TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸； 低分子量(小于约十个残基)肽，诸如聚精氨酸；蛋白质，诸如血白蛋白、明胶或免 疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄 糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡 离子，诸如钠和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENPLURONICS或聚乙二醇。
用于注射的无菌组合物可根据Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版， Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)中所述的常规医药实践来调配。例如， 可能需要活性化合物在诸如水或天然发生的植物油，如芝麻油、花生油或棉籽油的 媒介物，或如油酸乙酯或其类似物的合成脂肪媒介物中的溶解液或悬浮液。可根据 可接受的医药实践并入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂及其类似物。
缓释制剂的合适实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基 质为成形物件、膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，由 Langer等人的J.Biomed Mater.Res.，(1981)15：167-277和Langer的Chem.Tech.， (1982)12：98-105所述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专 利第3,773,919号、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等 人的Biopolymers，(1983)22：547-556)、非降解伸乙基-乙酸乙烯酯(Langer等人，上 述)、降解乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸 亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
尽管诸如伸乙基-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得可释放分子100天， 但某些水凝胶仍持续较短时间释放蛋白质。当包胶蛋白质在体内长时间保留时，它 们可能因为暴露于37℃的湿气下而变性或聚集，导致生物活性的丧失且可能改变免 疫原性。可根据所涉及的机理设计合理的策略以供稳定蛋白质。例如，如果发现聚 集机理为经二硫化物互换形成分子间S-S键，就可以通过改质硫氢基残基、自酸性 溶液中冻干、控制湿气含量、使用合适的添加剂和研发特异性聚合物基质组合物来 达到稳定。
缓释组合物也包括悬浮于可将晶体保持在悬浮液中的合适配方中抗体晶体的制 剂。当通过皮下或腹膜内注射时，这些制剂可产生缓释效应。其它组合物也包括脂 质体截留的抗体。含有这些抗体的脂质体由本身已知的方法来制备：美国专利第DE 3,218,121号、Epstein等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)82：3688-3692、Hwang 等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)77：4030-4034、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、142,641、日本专利申请案第83-118008号、美国专利第4,485,045 号和第4,544,545号及EP 102,324。
用于给定患者的抗体配方的剂量可由主治医师结合考虑已知的各种因素来测定 以改质药物的作用，包括疾病的严重程度和类型、体重、性别、饮食、投药时间和 路径、其它药剂和其它相关临床因素。治疗有效剂量可通过活体外或活体外方法来 测定。
治疗学上采用的抗体的有效量取决于(例如)治疗对象，投药途径和患者的病 况。因此，治疗学家优选视需要滴定剂量并改良投药路径以获得最优的治疗效果。 根据上文提及的因素，一般的日剂量可在约0.001mg/kg到多至100mg/kg或更多之 间。理论上，临床医师将投予治疗抗体，直到达到理想效果的剂量。这种疗法的进 程易于通过常规的检定或如本文所述来控制。
应了解，根据本文的组合物和方法进行的治疗实体的投予应与并入配方中的合 适载剂、赋形剂及其它试剂一起投予，以提供经改良的转移、传递、耐受性及其类 似性质。在所有药剂化学师已知的配方中可发现多种合适配方：Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1990))，尤 其为其文中的Block，Lawrence的第87章。例如，这些配方包括粉末、浆料、软膏、 胶质物、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)气泡(诸如LipofectinTM)、 DNA偶联物、无水吸收浆料、水中油和油中水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的 聚乙二醇)、半固凝胶和含有聚乙二醇的半固混合物。根据本发明，任何前述混合 物可适于治疗和疗法中，只要配方中的活性成分不会被配方钝化，且所述配方生理 学上相容且可容忍所述投药路径。也见Baldrick P.的“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”，Regul.Toxicol，Pharmacol. 32(2)：210-8(2000)；Wang W.的“Lyophilization and development of solid protein Pharmaceuticals.”，Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)；Charman WN的“Lipids， lipophilic drugs，and oral drug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)；Powell等人的“Compendium of excipients for parenteral formulations”，PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)且其中引用的与配方、赋 形剂和载剂相关的额外信息已为药剂化学师所熟知。
抗体的制备
如本文所述，抗体可通过使用如下文所述的技术来制备。所述小 鼠随后即可产生人类免疫球蛋白分子和抗体，但不足以产生鼠科免疫球蛋白分子和 抗体。用于达到相同目的的技术揭示于本文所揭示的专利、申请案和参考案中。然 而，尤其为关于转基因生产小鼠及由其产生的抗体的一个实施例揭示于申请于1996 年12月3日的美国专利申请案第08/759,620号和1998年6月11日公开的国际专 利申请案WO 98/24893和2000年12月21日公开的WO 00/76310中。也见Mendez 等人的Nature Genetics 15：146-156(1997)。
通过使用这种技术，可生产针对多种抗体的完全人类单克隆抗体。在一个实施 例中，将小鼠的细胞株以令人感兴趣的抗原(例如，EGFRvIII)免疫， 自表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(诸如B-细胞)，且将所述细胞与骨髓型细胞株融 合以制备永生化杂交瘤细胞株，且筛选并选择这些杂交瘤细胞株以识别产生对于令人 感兴趣的抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞株。本文提供用于产生可产生对 EGFRvIII具有特异性的抗体的多种杂交瘤细胞株的方法。此外，本发明提供由这些细 胞株产生的抗体的表征，包括这些抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列。
或者，代替与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，根据对初始抗原(优选为EGFRvIII 蛋白质)的反应活性进一步筛选由所回收的细胞产生、自经免疫小鼠细胞株分离的抗体。所述筛选包括以EGFRvIII蛋白质进行ELISA，活体外结合至稳 定表达全长EGFRvIII的NR6M细胞且由NR6M细胞中的抗体内在化EGFRvIII受体。 随后使用EGFRvIII-特异性溶血性平板检定分离分泌令人感兴趣的抗体的单B细胞 (Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i93：7843-7848(1996))。定靶用于溶菌 的细胞优选为以EGFRvIII抗原涂敷的绵羊红细胞(SRBC)。在分泌令人感兴趣的 免疫球蛋白的B细胞培养基和补充物的存在下，平板的形成表明靶细胞的特异性 EGFRvIII介导溶菌作用。可分离平板中心处的单抗原-特异性血浆细胞，且编码抗体特 异性的遗传信息可自单血浆细胞分离。使用反转录酶PCR可克隆编码所分泌抗体的可 变区的DNA。所述经克隆DNA随后可进一步插入合适表达载体中，优选为载体盒， 诸如pcDNA，更优为含有免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域的pcDNA载体。随后， 所产生的载体可转染为宿主细胞，优选为CHO细胞，且培养于经合适改质的常规 营养培养基中以供诱发启动子、选择转化体或放大编码基因的所需序列。本文中描 述产生对EGFRvIII具有特异性的抗体的多个单血浆细胞的分离。此外，将编码抗 -EGFRvIII抗体特异性的遗传物质分离、引入随后转染为宿主细胞的合适表达载体中。
来自XenoMouse小鼠的B细胞也可用作遗传物质的来源，自其可产生抗体展示 文库。所述文库可使用所述领域的一般技术经由核糖体展示在噬菌体、酵母或活体 外制得。经超免疫的XenoMouse小鼠可作为一种丰富来源，自其可分离具有高亲和 力的抗原-反应性抗体。因此，经对抗EGFRvIII超免疫的XenoMouse小鼠可用于产 生抗体展示文库，自其可分离对抗EGFRvIII的高亲和力抗体。所述库可针对pep3寡 肽进行筛选，且所得衍生抗体针对表达EGFRvIII的细胞进行筛选以确定对于自然展 示抗原的特异性。完全IgG抗体随后可使用重组DNA技术来表达。例如见WO 99/53049。
一般而言，由上述细胞株产生的抗体具有完全人类IgG1或IgG2重链和人类κ轻 链。在一个实施例中，抗体具有高亲和力，当通过固相和溶液相测量时，其一般具 有约10-9M至约10-13M的Kd值。在其它实施例中，抗体具有较低的亲和力，自约 10-6M至约10-8M。
如所属领域的技术人员所了解的，根据本实施例的抗体可在除杂交瘤细胞株之 外的细胞株中表达。编码特定抗体的序列可用于合适哺乳动物宿主细胞的转型。可 通过任何已知方法进行转型以将多聚核苷酸引入宿主细胞，例如包括将多聚核苷酸 封装于病毒(或病毒载体)中且以病毒(或载体)或通过此项技术中已知的转染程 序转换宿主细胞，如由美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号 和第4,959,455号中所例示。所使用的转型程序取决于待转型的宿主。此项技术中 已熟知将异种多聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法，且其包括右旋糖酐调节转染、 磷酸钙沉淀、聚凝胺调节转染、原生质体融合、电击、多聚核苷酸封装于脂质体中 和DNA直接微注射于胞核中。
此项技术中已熟知可用作供表达宿主的哺乳动物细胞株，且其包括由多种由美 国菌种保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))获得的永生化细胞株， 包括(但不限于)中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、 猴肾脏细胞(COS)、肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和许多其它细胞株。通过测 定哪些细胞株具有高表达水平且产生具有组成型EGFRvIII结合特性的抗体来选择 尤其较优的细胞株。
实例
提供以下实例，包括进行的实验和得到的结果仅为了达到说明的目的而并不解 释为对本发明的限制。
最初产生EGFRvIII-特异抗体的策略涉及用复合抗原(肽、多种可溶性蛋白质 和抗原表达细胞)免疫XenoMouse小鼠，随后通过融合产生杂种细胞或通过 XenoMaxTM/SLAMTM技术分离B细胞而分离抗体产生细胞。抗体产生细胞通过 ELISA为特异性而呈递到一级筛选，通过FMAT和/或FACS为细胞表面结合而呈 递到二级筛选。随后进行内在化检定以识别可能对药物输送有用的抗体。测量这些 抗体的亲和力。选择特定抗体进行表位定位。此外，选择特定抗体进行体内及体外 测试以分析这些抗体对治疗癌症的功效。
实例1′抗原制备
A.EGFRvIII PEP3-KLH抗原制备
连同实例2，14-mer人EGFRvIII PEP3(L E E K K G N Y V V T D H C(SEQ ID NO：56))肽通过R&D系统常规合成。随后PEP3肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)结 合，如下：EGFRvIII PEP3(200mcg)(R&D)与50mcg的匙孔血蓝蛋白(KLH；Pierce， Rockford，IL)混合并用蒸馏水定容到165mcl。加入250mcl结合缓冲液(0.1M MES， 0.9M NaCl，pH 4.7)并通过加入25mcl的10mg/ml的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化 二酰亚氨氢氯化物的储存液(EDC，Pierce，Rockford，IL)使EGFRvIII PEP3和KLH 交联。在室温下培养结合2小时，使用pH7.4的PBS通过1kDa滤膜(离心滤膜， Millipore，Bedford，MA)将未反应的EDC离心除去。
连同实例3，14-mer人EGFRvIII PEP3(L E E K K G N Y V V T D H C(SEQ ID NO：56))肽通过R&D系统常规合成。随后PEP3肽与KLH结合，如下：EGFRvIII PEP3(200mcg)与50mcg的匙孔血蓝蛋白(KLH；Pierce，Rockford，IL)混合并用蒸 馏水定容到165mcl。加入250mcl结合缓冲液(0.1M MES，0.9M NaCl，pH 4.7)并通 过加入25mcl的10mg/ml的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二酰亚氨氢氯化物的储 存液(EDC，Pierce，Rockford，IL)使EGFRvIII PEP3和KLH交联。在室温下培养结 合2小时，使用pH7.4的PBS通过1kDa滤膜(离心滤膜，Millipore，Bedford，MA) 将未反应的EDC离心除去。
B.B300.19/EGFRvIII转染子
为了制备B300.19/EGFRvIII转染子，从A431细胞初始克隆出野生型EGFR， 且用于编码EGFRvIII的EGFR基因被更改从而缺失编码残基6-273的密码子，而在 缺失的连接处产生编码甘氨酸残基的密码子。该缺失发生在缺失GTT(缬氨酸)和 CGT(精氨酸)周围的密码子内，而得到的缺失后密码子为GGT(甘氨酸)。(Wikstrand et al.J Neurovirol.4(2)：148-58(1998))
1.野生型EGFR构建的克隆：
使用Micro-fast RNA试剂盒(Invitrogen，Burlington，ON)从A431(ATCC)中 提取聚A+mRNA。用随机pdN6引物和M-MuLV逆转录酶(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)从polyA+mRNA合成总cDNA。用下列引物由A431cDNA 扩增2.3kb的PCR产物：
正义5′-GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3′；(SEQ ID NO：62)
反义5′-CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3′(SEQ ID NO：63)
使用Pfu DNA聚合酶。
将PCR产物用XhoI消化，凝胶纯化，并连接到被XhoI线型化的质粒pWBFNP (见国际专利申请案第WO 99/45031号)中，以产生质粒Wt-EGFR/pWBFNP。
2.EGFRvIII构建的产生：
用引物对C13659/C29538和C29539/C14288(BioSource International)由质粒 Wt-EGFR/pWBFNP扩增出PCR产物，其中C29538和C29539被T4多核苷酸激酶 (NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)磷酸化：
C13659：5′-CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3′(正义) (SEQ ID NO：64)
C29538：5′-CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3′(反义)(SEQ ID NO：65)；
C29539：5′-GTAATTATGTGGTGACAGATC-3′(正义)(SEQ ID NO：66)；
C14288：5′-CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3′(反义) (SEQ ID NO：67)。
被连接以在编码EGFR细胞外结构域的6至273氨基酸的序列中引入缺失，并 亚克隆到表达载体pWBDHFR2中(见国际专利申请案第WO 99/45031号)。
用引物对C13659/C29538由Wt-EGFR/pWBFNP模板用Pfu聚合酶(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)扩增产生代表缺失的5′端的232bp的片段。用EcoRl (NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化并凝胶纯化PCR产物。用引物对 C29539/C14288从Wt-EGFR/pWBFNP产生代表缺失的3′端的1273bp的片段，且用 Pfu聚合酶扩增模板。用Xhol(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化PCR 产物。用T4DNA连接酶(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)将片段连接 到用EcoRl/Xhol消化的pWBDHFR2以产生构建EGFRvIII/pWBDHFR。
EGFR的细胞内结构域被引入下列获得的构建中：从质粒Wt-EGFR/pWBFNP 中分离出1566bp的片段并连接到用DraIII/XhoI消化的EGFRvIII/pWBDHFR以产生 EGFRvIII-FL/pWBDHFR。
3.用EGFRvIII-FL/pWBDHFR转染B300.19细胞：
B300.19细胞(8x106)被用于每700μl DMEM/III介质中的转染。加入20μg EGFRvIII-FL/pWBDHFR和2μg CMV-Puro质粒DNA。用Bio-Rad Gene Pulser在 300volts/960uF下将细胞电击。电击后，在冰上冷却细胞10分钟，随后加入10非 选择性介质(DMEM/HI葡萄糖，10％FBS，50μM BME，2mM L-谷氨酰胺，100 单位青霉素-G/ml，100单位MCG链霉素/ml)。在37℃、7.5％CO2下培养细胞48 小时。
培养后，将细胞分裂于选择性介质(DMEM/HI葡萄糖，10％FBS，2mM L-谷氨 酰胺，50μM BME，100单位青霉素-G/ml，100单位MCG链霉素/ml，2ug/ml嘌呤霉 素)中，在96孔板中以2x104、0.4x104′和0.08x104细胞/孔的浓度，在选择性介质中 被选择14天以产生稳定的克隆。将Puro抗性克隆用E752mAb(抗-EGFR抗体，在 Yang等人，Crit Rev Oncol Hematol.，38(1)：17-23(2001)中有所描述)和山羊抗人IgG PE染色，随后在FACS Vantage(Becton Dickinson)上分析。
C.构建EGFRvIII-RbFc表达构建
为产生EGFRvIII兔融合蛋白，我们首先构建含有编码兔Fc的DNA的载体。 这与编码EGFRvIII的DNA连接。下面将详细描述此方法：
1.RbFc/pcDNA3.1 Hygro的构建：
(下列)引物1322/867用于扩增编码兔IgG的Hinge-CH2-CH3结构域的721bp 的片段。
#1322(正义)：5′-GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3′(SEQ ID NO：68)
#867(反义)：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3′ (SEQ ID NO：69)
将得到的PCR产物用KpnI和NotI消化，凝胶纯化并连接到用KpnI/NotI消化 的pcDNA3.1(+)/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)，以产生质粒RbFc/pcDNA3.1 Hygro。
2.EGFRvIII-RbFc/pCEP4的构建：
(下列)引物1290/1293用于用Pfu聚合酶扩增自EGFRvIII-FL/pWBDHFR质 粒模板的1165bp的产物。
#1290(正义)：5′-CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3′(SEQ ID NO：70)
#1293(反义)：5′-CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3′(SEQ ID NO：71)
将PCR产物用NheI和KpnI消化，凝胶纯化并连接到用NheI/KpnI消化的 RbFc/pcDNA3.1以产生质粒EGFRvIII-RbFc/pcDNA3.1 Hygro。
2170bp的SnaBI/XhoI片段被从EGFRvIII-RbFc/pcDNA3.1 Hygro中分离出来并 亚克隆入SnaBI/XhoI消化的pCEP4(Invitrogen，Burlington，ON)中，以产生质粒 EGFRvIII-RbFc/pCEP4。
3.产生293F EGFRvIII-RbFc稳定细胞系：
用如下方法将质粒EGFRvIH-RbFc/pCEP4通过磷酸钙转染引入293F细胞 (Gibco，Grand Island，NY)：转染前一天，1x106293F细胞被平板接种到明胶覆盖 的100mm组织培养基培养皿中，并在5％CO2、37℃下培养。转染前，用10ml新 鲜非选择性介质(DMEM/F12，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素G， 100U/ml MCG链霉素)培养细胞2-3小时。在微离心管中制备转染试剂，如下：10μg 的DNA(EGFRvIII-RbFc/pCEP4)与62μl的2M磷酸钙混合，并用去离子水定容到 500μl。用另一移液管吸取500ul的2XHBS用于转移所述转染试剂。
逐滴将移液管中的溶液加入细胞，同时为保持合适的pH值，将细胞置于5％CO2培养箱中直至进行转染。转染后15-20小时，用PBS洗涤细胞并用10ml新鲜293F 非选择性介质喂养细胞。用胰蛋白酶48-72后转染收获表达的细胞，并将细胞以 0.08x104细胞/孔平板接种到96孔板，置于293F选择性介质(DMEM/F12，10％FBS， 2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素G，100U/ml MCG链霉素，250ug/ml湿霉素)中14 天。
使用1ug/ml的抗-EGFR抗体E763(美国专利第6,235,883号)作捕捉抗体并用 1∶100稀释的山羊抗-兔IgG HRPO(CalTag)检测，通过ELISA筛选湿霉素抗性克 隆，。
用如下方法制作用于抗体滴定(实例3)的EGFRvIII肽-OVA：
使用来自Pierce(#20291)的经预称量的DTT还原207μg EGFRvIII PEP3。使用 100μL去离子水溶解小瓶7.7mg的经预称量的DTT。将DTT贮存液加入EGFRvIII PEP3。使用pH 7.4的PBS将反应液定容到600μL。室温下旋转反应液30分钟。
通过称量5克G10葡聚糖凝胶珠子并加入40mlPBS，混合并在室温下静置10 分钟，然后以1000rpm离心珠子10分钟制成G10管柱。除去上清液，并再加入20ml 的PBS。将珠子在1000rpm下离心10分钟。除去上清液，加入足够量的PBS以产 生50％G10葡聚糖凝胶珠子的悬浮液。在5ml旋转柱中加入5ml所述50％悬浮混 合物，随后将该柱置于14ml聚丙烯管中。将柱子在1000rpm下离心3分钟。另外 再加入3ml的PBS，然后再将柱子在1000rpm下离心3分钟。更换新的聚丙烯管， 这样所述柱子就可以使用了。
从还原肽中移除DTT。在将肽还原的30分钟反应之后，向每个柱子中加入300 μL的还原肽。将柱子在1000rpm下离心3分钟。另外再向每个柱子中加入250μL 的PBS，然后再在1000rpm下离心3分钟。将还原肽收集到14ml的聚丙烯管中。
将所述还原肽与用马来酰亚胺激活的OVA连接，并收集到微量离心管中。将 2mg的马来酰亚胺激活的OVA用马来酰亚胺结合缓冲液溶解(Pierce：77126， Rockford IL)以制成10mg/ml贮存液。将414μg的马来酰亚胺激活的OVA加入微 量离心管中的还原肽中。向反应中加入500μL马来酰亚胺结合缓冲液。将反应液 在室温下培养2小时并随后加入2mg的半胱氨酸以猝灭可能存在的任何活性马来酰 亚胺基团。室温下允许所述半胱氨酸再反应30分钟。将所述偶联物使用pH 7.4的1 xPBS洗涤并用10K离心柱离心3次。这去除了没有与OVA结合的所有自由肽和 自由的半胱氨酸。使用凝胶加样吸头将所述结合物从离心柱上取下并加入微量离心 管中。最后，使用pH 7.4的1XPBS将结合物定容到期望浓度。所述结合物的摩尔 比为14.5∶1(肽∶OVA)。
实例2
通过杂种细胞产生制造抗-EGFRvIII抗体
将产生具有γ-1恒定区的抗体的八只小鼠(XenoMouse Gl小鼠)在第0天免疫， 然后对于此方案要在第11、21、32、44和54天加强，然后在第58天进行融合。所 有免疫均通过在尾根部皮下给药和腹腔给药的方式注射。第0天免疫是用1.5x107B300.19/EGFRvIH转染的细胞(实例1A)悬浮在与完全Freunds佐剂(CFA)(Sigma， St.Louis，MO)1∶1v/v混合的无致热原的DPBS中完成的。第11、21和32天加强 是用1.5x107B300.19/EGFRvIII转染的细胞在与不完全Freunds佐剂(IFA)(Sigma， St.Louis，MO)1∶1v/v混合的DPBS中完成的。第44天加强是用与IFA1∶1v/v混 合的5μg的PEP3(EGFRvIII肽)-KLH结合(实例1)完成的，且最后的加强是用 没有佐剂的DPBS中5μgPEP3(EGFRvIII肽)-KLH结合完成的。
在第58天，对小鼠实施安乐死，随后回收其腹股沟和腰椎淋巴结。使用组织粉 碎机通过机械破坏从淋巴结中释放出淋巴细胞，随后通过CD90阴性选择除去T细 胞。通过将洗涤并富集的B细胞和购自ATCC，cat#CRL 1580(Kearney et al，J. Immunol.123：1548-1550(1979))的非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞以1∶1的比 例混合而进行融合。此细胞混合物通过以800g离心被轻轻地沉淀。彻底去除上清液 后，用2-4ml链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，cat.#53702，0.5mg/ml在PBS中)处 理不超过2分钟。随后，加入3-5ml FBS终止酶活性，用电细胞融合溶液ECFS(0.3M 蔗糖，Sigma，Cat#S7903，0.1mM醋酸镁，Sigma，Cat#M2545，0.1mM醋酸钙，Sigma， Cat#C4705(St.Louis，MO))定容至40ml。
离心后除去上清液，通过在40ml ECFS中再次悬浮洗涤细胞。重复洗涤步骤， 再次用ECFS悬浮细胞以达到2x106细胞/ml的浓度。使用融合产生器(型号ECM2001， Genetronic，Inc.，San Diego，CA)进行电-细胞融合。所用的融合室大小为2.0ml，并 使用下列仪器设置：比对条件：电压：50V，时间：50s，膜破裂条件：电压：3000V， 时间：30μs，融合后固定时间：3s。融合后，在DMEM(JRH Biosciences)、15％ FCS(Hyclone)并含有HAT的溶液中悬浮细胞，并加入L-谷氨酰胺、青霉素-链霉 素、OPI(草酰乙酸、丙酮酸、牛胰岛素)(均购自Sigma，St.Louis，MO)和IL-6 (Boehringer Mannheim)在37℃及10％CO2空气中培养。
将细胞以4x104细胞/孔平板接种到平底96孔组织培养板上。在转移到HT(次 黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)补料介质前，培养被保存在HAT(次黄嘌呤、氨喋呤 和胸腺嘧啶脱氧核苷)补料介质中2星期。通过在HAT介质的存活选择杂种细胞， 并用ELISA筛选上清液的抗原活性。ELISA格式需要在抗原涂覆平板(作为计数筛 选的EGFRvIII肽-OVA涂覆平板和野生型EGFr peptide-OVA涂覆平板)上的培养上 清液并使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人类IgG检测EGFRvIII特异结合 (见表2.1)。
表2.1
应注意到，检测到至少四个抗原特异杂种细胞：13.1、13.2、13.3和13.4。这 些杂交瘤在ELISA检定中呈阳性，通过在经稳定转染的表达EGFRvIII的300.19 细胞相对于300.19未经转染母细胞的FACS证实EGFRvIII特异性。
使用有限稀释平板接种在选择的抗原阴性孔上进行克隆。通过观察板检查单克 隆抗体生长的存在，通过抗原特异性ELISA筛选来自单克隆孔的上清液并用上文描 述的FACS验证。使用Luminex仪器通过多元ELISA检定高活性克隆从而检验人类 γ和κ链的纯度。基于ELISA和FACS检定中EGFRvIII的特异性，选择克隆13.1.2 为进一步筛选和分析最有希望的候选。图3L中展示了13.1.2抗体的重链和轻链的 核苷酸序列和氨基酸序列，且SEQ ID NO 137和139是重链和轻链核酸的而138和 140为重链和轻链氨基酸序列的。此外，在图4和5中展示13.1.2重链和轻链序列 和其所来自的生殖细胞系的序列的比较。
实例3
通过使用XenoMax技术产生抗体
XenoMouse动物的免疫
抗人类EGFRvIII的人类单克隆抗体是通过逐步免疫产生具有γ-1恒定区抗体的 XenoMouse小鼠(XenoMouse Gl小鼠)、产生具有γ-2恒定区抗体的XenoMouse 小鼠(XenoMouse XMG2小鼠)和产生具有γ-4恒定区抗体的(XenoMouse G4小 鼠)。
为通过XenoMax技术产生mAb，XenoMouse Gl组和XMG2组小鼠被用 EGFRvIII PEP3(实例1A)和表达EGFRvIII的300.19细胞(实例1B)、或用EGFRvIII 蛋白(EGFRvIII-ECD)(Dr.Bigner，Duke University)的细菌表达的细胞外结构域 和表达的EGFRvIII300.19细胞、或用EGFRvIII兔Fc融合蛋白(EGFRvIII-RbFc)(实 例1C)和表达EGFRvIII的300.19细胞、或通过爪垫(FP)仅用EGFRvIII-RbFc、 或通过皮下注射在尾基部和腹腔(BIP)免疫。
对于爪垫免疫，初始免疫每只小鼠使用或不使用10x106表达EGFRvIII的300.19 细胞且使用或不使用与Titermax金(Sigma，Oakville，ON)以1∶1混合的10μg的 EGFRvIII PEP3或EGFRvIII-ECD或EGFRvIII-RbFc。随后的加强使用初始免疫所用 免疫原剂量的一半。前4次加强是通过将免疫原与明矾(Sigma，Oakville，ON)混合 注入小鼠，过夜吸收，每只小鼠如下表3.1所示。然后注入Titermax中的相应反应 原，再注入明矾，随后在PBS中的免疫原的最后一次加强如下表3.1所示。特别地， 在第0、3、7、10、14、17、21和24天免疫动物。在第19天对动物取血以获得免 疫血清并确定收获选择的滴定度。在第28天收获动物。
表3.1爪垫免疫时间表
如在爪垫免疫中描述的，初始BIP免疫每只小鼠用相应的免疫原以1∶1v/v与 完全Freund氏佐剂(CFA，Sigma，Oakville，ON)混合。随后的加强首先每只小鼠使 用相应的免疫原1∶1与不完全Freund氏佐剂(IFA，Sigma，Oakville，ON)混合进行， 随后是每只小鼠用PBS的最后加强。如下表3.2所示，在第0、14、28、42、56和 75(最后加强)天免疫动物。在第63天对动物取血以获得免疫血清并确定收获选择 的效价。在第78天收获动物。
表3.2Bip免疫时间表
通过效能确定选择收获的动物
通过ELISA确定抗-hEGFRvIII抗体的效价将EGFRvIII-RbFc(2.5μg/ml)或对照 RbFc(2μg/ml)或EGFRvIII肽-OVA(2μg/ml)(实例1)或对照OVA(4μg/ml)涂到Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96孔板(Corning，Acton，MA)上四度过夜。除去 包含游离抗原的溶液并对所述板用紫外光(365nm)处理4分钟(4000微焦耳)。 用蒸馏水洗涤所述板五次。双份1∶100最初稀释的从EGFRvIII免疫的动物或首次用于实验的动物获得的血清1∶2稀释后用2％milk/PBS滴 定。最后一个孔留空。用蒸馏水洗涤所述板五次。室温下以1μg/ml的终浓度加入山 羊抗人类IgG Fc特异辣根过氧化物酶(HRP，Pierce，Rockford，EL)结合的抗体1小 时。用蒸馏水洗涤所述板五次。加入TMB显色底物(Gaithersburg，MD)30分钟将 板显色，加入1M磷酸终止ELISA。动物个体的特异效价由450nm时 的光密度确定并在表3.3和3.4中展示。该效价表示免疫血清的倒数稀释，因此该 数值越大则体液免疫对hEGFRvIII的反应越强烈。
对于通过在尾基部皮下注射和腹腔注射的小鼠，效价的确定正如上文所述，除 了涂有EGFRvIII-RbFc(2.0μg/ml)或对照RbFc(2.5μg/ml)的平板。
表3.3
基于血清学，表3.3中所有第5组的XenoMouse动物和自第6组的XenoMouse 的动物0743-5被选择做XenoMax收获。
表3.4
基于表3.4中的血清学数据，XenoMouse动物(0695-1、0695-3和0695-4)被选做收 获。
B细胞的选择
来自上述动物的B细胞被收获并培养。分离出分泌型EGFRvIII-肽特异性抗体，如 在Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7843-7848(1996)中的描述。ELISA被用 于识别一级EGFRvIII-肽-OVA-特异的孔。来自XenoMouse动物以500或150或50细胞 /孔的密度在24596孔板中培养出了约5百万个B细胞，这些细胞在EGFRvIII-肽-OVA 上被筛选以识别抗原特异性孔。大约有515个孔在背景上显示出明显的OD，在表3.5 中展示了代表样品。
表3.5
OD＞0.5的244个EGFRvIII-肽-OVA-Elisa阳性孔再次在EGFRvIII-肽-OVA上并在 OVA上筛选以验证它们的EGFRvIII-特异性。在表3.6中展示这些结果的一个代表性实 例。
表3.6
有限抗原检定和分析
有限抗原分析是一种将B细胞培养基上清液中抗原特异的抗体与所有其它抗原特 异抗体亲和力分级的方法。当所涂的抗原很少时，仅仅最高亲和力的抗体能够在平衡状 态下与任何可检测水平相结合。(见(例如)国际专利申请案WO 03/48730)
EGFRvIII肽-OVA被以三个浓度7.5ng/ml，1.5ng/ml和0.03ng/ml涂到平板上，并 在96孔板上4℃过夜。在向平板中加入含有0.05％叠氮化钠的50ul的1％牛奶溶于PBS 的溶液前，每个平板用蒸馏水洗涤5次，然后向每个孔中加入4μl的B细胞上清液。室 温下置于摇床中18小时后，再次用蒸馏水洗涤平板5次。每孔中加入50ul的1μg/ml 的山羊抗人类(Fc)-HRP。室温下1小时后，再次用蒸馏水洗涤平板5次，并向每孔中 加入50μl的TMB。通过向每孔中加入50uL 1M的磷酸终止反应，并在波长451nm下阅 读平板，结果在表3.7中展示。
表3.7
将有限抗原分析产生的结果与在高抗原检定中获得的总OD值作比较。通过将在有 限抗原检定中获得的OD值比上在高抗原检定中获得的OD值，完成亲和力的相对分级。 具有高比率的抗体将具有高的亲和力。表3.7展示基于有限抗原检定OD值与高抗原检 定OD值之比分级的B细胞培养基上清液的样品。
通过FMAT的幼稚细胞结合检定
分析EGFRvIII肽-OVA-Elisa阳性孔上清液与NR6细胞(NR6M细胞)上稳定表达 的EGFRvIII的天然形式结合的能力(见Batra等人Epidermal growth factor ligand-independent，unregulated，cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6(10)：1251-9(1995))。NR6M细胞以每孔8000 细胞的密度播种，并在96孔FMAT板中过夜培养。然后除去并在孔中剩余15μl的介质。 在孔中加入15μl的B细胞培养基上清液，然后以终浓度为1μg/ml加入15μl抗人类IgG Fc Cy5。然后将其放在4℃下培养2小时。用150μlPBS洗涤细胞，并在FMAT上阅读 之前进行固定。以总萤光密度表示结果(表3.8)。人类抗-EGFRvIII mAb 13.1.2被用作阳 性对照，其起始浓度为终浓度1μg/ml，阴性对照为相同浓度的PK 16.3.1。244个样本中 有134个被测试为与NR6M细胞结合，其中62具有大于8000的总萤光值，这134结合 中有6个假阳性。
在NR6Wt细胞(NR6细胞表达EGF受体)上做相同的天然结合检定(见Batra等 人.Epidermal growth factor ligand-independent，unregulated，cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6(10)：1251-9(1995)) 以排除因结合到Wt受体的结合(表3.8)。ABX-EGF被用作阳性对照且相同浓度的PK 16.3.1被用作阴性对照抗体。134个NR6M结合体中有3个与NR6Wt细胞紧密结合。 244个与Elisa中的EGFRvIII肽结合的孔中有190个孔也结合到细胞上的天然形式。表 3.8中给出了实例。
表3.8
在表3.8中，来自孔187A4中的上清液识别为Wt结合体且141C6与NR6M细胞结 合是的假阳性。孔129H6和183E11是没有天然结合的强肽结合体。
内在化检定
进一步检定前60个天然结合B细胞培养基上清液的内在化受体的能力。NR6M细胞 被以8000细胞/孔的密度接种到96孔FMAT板上并过夜培养。除去介质，并双份地在总 体积30μ1介质中加入10-15μl B细胞培养基上清液。然后，加入15μl的第二抗体 (终浓度为1.5μg/ml的SS Alexa 647抗人类IgG Fab)并将该混合物在冰上培养1小 时。使用无关B细胞培养基缓冲液以了解培养基介质的效果。人类抗-EGFRvIII mAb 13.2.1被用作阳性对照，其起始浓度为终浓度1μg/ml，阴性对照为相同浓度的PK 16.3.1(人类抗KLH IgG2抗体)。培养后，用冷PBS洗涤细胞，在所有孔中加入50μl 介质，一个复本在37℃培养30分钟，而另一复本仍在冰上培养。除去培养介质后，在 37℃培养组加入100ul冷的50mM谷胱甘肽而在另一组加入100ul冷的介质，两组均放 置冰上1小时。然后用100μl冷的PBS洗涤细胞，随后与1％多聚甲醛混合并在FMAT中 阅读。结果以％内在化表示，以谷胱甘肽/没有谷胱甘肽时的总萤光值x100计算总萤光 值。在表3.9中给出代表性信息。
表3.9
EGFRvIII-特异性溶血蚀斑试验
进行本试验需要许多专用试剂。用如下方法制配这些试剂。
1.绵羊红血细胞的生物素酰化(SRBC)。SRBC被贮存在RPMI介质中作为25％的 贮存液。通过将1.0ml的SRBC等分到新微量离心管中获得装满250μl SRBC的细胞小 球。在微离心机中用8000rpm(6800rcf)的脉冲旋转沉淀SRBC，吸去上清，用1.0ml pH 8.6的PBS将沉淀重新悬起，再重复离心。重复洗涤循环2次，然后将SRBC沉淀转移 到15ml塑料管并用pH 8.6的PBS定容至5ml。在单独的50ml塑料管中，向45ml pH 8.6 的PBS中加入2.5mg的Sulfo-NHS生物素。一旦生物素完全溶解，就加入5ml的SRBC， 并在常温下旋转该管1小时。以3000rpm离心SRBC 5分钟，并吸掉上清。将生物素酰 化的SRBC转移到微量离心管中，并用上述方法用pH7.4的PBS洗涤3次，然后在15ml 塑料管中用免疫细胞介质(RPMI 1640)定容至5ml(5％B-SRBC贮存液)。需使用前， 将贮存液在4℃保存。
2.用链霉抗生物素蛋白(SA)涂覆B-SRBC。将1ml的5％的B-SRBC贮存液转移到 新微量离心管中。将B-SRBC细胞如上所述洗涤3次，并再悬浮于1.0ml的pH 7.4的 PBS中，以产生5％(v/v)的最终浓度。加入10μl 10mg/ml的链霉抗生物素蛋白(CalBiochem， San Diego，CA)贮存溶液，在管内混合并在常温下旋转20分钟。重复洗涤步骤并用pH 7.4 的1ml的PBS将SA-SRBC再悬浮(5％(v/v))。
3.用EGFRvIII涂覆SA-SRBC。用生物素酰化的10μg/ml的EGFRvIII肽-OVA涂覆 SA-SRBC，混合并在常温下旋转20分钟。用上述方法用1.0ml的pH7.4的PBS洗涤SRBC 两次。用RPMI(+10％FCS)再悬浮EGFRvIII涂覆的SRBC并定容至终浓度5％(v/v)。
4.通过免疫萤光(IF)确定EGFRvIII肽-SRBC的质量。10μl的5％SA-SRBC和10μl 的5％EGFRvIII肽涂覆的SRBC被分别加入独立的含有40ul的PBS的新1.5ml微离心管 中。以45μg/ml的浓度将对照人类抗EGFRvIII抗体加入每个SRBC样品中。将这些管 在常温下旋转25分钟，随后用100μl的PBS洗涤细胞三次。用50μl的PBS将细胞再悬 浮，并与40mcg/mL的与Alexa488(Molecular Probes，Eugene，OR)连接的人类IgG Fc抗 体一起培养。这些管在常温下旋转25分钟，并随后用100μl的PBS洗涤，并用10μl的 PBS将细胞再悬浮。将10μl染色的细胞点到干净的玻璃显微镜载玻片上，盖以玻璃盖玻 片，在萤光下观察并在任意0-4的范围计数。
5.浆细胞的制备。收获先前经多种试验确定含有分泌感兴趣的免疫球蛋白的B细胞 克隆的单个微量培养孔的内容物。使用100-1000μl的自动移液器通过加入37C RPMI(10％FCS)收集所述孔的内容物。用移液管将细胞再悬浮，然后转移到新的1.5ml 微量离心管中(最终体积约500-700μl)。室温下在微量离心机中以2500rpm(660rcf) 的转速离心细胞1分钟，并随后以180度旋转该管并以2500rpm的转速再次离心。吸取 冰冻介质并用100μlRPMI(10％FCS)再悬浮细胞，并离心。重复用RPMI(10％FCS)洗涤， 并用60μl RPMI(10％FCS)再悬浮细胞并在使用前置于冰上保存。
6.浆经胞的显微操作。提前用硅树脂边缘准备玻璃载玻片(2x3英寸)并允许在常温下 过夜保存。使用前，用约5ul的SigmaCoat(Sigma，Oakville，ON)均匀擦拭玻片的表面， 干燥后剧烈地擦拭。向每个60μl的细胞样品中加入60μl的EGFRvIII肽涂覆的SRBC(5％ v/v贮存液)，在RPMI(10％FCS)中制备的4x豚鼠补体(Sigma，Oakville，ON)贮存液和4x 增强免疫血清贮存液(用10％FCS在RPMI中1∶150配制的)。将混合物(10-15μl)滴 到准备好的玻片上并用未稀释的石蜡油覆盖液滴。将玻片在37℃下至少培养45分钟。 从蚀斑识别EGFRvIII特异性浆细胞并通过显微操作回收(见表3.10).
表3.10
单细胞PCR、克隆、表达、纯化并鉴定重组抗EGFRvIII抗体。
The genes encoding the variable regions were rescued by on the通过在单显微操作 浆细胞上进行RT-PCR回收编码可变区域的基因。提取mRNA并进行逆转录PCR以产 生cDNA。编码可变重链和轻链的cDNA被用聚合酶链反应特异地扩增。将人类可变重 链区克隆到IgG1表达载体中。通过将人类IgG1的恒定结构域克隆到pcDNA3.1+/Hygro (Invitrogen，Burlington，ON)的多个克隆位点中产生此载体。将人类可变重链区克隆到 IgK表达载体中。通过将人类IgK的恒定结构域克隆到pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen， Burlington，ON)的多个克隆位点中产生此载体。The heavy chain and the light chain expression vectors were then co-lipofected into a 60mm dish of 70％confluent human embryonal kidney 293 cells and the transfected cells were allowed to secrete a recombinant antibody with the identical specificity as the original plasma cell for 24-72 hours.从HEK293 细胞收获上清液(3mL)并用夹心ELISA特异地检测人类IgG的方法证明完整抗体的分泌 (表3.11)。使用ELISA通过重组抗体与EGFRvIII的结合评定特异性(表3.11)。
表3.11
分泌ELISA测试如下进行。对于抗体分泌，将2μg/mL的山羊抗人类IgG H+L和 用于抗原结合的1.5μg/ml的EGFRvIII-Rab Ig Fc融合蛋白涂覆到Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96孔板上并保持在四度过夜。用蒸馏水洗涤所述板五次。 从未稀释的小型脂质转染上清液对7个孔1∶2滴定重组抗体。用蒸馏水洗涤所述板五次。 向用lug/ml Rb抗Hu Fc在室温下1小时检测的分泌平板和结合平板以1μg/mL的终浓度 加入山羊抗人类IgG Fc特异HRP结合抗体常温保持1小时。用蒸馏水洗涤所述板五次。 加入TMB 30分钟将板显色，加入1M磷酸终止ELISA。分析每个ELISA平板以确定每 孔在450nm时的光密度。
测序和序列分析
在两个方向对克隆的重链进行测序，并分析以确定抗体的生殖细胞系序列来源并识 别与生殖细胞系序列的改变。在附图中提供了这些序列。3A-3K和(SEQ ID NO：34-55). 在附图4-7中提供了每个重链和轻链序列与其来源的生殖细胞系序列的比较。另外，在 附图中对来源于杂种细胞的13.1.2抗体的序列和其生殖细胞系序列进行了比较4和5。
从本文的讨论应了解，每个131抗体和13.1.2抗体均具有对EGFRvIII很高的亲和 性，其被细胞内在化，且当与毒素结合时表现出很高的细胞杀伤效率。有趣的是，每个 抗体，即使其产生自XenoMouse小鼠的不同的免疫或使用不同的技术，均来源于非常相 似的生殖细胞系基因。然而基于表位的定位(本文中有所讨论)，每个抗体看来与EGFRvIII 分子上明显不同的表位结合且在对结合必要的EGFRvIII上具有显著不同的残基。这些 结果指示，生殖细胞系基因的运用对针对EGFRvIII的抗体治疗学很重要，且微小的改 变可以更改抗体的结合和效果的事实允许了对抗体和其他基于这些结构发现的抗体治 疗学的进一步设计。
抗-EGFRvIII mAbs与细胞上表达的天然EGFRvIII结合
在这个事例中，测量抗-EGFRvIII抗体与NR6M细胞的结合。特别地，检定来源于 XenoMax的未定量的IgG1上清液与NR6M和NR6WT的结合能力。以10000/孔的密度 接种细胞并在37℃下FMAT 96孔板中培养过夜。除去介质并加入40μl小型脂上清液来 滴定，将细胞在冰上培养1小时。人类13.1.2EGFRvIII抗体和ABX EGF(E7.6.3，美国专 利第6,235,883号)抗体作为阳性对照加入。PK 16.3.1抗体用作阴性对照。用冷的PBS 洗涤细胞，以1μg/ml、40μμl/孔的密度加入第二抗体(SS Alexa抗人类IgG Fc)并在冰 上培养1小时。然后用冷PBS洗涤细胞，再固定然后用FMAT阅读。通过计数对NR6 WT 的筛选检测所有抗体的结合特异性。
重组抗-EGFRvIII抗体的纯化。
为了大规模的生产，重链和轻链表达载体(2.5μg每链/平皿)被脂质转染到十个 100mm平皿中70％铺满的HEK293细胞中。转染细胞在37℃下培养4天，收获上清液 (6mL)并用6ml的新鲜介质替代。在第7天，除去上清液并用初始收获合并(自10 个平板共120ml)。使用蛋白质-A琼脂糖(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)亲和 层析(1mL)从上清液中纯化每个抗体。用500mcL pH2.5的0.1M甘氨酸将抗体从蛋白质 -A柱上洗脱。洗脱液在pH7.4的PBS中透析，并进行滤膜灭菌。用非还原SDS-PAGE 分析抗体以评定其纯度和产量。也用OD250的紫外线分析测量浓度。
通过重组抗-EGFRvIII mAb的EGFRvIII受体内在化
如前所述，表达、纯化并定量XenoMax来源的IgG1重组抗体。进一步检定抗体在 NR6M细胞内在化EGFRvIII受体的能力。250,000NR6M细胞与第一抗体(SC95、SC131、 SC133、SC139、SC150、SC170、SC211、SC230、SC250和作为对照的人类13.1.2)一 起以0.25μg/ml的浓度在96孔v底平板上在冰上培养7分钟，有这样的三个复本。用 冷的10％FCS的PBS洗涤细胞并加入3μg/ml Fab的第二抗体(SS Alexa抗人类IgG Fab) 并在冰上培养7分钟。用冷的含有10％FCS的PBS洗涤细胞一次并随后用冷介质再悬浮。 然后，三个复本中的两组在37℃培养而剩下的一组在4℃培养1小时。此后，在4℃培 养的细胞和在37℃培养的一组细胞在冰上用谷胱甘肽处理(如前文所提及)1小时。然 后用100μl冷的含有1％FCS的PBS洗涤并再悬浮细胞，并用FACS分析。从自FACS 分析获得的几何均数计算％内在化[(37℃用谷胱甘肽处理的平均数-4℃用谷胱甘肽处理 的平均数)/(37℃不用谷胱甘肽处理的平均数-4℃用谷胱甘肽处理的平均数)]。NA意味着 进行了FACS分析但数据并不在表3.12中提供。
表3.12
13.1.2是一个通过先前针对EGFRvIII表位的杂种细胞产生(实例2)而产生的抗体 并作为本试验中的一个阴性对照。表3.12的这些结果显示了两亚组抗体：有效地内在化 的那些(70-80％)和没有内在化的那些(22％或更少)。
实例4人类抗EGFRvIII抗体的表位的定位
为了确定本发明的特定抗体结合的表位，抗EGFRvIII的6个人类的和3个鼠科动 物的单克隆抗体(mAb)使用来自特异EGFRvIII的肽序列的合成肽进行定位。定位的 抗体为来源于人类杂种细胞的抗EGFRvIII 13.1.2抗体、来源于人类XenoMax的抗 EGFRvIII 131、139、250、095和211抗体以及鼠科动物抗EGFRvIII H10、Y10和B9 抗体。
使用的方法为常规SPOT肽阵列(Sigma Genosys)以研究人类抗EGFrVIII抗体与其肽 表位间的分子相互作用。SPOTs技术是基于以适合抗体表位系统分析的肽固相合成。常 规阵列寡肽的合成可从Sigma-Genosys购得。从Sigma-Genosys订购来自EGFRVIII可 变氨基酸序列的重叠寡肽的一肽阵列。
一系列九个12-mer肽作为聚丙烯膜上的蚀斑合成。肽阵列跨EGFrVIII序列的残基 1-20，代表胞外wtEGFr结构域的氨基酸6-273的缺失，和在连接点一甘氨酸(G)的产 生。每个连续肽用一个残基衍生自前一个肽，产生一阵列寡肽的嵌套的、重叠的库。带 有9个肽的膜与9个不同抗EGFrVIII抗体(1μg/ml)反应。通过一酶连接免疫吸附试验 使用结合的HRP第二抗体然后用增强的化学发光(ECL)评定mAb与膜结合肽的结合。 在表4.1中展示所用的阵列。
表4.1蚀斑阵列序列：
1.ALEEKKGNYVVT(SEQ ID NO：72) 2.LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO：59) 3.EEKKGNYWTDH(SEQ ID NO：73) 4.EKKGNYWTDHG(SEQ ID NO：74) 5.KKGNYWTDHGS(SEQ ID NO：75) 6.KGNYWTDHGSC(SEQ ID NO：76) 7.GNYWTDHGSCV(SEQ ID NO：77) 8.NYVVTDHGSCVR(SEQ ID NO：78) 9.YVVTDHGSCVRA(SEQ ID NO：79)
此外，通过组和丙氨酸筛选定位功能性表位。I在这一过程中，使用一组合丙氨酸 筛选方法识别EGFrVIII肽中对与抗EGFRvIII mAb相互作用必需的氨基酸。为达到这目 标，订购第二组SPOT阵列用于丙氨酸筛选。如上述扫描12个残基中的有丙氨酸取代 的可变肽的面板。蚀斑#1，未变异的序列，为抗体结合的一个阳性对照。在表4.2中展 示所用的阵列。
Table 4.2丙氨酸筛选阵列：
1.LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO：59) 2.AEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO：80) 3.LAEKKGNYVVTD(SEQ ID NO：81) 4.LEAKKGNYVVTD(SEQ ID NO：82) 5.LEEAKGNYVVTD(SEQ ID NO：83) 6.LEEKAGNYWTD(SEQ ID NO：84) 7.LEEKKANYVVTD(SEQ ID NO：85) 8.LEEKKGAYWTD(SEQ ID NO：86) 9.LEEKKGNAVVTD(SEQ ID NO：87) 10.LEEKKGNYAVTD(SEQ ID NO：88) 11.LEEKKGNYVATD(SEQ ID NO：89) 12.LEEKKGNYVVAD(SEQ ID NO：90) 13.LEEKKGNYVVTA(SEQ ID NO：91)
所有9个mAb对人类EGFrVIII的表位通过SPOT程序定位识别。所有9个抗体均 可与所述肽反应。在表4.3中显示了用3个鼠科动物抗体和6个来源于XenoMouse小鼠 的人类抗体获得的结果。突出显示的残基为我们变异成丙氨酸且通过测试的抗体取消结 合的残基。因此这些为结合到抗体上的相关残基。
表4.3
EGFR A T C V K K C P R N Y V V T D H G S C V R A SEQ ID NO：92 EGFRvIII L E E K K G N Y V V T D H G S C V R A (SEQ ID NO：93) 13.1.2 E E K K G N Y V V T (SEQ ID NO：94) 131 E E K K G N Y V V T (SEQ ID NO：94) 139 L E E K K G N Y V V T D (SEQ ID NO：95)
250 L E E K K G N Y V V T D (SEQ ID NO：95) 095 Y V V T D H (SEQ ID NO：96) 211 Y V V T D (SEQ ID NO：97) H10 Y V V T D (SEQ ID NO：97) Y10 E E K K G N Y V V T (SEQ ID NO：98) B9 G N Y V V T (SEQ ID NO：99)
表4.3中展示的有阴影的氨基酸为对抗体识别最相关的抗原识别位点的残基。使用 重叠序列的肽精确定位所有十个mAb的表位的最短长度，且通过用丙氨酸系统性地取 代表位中的每个残基确定mAb与变异表位结合的容许度。
在表4.4中，总结了抗体的附加特征。特别地，非还原或还原条件下在聚丙烯酰胺 凝胶电泳的Western平板中测试亚组抗体对肿瘤细胞系裂解液的结合。还包括纯化的重 组蛋白。在还原和非还原条件下结合的抗体表明表位为线性的。样品识别：
EGFRvIII-兔Fc融合蛋白
H1477-用EGFRvIII表达构建转染的H80人类肿瘤细胞系。这些细胞表达EGFR和 EGFRvIII。
EGFR-纯化的野生型EGFR蛋白。
A431-仅表达野生型EGFR的人类肿瘤细胞系
A549-仅表达野生型EGFR的人类肿瘤细胞系
H80-仅表达野生型EGFR的人类肿瘤细胞系
EGFR Biacore-作为对特异性的高敏感测试，在Biacore中测试mAb与纯化的EGFR 的结合
表4.4
结果显示大多数mAb具有本质上相同的结合特异性，七个mAb显示与可变 EGFrVIII的结合特异性，同时在纯化蛋白的Western印迹和A431细胞的裂解液中2个 mAb与野生型EGFr(鼠类H10和人类211)交叉反应。注意，然而，尽管在Western印 迹中抗体211与幼稚及还原的纯化EGFRvIII均结合，其与非还原蛋白的结合稍强。在 对A431细胞裂解液的测试中，抗体211在非还原样品中与一群野生型EGFR强烈结合， 但在还原样品中没有信号。这表明抗体211的结合是由于在野生型EGFR中的构象表位， 且在EGFRvIII中表现不同。5个mAb的表位在跨EGFRvIII可变特异性甘氨酸残基的残 基2-12内，然而4个mAb(包括H10和211)跨EGFRvIII和野生型EGFr共有的残基 7-16。在FACS中抗体131与A431和A549细胞结合。这些细胞对EGFRvIII表达呈阴 性而对EGFR表达呈阳性。在Western中抗体131不与非还原或非还原纯化的EGFR或 还原或非还原A43及A549细胞裂解液结合表明抗体131可能与在一些人类肿瘤细胞系 的细胞表面表达的可变EGFR结合。这些变体对变性敏感。
实例5
体外抗EGFRvIII抗体的特异性
通过对用野生型或变异EGFR转染的NR6细胞进行FACS分析确定纯化抗体的特异 性。用5μg/ml对应抗体将细胞在冰上培养1小时，用FACs缓冲液洗涤，并随后用PE 结合的山羊抗人类IgG培养。
实例6
与扩增的EGFR的交叉反应性
显示针对可变EGF受体的抗体在发生基因扩增的细胞上与野生型EGF受体的亚组 交叉反应(Johns等人，Int.J.Cancer.98：398，2002)。为确定人类EGFRvIII抗体识别是 否具有相似的特性，在培养基中对其识别多种细胞上的野生型EGF受体的能力进行测 试。用指定细胞系与抗体在4℃下培养。用FACS缓冲液洗涤后，加入结合有phyoerythrin 的第二抗体，并继续培养。所有分析的细胞系都表达野生型EGFR。通过抗体在A431 和SF-539细胞上而不在A498或SKRC-52细胞上的的抗体XG1-131识别野生型EGFR 的亚组。另一EGFRvIII的抗体13.1.2并不识别野生型EGFR的亚组。综合考虑这些数 据，表明仅针对变异EGFRvIII的抗体的亚组能够识别细胞表面的野生型EGRF。特定的 针对变异EGFRvIII的抗体识别野生型EGF受体的亚群的能力并不依赖于总EGFR密度 但可能表示对肿瘤细胞特异的新构象表位。针对EGFRvIII的抗体与野生型受体的亚群 交叉反应的能力可能由变异受体结点内的特异表位和对此独特决定基的抗体的亲和力 共同决定(见本文中表位定位和亲和力确定部分的结果)。
实例7体内抗EGFRvIII抗体的特异性
抗体与细胞系的结合
这些纯化抗体的特异性通过在细胞系的面板上进行FACS分析确定。细胞系使用的 是：H80-人类胶质母细胞瘤细胞系、表达高水平EGFRvIII的H1477(H80-EGFRvIII)、 A431-人类表皮肿瘤细胞系和A549-人类肺肿瘤细胞系。所有细胞系均来自Dr.Bigner除 了来自ATCC(Rockville，MD，U.S.A)的A431和A549。用10μg/ml对应抗体将细胞在 冰上培养30小时，用FACs缓冲液洗涤，并随后用来自Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA，U.S.A.)的PE结合的山羊抗人类IgG培养。在图9A-9L和10A-10D中，暗 的柱状图显示用无关IgG染色的细胞，轮廓图或白色柱状图表示相关抗体的染色。
抗EGFRvIII抗体13.1.2、131和139与转染细胞系上的EGFRvIII蛋白结合。在图 9M-9P中显示总结一些结果的图。
显示针对可变EGF受体的抗体在发生基因扩增的细胞上与野生型EGF受体的亚组 交叉反应(Johns等人，Int.J.Cancer.98：398，2002)。在这个实例中，用XG1-131和 XG1-139对A431和A549染色。图10B和图10C展示131和139具有与野生型EGFR 特定的交叉反应性，而不是仅识别H80、A431和A549细胞系的亚群。然而，此交叉反 应性仅在这些细胞系上染色的ABX-EGF(E7.6.3)的水平的10％。结果在图9A-9P和 10A-10D中提供。
针对细胞表面抗原的抗体可被用作将药物或毒素特异地输送到细胞的输送载体。如 果此抗体刺激抗原的内在化，也许在药物或毒素从抗体断裂后，药物或毒素可导致细胞 的死亡。这一机制可用于在动物或病人体内特异地杀伤肿瘤细胞。选择可以将药物输送 到细胞的抗体的方法是通过二级细胞毒性试验。在这些试验中，第一抗体与细胞表面结 合并加入与药物或毒素结合的第二抗体。如果第一抗体刺激抗原内在化，第二抗体将共 内在化，一旦药物或毒素断裂便导致细胞杀伤。
实例8二级细胞毒性试验
在下列研究中，EGFRvIII-特异抗体被用来将与第二抗体结合的毒素导向胶质母细 胞瘤细胞系(H80)和EGFRvIII转染的胶质母细胞瘤细胞系(H1477)。来自 Pharmingen(BD Biosciences Pharmingen)小鼠抗人类IgG(cat#555784)与毒素AEFP (Seattle Genetics，Inc.)和美登素(DM1，Immunogen Inc.)结合以产生mah-AEFP(鼠类 抗人类IgG-AEFP)和mah-DM1(鼠类抗人类IgG-DM1)。结合由皂草素蛋白的山羊抗人类 IgG，Hum-ZAP(TM，cat#IT-22-250，亲和纯化的山羊抗人类IgG-皂草素蛋白)是来自 Advanced Targeting Systems(San Diego，CA，U.S.A.)。H80和H1477细胞以每孔100μl 生长介质中1000细胞的浓度平板接种在96孔板上。24小时后，将第一抗体与第二抗体 1∶3混合，连续地在6个空中1∶5稀释。100μl稀释的第一抗体和毒素第二抗体混合物 以第一抗体的最终初始浓度0.1μg/ml、第二抗体的最终初始浓度0.3μg/ml加入细胞的孔 中。允许这些平板继续培养3天。在第四天，加入购自Promega(Madison，WI，U.S.A.) 的CellTiter-Glo试剂(cat#G7571)并用萤光阅读。图11A-111、12A-12I和13A-13I显 示这个实验的结果。在大多数EGFRvIII特异mAb测试中比较在HI477(填圆圈)与在 H80(填方块)的Hum-ZAP为介质的抗原特异杀伤。MAb XG1-131和XG1-139用 mah-AEFP产生抗原特异二级杀伤，在较小范围用mah-DM1。在测试的抗体中，XG1-131 至少在一个记录中比13.1.2、XG1-095、XG1-139、XG1-150、XG1-170、XG1-250和 XG1-211有更好的表现。IgG1被用作阴性对照且将抗原阳性细胞(H1477)与抗原阴性 细胞(H80)进行比较。
需要的特异杀伤的量可视特定的使用而改变。在一个实施例中，任何可能的癌细胞 的减少都是足够的。例如，0-1、1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、 70-80、80-90、90-95、95-99或100％目标细胞的减少将是足够的。在另一个实施例中， 期望的目标细胞数量的减少还是抗体组合的非特异性破坏的一个功能。例如，如果有很 少的抗体的非特异性目标和破坏，仅具有10％目标细胞数目减少的抗体/毒素组合可能就 足够了。例如，抗体/毒素混合物杀伤低于非目标群的10％。同样，特定的量将取决于特 定需要和情况。特别有用的抗体是那些对目标细胞(例如H1477)具有高选择性并与目 标细胞良好结合的。在一个实施例中，目标为EGFRvIII蛋白或其片段。在一个实施例 中，展示了人类或人源化的、可有效内在化的、对EGFRvIII蛋白或其片段特异的、与 EGFRvIII蛋白或片段紧密相连且与有效的毒素相连的抗体。
实例9二级细胞毒性试验
除了细胞毒性试验之外，还在产克隆试验中测试了EGFRvIII特异性抗体。特异 EGFRvIII抗体将与毒素结合的第二抗体导向EGFRvIII转染胶质母细胞瘤细胞系 (H1477)，毒素在细胞内被释放，且最终降低了细胞增殖形成克隆的能力。因此，当 细胞在一级和二级毒素抗体处理后被再次平板接种时，这些EGFRvIII抗体-毒素的应用 产生克隆数量的减少。在这个实例中，H80和H1477细胞被以每孔30,000细胞的密度 再次平板接种到6个平板上并过夜培养。第一抗体和二级毒素抗体以1∶3的比例混合。 将此抗体混合物以第一抗体0.5μg/ml、第二抗体1.5μg/ml的终浓度加入合适的孔中。在 37℃过夜培养。培养后，合适地处理该毒素混合物，且用1x胰蛋白酶将细胞从中分离。 细胞被计数并以每板200细胞的密度平板接种到新的6孔板中。平板接种对应每个处理 组的三个复本。在37℃培养这些平板2-3周，直至形成克隆且可以用肉眼或显微镜下识 别。吸出介质并加入5M亚甲基蓝1小时。用水洗涤平板并计数克隆。图14A和图14B 展示这个实验的结果。可见，就测试的三种EGFRvAIII抗体，mab-AEFP二级毒素抗体 抑制了克隆形成。
实例10抗EGFRvIII抗体(13.1.2)
细胞毒性试验中的直接结合
通过抗体与细胞毒药物的直接结合提供了一个抗体能够将一个药物输送到一个肿 瘤细胞的进一步证据。在下列实例中，EGRvIII抗体13.1.2直接与auristatin E MMAE， 与AEFP通过肽键结合(MMAE和AEFP均购自Seattle Genetics且在上文中有所描述)， 且与美登素(DM1)以硫醇键结合(DM1购自Immunogen且在上文中有所描述)。一 旦向表达EGFRvIII抗原H1477的细胞中加入结合物，便观察到特异的细胞毒性。不表 达抗原H80的细胞仅在当暴露于非常高浓度的抗体时才被杀伤。在图15A-15C中展示 此试验的结果。
EGFRvIII抗体与药物或毒素的直接结合是用于治疗的特别有优势的方法。因此，最 初的试验显示这样的结合确实导致表达EGFRvIII的细胞的特异杀伤。
实例11体内抗EGFRvIII抗体特性。
一种确定抗体是否能够将细胞毒性药物输送到细胞的可选方法是评价结合抗体在 体内的人类肿瘤的生长的效果。本实例提供了这样一种方法。在体外培养H1477成神经 胶质瘤细胞，通过胰蛋白酶收获，并如下文所解释埋在基质胶中。向雌性裸鼠体内皮下 注射五百万细胞，并允许肿瘤发展直至其达到约0.5cm3的大小。此时将动物随机分组， 并开始用指示浓度的结合抗体没4天一次皮下注射的处理。图16中的结果显示抗体 13.1.2当与美登素(dEGFR-DM1)或auristatin E(dEGFR-MMAE)结合时可导致胶质母细 胞瘤的退化。如果与相等的未结合的药物一同给药时，(组2)，对肿瘤生长没有影响， 说明体内定向肿瘤细胞需要抗体与毒素的结合。
上文使用的动物模型由将H1477细胞异种移植物注入裸鼠获得。将不同量的细胞单 独或与MATRIGEL一同注入8周nu/nu雌性小鼠中，几天后分析肿瘤植入。从这个分 析中，识别允许大约尺寸肿瘤的细胞数量为在MATRIGEL中约22天的五百万细胞。包 括作为对照的组G8，用于展示杀伤是抗体特异性的。包括作为阴性对照的组G7。
因此发展出下列用于毒素研究的一个方案：
第1天：在MATRIGEL中的5百万个肿瘤细胞被植入8周大雌性小鼠。第22天： 如表11.1所展示，通过I.V.每四天用抗体前药处理。
表11.1
结果在图16中展示，箭头指示药物的添加。组G1、G6和G4展示了有效的杀伤。 组G3展示较少量的杀伤。组G8和G7未展示出杀伤。在高剂量的vc-AEFP组-组G8 中可能观察到一定的毒性。这些动物接受两次250μg的处理和一次125μg的处理。
实例12在癌症患者/人类肿瘤中的EGFRvIII
EGFRvIII在人类肿瘤上的表达通过从多个癌症患者和已知特异结合EGFRvIII的2 个鼠类单克隆抗体(B9，IgG1和Y10，IgG2(Dr.Bigner，Duke University))的结合的冰冻 组织部分的染色确定。相同部分用同型匹配的对照抗体染色。表12.1中展示了从患者样 品中获得的染色结果的总结。
表12.1
肿瘤类型 样品大小(N) EGFRvIII＞+ EGFRvIII＞++ 成神经细胞胶质瘤 8 100％ 100％ 乳癌 100 31％ 24％ NSCL癌 51 47％ 39％ 头颈癌 21 42％ 38％ 前列腺癌 22 4.5％ 4.5％
EGFRvIII＞+：包括所有表达EGFRvIII的肿瘤
EGFRvIII＞++：包括至少表达10％或更多EGFRvIII的肿瘤
表达主要在细胞膜及/或细胞质上发现。显著数量的乳(31％)、NSCL(47％)和头颈 (42％)癌样本染色呈EGFRvIII阳性。在特定例子中，为了获得高质量的IHC染色，两 个抗体的使用可能比用一个抗体更好。冰冻组织样本比固定组织更好。
所述领域的技术人员应了解，在使用治疗的抗体之前测试患者以确保待处理的肿瘤 表达EGFRvIII是有利的。
实例13体内抗EGFRvIII抗体特性
实例11的方法将被用来处理肺癌和神经胶质瘤。这将通过制作动物模型广泛检测。 用于成神经胶质瘤和肺癌的动物模型如下形成：将表达wt-EGFR的肺癌细胞用EGRFvIII 转染。将细胞注入nu/nu小鼠的肺中，允许肿瘤发展到与上文可比较对阶段。抗EGFRvIII 结合物随后每1至10天(视需要)被皮下注入。将对这些癌细胞继续生长的大小、阻 碍或压抑进行监控，以确定这些抗EGFRvIII抗体和抗体-毒素结合物的效果。所述领域 的技术人员应了解，本文揭示的任何抗体都可以这么做。
实例14通过取代分析分析肽的功能特性
为了进一步解决这些对EGFRvIII表位不可缺少的氨基酸残基的识别，进行对表位 肽的氨基酸残基的取代分析。起始位点为来自实例4的序列LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO 59)。在这个实例中，定位的表位的每个氨基酸被逐个由20个L型氨基酸取代，因 此，合成所有可能的单位点类似物，并进行筛选以提供肽结合模式的详细信息。离散取 代模式被用于mAb 131 and 13.1.2的识别。结果在表14.1中总结。
表14.1
mAb 识别序列 131 EEKKGNYVVT(SEQ ID NO：57) 13.1.2 EEKKGNYVVT(SEQ ID NO：57)
其显示，mAb 13.1.2，5残基对结合(粗体)很重要，尽管只有4个残基对于mAb 131 的结合是必须的。剩下的残基被多种氨基酸取代而没有显著的结合的丢失。尽管在序列 和长度上131和13.1.2是相同的，但其结合模式不同。MAb 131的结合对残基EKNY(SEQ ID NO：60)有很强的依赖性。另一方面，数据显示残基EEKGN(SEQ ID NO：61)涉及在 mAb13.1.2的结合。
实例15mAb链改组
改组MAb131和13.1.2的重链和轻链，并将其瞬间转染到293T细胞。七十二小时 后，收集上清液并用ELISA进行分泌及EGFrVIII结合试验。
结果显示，来源于带有13.1.2κ链的131重链的表达，以及带有131κ链的13.1.2 重链的表达的抗体都表达良好，但由于两种EGFrVIII抗原的抗体不同的结合模式结合 活性下降了75％(数据未显示)。这显示了131和13.1.2mAb互补位的不同，再次暗示 在两种mAb选择的表位的结构特征是不同的。
实例16131及其互补位的分子模型化
本实例表明如何可以产生实施例蛋白的三维结构。抗体131的可变区的三维结构模 型通过一个同源模型化方法产生，所述方法使用Accelrys(San Diego，CA)的InsightII 模型化包装。根据以下所描述的表16.1的可变区的序列构建模型。残基的编号方式从轻 链氨基酸开始，并延续至重链氨基酸。
表16.1
使用抗体131的序列在蛋白数据库(Protein Data Bank)中搜索，以识别出同源抗 体及其结构。在相似与131抗体的同源抗体序列的基础上，选择了一些结构。从蛋白数 据库中选到的用于模型化样品的结构具有蛋白数据库识别号：1HEZ、2H1P、1AQK、 1DQL、1MF2和1FLR。随后重叠比对这些模板结构并用于产生这些模板的基于结构的 序列比对。随后将抗体131可变区的序列与模板序列比对。使用结构与序列的比对结果 用于产生131抗体可变区的分子模型。CDR1序列的轻链是：RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO 101)。CDR2序列的轻链是：RISRRFS(SEQ ID NO 103)。CDR3序列的轻 链是：MQSTHVPRT(SEQ ID NO 105)。CDR1序列的重链是：NYGMH(SEQ ID NO 108)。 CDR2序列的重链是：VIWYDGSDKYYADSVRG(SEQ ID NO 110)。CDR3序列的重链 是：DGYDILTGNPRDFDY(SEQ ID NO 112)。
抗体131的互作表面是根据结构模型计算的并在图17中显示。不同CDR识别如下： L1(轻CDR1)10、H1(重CDR1)20、L230、H240、L350和H360。所预测的抗体 131互作表面的一个显著特指是一个深洞。深洞主要由重链CDR2、CDR3和轻链CDR3 所环绕，并且其一小部分归因于轻链CDR1。所述洞可能是结合凹穴。在5埃的结合洞 内是残基31、37、95-101、143-147、159、162-166、169-171、211-219、221和223。 这些残基可能包含互补位并在结合EGFRvIII互补位时起到关键接触的作用。这些残基 通常还可能提供结合位点的主要结构特征。
实例17证实抗体131的模型的位点定向突变发生
本实例证明了一个方法，通过这个方法可以测试认为残基在结合中是重要的模型。 本实例还引出一些抗体变体。通过引入至mAb 131重与轻链的单独残基突变产生了131 克隆的抗体变体。随后分析这些变体以确定点突变的所替换侧链怎样影响抗原结合。
在mAb 131重与轻链进行了改变。在重链上，通过位点定向突变发生使L216改变 成R。在轻链上，V99改变成F。影响了变体抗体表达与分泌的两种突变与野生型序列 进行了比较。两种突变都引起了mAb变体结合EGFRvIII抗原的损耗。因为这些残基分 别替换成R和F引起了活性的降低，所以这证明了L216和V99可能与EGFRvIII抗原 显著的接触。当然，这些替换破坏抗体的普通结构，因此其一直是一个选择。
实例18
13.1.2及其互补位的分子模型化
13.1.2抗体可变区的三维结构模型通过一个同源模型化方法产生，所述方法使用 Accelrys(San Diego，CA)的InsightII模型化包装。使用已发表的x光晶体结构作为模 板，根据下表18.1所示的可变区序列构建模型。
表18.1
CDR1序列的轻链是：RSSQSLVHSDGNTYLS(SEQ ID NO：101)。CDR2序列的轻链 是：KISNRFS(SEQ ID NO：116)。CDR3序列的轻链是：MQATQLPRT(SEQ ID NO：118)。 CDR1序列的重链是：SYGMH(SEQ ID NO：121)。CDR2序列的重链是： VIWYDGSNKYYVDSVKG(SEQ ID NO：123)。CDR3序列的重链是：DGWQQLAPFDY (SEQ ID NO：125)。
使用抗体13.1.2的序列在蛋白数据库中搜索，以识别出同源抗体。根据其序列与抗 体13.1.2.的相似性，选择了具有蛋白数据库识别号1HEZ、2H1P、8FAB和1AQK的结 构作为模型化模板。重叠比对这些模板结构并用于产生这些模板的基于结构的序列比 对。随后将13.1.2抗体可变区的序列与模板序列比对。使用结构与序列的比对结果用于 产生抗体13.1.2可变区的分子模型。
计算模型的互作表面并在图18中显示。13.1.2模型的一个主要特征是在CDR区的 表面上具有一个长且窄的沟槽。所述沟槽由重链CDR2 140、CDR3 160和轻链CDR1 110、 CDR2 130和CDR3 150所勾画。沟槽的一段接触轻链CDR3 150的剩余部分，并且另外 一段在靠近重链-轻链界面处打开重链CDR3 160的较宽区域。所述沟槽可能是抗原的 结合凹穴。在5埃的结合洞内是残基31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、 160、163-166、172和211-221。这些残基可能包含结合EGFRvIII表位的互补位。这些 残基通常还可能提供结合位点的主要结构特征。
实例19肽与抗体的对接模型
实例14中的表位作图研究显示了需要用于结合表位至13.2.1mAb抗体接合部位的 相关氨基酸位于6-残基肽中EEKKGN(SEQ ID.NO：127)。因此，产生了这6-残基肽复合 体与13.1.2结构CDR区的对接模型。首先，产生了肽EEKKGN(SEQ ID NO：127)的 模型。除了这次使用1I8I X光晶体结构之外，与前述相似使用这个作为模板，所述晶体 结构是在蛋白数据库中识别出的。然后，这个肽结构手工放置于长沟槽内以形成起始组 装复合体。使用InsightII中扩展模块随后在构像和定向空间中自动进行Monte Carlo搜 索。通过给予每个Phi、Psi和Chi角完全旋转自由度，以允许肽构像的可弯曲性。在对 接过程中，允许5埃结合沟槽内的残基在其它抗体残基被固定的同时移动。Monte Carlo 搜索发现的似是而非的构造经刺激退火和能量最小化以达到最终复合体结构模型。对于 所获的每一个对接模型，使用InsightII包装的Discover_3模块计算抗体与肽之间的互作 能量。评估所有对接模型的互作能量，并测验具有最强全部抗体-肽互作的模型且其在图 19A与19B中显示。在本对接模型中，如图19B所示，存在6个肽EEKKGN(SEQ ID NO： 127)与抗体13.1.2间的氢键。从N末端向C末端对肽残基编号1至6。绿色虚线指示 6个氢键。形成氢键的6对氨基酸是：E2...Y172、K3...H31、K4...H31、N6...D33、N6...Y37 和N6...K55。在本对接模型中，在延伸α-链构造中肽束缚与于沟槽。肽中残基替换地面 向溶剂和抗体表面。面向结合沟槽的残基是E2、K4和N6，所述结合沟槽最显著接触抗 体。这指示这3个残基可能对于肽结合与表位作图结果一致是重要的。使用Discover 3 模块计算每个6肽残基与13.1.2抗体接合部位的互作能量，并在表19.1中显示。表19.1 显示每个6肽残基与13.1.2抗体接合部位的互作能量。所有的能量以kcal/mol的单位表 示。
具有最强互作能量的残基依次是N6、K4和E2，再一次与实验数据一致证实这些残 基在抗体-抗原互作中是抗原边的重要贡献者。这些数据提供支持对接模型的有力证据。 在本实施例中，抗体接合部位定义为5埃对接肽内的残基。包含如此定义的互补位的20 个残基是残基31-33、35、37、55、96-101、148、163、165、170、172、178和217-218。 在一个单独残基的基础上，为了评估抗体-抗原互作中抗体的每个这些残基的贡献，计算 了每个上述20个残基的互补位与肽EEKKGN(SEQ ID NO：127)间的互作能量。结果 列在表19.2中。表19.2显示每个20互补位残基与肽EEKKGN(SEQ ID NO：127)的互 作能量。所有的能量以kcal/mol的单位表示。与肽具有最强互作能量的残基是Lys55和 His31，接着是Tyr172、Ala96、Asp33、Tyr37、Leu99、Thr97、Gln98、Lys178和Asn170。
表19.1
肽残基 库仑 VdW 总计 E1 -2.013 -3.738 -5.751 E2 -10.661 -0.617 -11.278 K3 -9.816 -0.493 -10.309
K4 -11.123 -0.968 -12.091 G5 -1.241 -1.468 -2.709 N6 -16.504 -0.181 -16.685
表19.2
13.1.2残基 库仑 VdW 总计 His31 -12.835 3.033 -9.801 Ser32 2.857 -1.062 1.794 Asp33 -4.181 -0.698 -4.879 Asn35 0.253 -1.009 -0.756 Tyr37 -2.058 -2.463 -4.521 Lys55 -14.363 1.568 -12.794 Ala96 -6.077 0.896 -5.182 Thr97 -2.739 -1.431 -4.171 Gln98 -2.542 -1.548 -4.09 Leu99 -1.507 -2.779 -4.286 Pro100 0.439 -0.379 0.061 Arg101 3.992 -0.549 3.443 His148 0.101 -0.083 0.018 Val163 -0.104 -0.237 -0.342 Trp165 1.358 -1.122 0.236 Asn170 -2.102 -0.487 -2.589 Tyr172 -8.7 0.896 -7.804 Lys178 -3.614 -0.03 -3.644 Leu217 0.761 -1.426 -0.664 Ala218 -0.071 -0.281 -0.352
实例20
改进亲和力抗体的合理设计
本实例证明通过位点定向突变发生，对接模型怎样可以用作改进亲和力抗体合理设 计的根据。计算机模拟使每个13.1.2互补位残基突变成所有19个其它氨基酸，中引出 了总计19×20或380个虚拟突变子。突变通过残基替换完成，其后接着50步能量最小 化步骤，这解决了可由侧链改变所诱导的任何局部构像改变。计算每个突变子的全部肽 与全部互补位间的互作能量。具有较野生型13.1.2强的总共相互反应能量的突变子可以 潜在地具有与肽EEKKGN(SEQ ID NO：127)的较高亲和力，并且，甚至可能是与全部 的EGFRvIII蛋白。与野生型13.1.2相比，这些突变子大部分具有较高的库仑互作，但 是其中的一些与野生型抗体相比具有较低的van der Waals(VdW)互作。野生型13.1.2 抗体的VdW互作能量是-9.689kcal/mol，淘汰掉小于-8.5kcal/mol VdW互作能量的突变 子。表20.1中列出了剩余具有较野生型13.1.2强的总共互作能量的突变子。表的底部列 出了野生型数据用于比较。所有的能量以kcal/mol的单位表示。
表20.1
突变子 库仑 VdW 总计 Tyr172Arg -93.004 -8.702 -101.706 Leu99Glu -79.897 -8.506 -88.403 Arg101Glu -77.984 -8.833 -86.817 Leu217Glu -75.124 -8.998 -84.123 Leu99Asn -73.337 -9.894 -83.231 Leu99His -73.631 -9.008 -82.639 Arg101Asp -71.983 -9.877 -81.861 Leu217Gin -70.263 -9.795 -80.058 Leu99Thr -69.882 -10.153 -80.035 Gln98G！u -70.651 -9.257 -79.908 Leu217Asn -70.989 -8.769 -79.758 Arg101Gln -69.432 -10.164 -79.596 Leu217Asp -69.934 -9.643 -79.578 Asn35Gly -69.016 -10.191 -79.207 Tyr172His -69.312 -9.509 -78.820 Val163Asn -68.841 -9.944 -78.784 Tyr172Asn -68.896 -9.871 -78.767 Aia218Lys -70.024 -8.570 -78.594 Asn35Arg -68.989 -9.604 -78.593 Trp165Lys -69.578 -8.766 -78.344 Trp165Arg -68.814 -9.216 -78.030 Leu99Tyr -67.052 -10.464 -77.517 Tyr172Thr -68.146 -9.225 -77.371 Aia96Thr -67.534 -9.623 -77.158 AIa96Ser -67.222 -9.822 -77.045 Pro100Trp -67.399 -9.496 -76.894 Leu217Ser -66.676 -10.133 -76.810 Ser32lle -66.700 -10.077 -76.777 Tyr172Ser -67.588 -9.146 -76.734 His31Glu -67.070 -9.461 -76.531 Leu217Tyr -65.605 -10.726 -76.331 Val163His -67.236 -9.064 -76.300 His148Ser -66.780 -9.495 -76.274 His148Val -66.634 -9.629 -76.263 His148Ala -66.770 -9.473 -76.243 His148Gly -66.762 -9.456 -76.217 His148Thr -66.700 -9.508 -76.209 Leu99Ser -66.126 -10.006 -76.132 Pro100Asp -66.153 -9.787 -75.940 Trp165Glu -66.665 -9.267 -75.932 His148Asn -66.010 -9.889 -75.899 Pro100GIn -65.873 -9.871 -75.745 Leu217Thr -66.045 -9.672 -75.717 Ser32Val -65.845 -9.854 -75.699 Ser32Pro -65.807 -9.813 -75.620 Pro100Gly -65.841 -9.774 -75.615 Pro100AIa -65.889 -9.712 -75.601 Ser32Ala -65.497 -10.089 -75.586 Ser32Thr -65.723 -9.861 -75.584 突变子 库仑 VdW 总计 Ala218Thr -66.054 -9.505 -75.560 Pro100Ser -65.831 -9.699 -75.530
Val163Gly -65.993 -9.536 -75.529 Gln98Thr -66.162 -9.277 -75.438 Pro100Met -65.811 -9.602 -75.412 Ser32Met -66.252 -9.153 -75.406 Ser32Gly -65.509 -9.891 -75.399 Pro100Asn -65.729 -9.655 -75.384 Tyr37Phe -66.253 -9.020 -75.272 Val163Ala -65.713 -9.543 -75.255 Leu217lle -65.479 -9.759 -75.238 野生型13.1.2 -65.517 -9.689 -75.205
表20.1列出的突变子可以是工程化改进亲和力抗体的候选。对于列表中顶部的14 个候选，进一步分析抗原边与抗体边每残基的贡献，以检测所提议修饰的影响。用于活 体外位点定向突变发生的10个突变子是Tyr172Arg、Arg101Glu、Leu99Asn、Leu99His、 Arg101Asp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、Arg101Gln和Asn35Gly。结果可见于 实例21。
实例21证实13.1.2模型的位点定向突变发生
本实例证明了一个方法，通过这个方法可以测试认为残基在结合中是重要的上述模 型。本实例还引出一些抗体变体。通过单独残基突变产生了13.1.2抗体变体，单独残基 突变是引入13.1.2mAb的重和轻链。分析变体以确定抗原结合中许多侧链的贡献。通过 位点定向突变发生引入的一列突变总结在表21.1中。
表21.1
链 突变 1 轻链(CDR3) Arg101Asp 2 轻链(CDR3) Arg101Gln 3 轻链(CDR3) Arg101Glu 4 轻链(CDR1) Asn35Gly 5 重链(CDR3) Leu217Asn 6 重链(CDR3) Leu217Gln 7 轻链(CDR3) Leu99Asn 8 轻链(CDR3) Leu99His 9 轻链(CDR3) leu99Thr 10 重链(CDR2) Tyr172Arg
表21.1中的10突变中的每一个都引入至13.1.2mAb的重或轻链。每个经突变链随 后以293个细胞中的互补野生型链转染。随后测试上清液的人类IgG抗体的表达和分泌， 以及结合EGFrVIII抗原。通过ELISA确定的结果总结在表21.2中。
表21.2
突变 结合能量 表达 结合 1 Arg101Asp -81.861 是 否 2 Arg101Gln -79.596 是 否 3 Arg101Glu -86.817 是 否 4 Asn35Gly -79.207 是 是 5 Leu217Asn -79.758 是 是 6 Leu217Gln -80.058 是 是 7 Leu99Asn -83.231 是 是 8 Leu99His -82.639 是 是 9 Leu99Thr -80.035 是 是 10 Tyr172Arq -101.706 是 是 11 WT -75.205 是 是
实例22
EGFRvIII/pFLAG变体构建体的准备
本实例证明作用制造EGFRvIII的变体。引物对9712和9713(Qiagen，Valencia，CA) 产生一段1092bp编码的片段EGFRvIII的胞外域。
Primer#9712：5′-ataaaagcttctggaggaaaagaaaggtaatta-3′(正义)(SEQ ID NO：128)； Primer#9713：5′-TTATTGGTACCTCAGGCGATGGACGGGATCTTA-3′(反义)(SEQ ID NO 129)用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolle，CA)从质粒模板EGFRvIII-rbIgG/pCEP4 (如上述)扩增。引物#9712引入HindIII位点且引物#9713引入KpnI位点。PCR产物 经过柱纯化(Qiagen column purification kit，Valencia，CA)，HindIII和KpnI(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化并胶纯化(Qiagen gel purification kit，Valencia， CA)。T4 DNA连接酶(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)连接片段至HindIII 与KpnI(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)线性化的pFLAG-CMV-1(Sigma，St. Louis，MO)。引出的载体被命名为EGFRvIII/pFLAG-CMV-1#1。
实例23
EGFRvIII/pFLAG重组蛋白的准备
本实例证明怎样可以制得变体EGFRvIII。首先，500μg EGFRvIII/pFLAG-CMV-1#1 质粒DNA再悬浮于25ml Opti-MEMI(Invitrogen，Burlington，ON)，并且与再悬浮于25ml Opti-MEMI的500μl 293fectin(Invitrogen，Burlington，ON)结合。混合物在室温下温育20 min，并随后与准备在1L 293 FreeStyle培养基(Invitrogen，Burlington，ON)中的293T cells (1x109)混合，所述培养基补充有2％FBS和50μg/ml G418(Invitrogen，Burlington，ON)。 细胞在37℃、8％CO2及125rpm转速下生长7天。
根据厂商的实验方案，使用Anti-FLAG M2 Affinity Chromatography试剂盒(Sigma， St.Louis，MO)纯化融合蛋白。
如下制备单体融合蛋白。首先，纯化蛋白(1508μg)以终浓度10mM的DTT 55℃ 还原30分钟。然后，加入IAA(碘乙酸)(Sigma，St.Louis，MO)至22mM，并在室 温暗处温育15分钟，接着在4℃的7k MWCO透析盒(Pierce，Rockford，Ill)中抗PBS 透析。
Examples 24-30抗体变体的结合研究
以下实例包含Biacore实验(表面等离子共振)和KinExA实验。这些实例证明怎 样测试由上述实例制得的许多抗体及其变体，以确定它们是否具有所需结合特征。所有 经测验的变体都是13.1.2背景的变体。
实验仪器
所有的表面等离子共振实验都是使用Biacore 2000光学生物传感器(Biacore，Inc.， Piscataway，NJ)进行。所有的动力排斥测定(Kinetic Exclusion Assay)都是使用KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments，Inc.，Boise，ID)进行。试剂
从Anatech，Inc.(San Jose，CA)定制合成并购得Pep-3， NH2-LEEKKGNYVVTDHG-OH(MW＝1590Da)(SEQ ID NO：130)。室内准备所有的 mAbs。室内准备MW 39，907的抗原EGFRvIIIpfiag(反应碘乙酸以阻止游离硫氢基基团 的聚合)。从Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)购得牛血清白蛋白(BSA)部分V (#BP1605-100)。其它所有普通试剂均购自Sigma-Aldrich，Inc(St.Louis，MO)。
所有用于Biacore和KinExA分析的抗原和mAb样品在含有100μg/mL BSA的(0.01 M HEPES，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P-20，Biacore Inc.，Uppsala，Sweden)真空除 气HBS-P缓冲液中准备。Biacore耦胺剂、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和乙醇胺购自Biacore，Inc.。对于pep-3/mAb 131 实验，Biacore表面活性剂再生具有26mM NaOH的12秒脉冲。所有其它mAb在20分 钟内解离至基线。研究级CM5生物学感测器芯片购自Biacore，Inc。
KinExA检测抗体是Fcγ特异Cy5-标记的羊抗人类IgG()并从0.5mg/mL储液 (1×PBS，pH 7.4)以HEPES缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，pH 7.2)稀释1000 倍。用于KinExA实验的固相粒子是NHS激活的Sepharose 4 Fast Flow珠(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden，#17-0906-01)。在琼脂糖珠与抗原反应之前，微离心管内 1.5ml的珠储液等分量经离心并以冷的去离子H2O水至少水洗6次。一旦用碳酸钠缓冲 液(0.05M，pH 9.3)冲洗珠子之后，碳酸钠缓冲液中的抗原(～40μg)就添加到琼脂糖 珠上。琼脂糖/抗原管4℃过夜摇晃。摇晃之后，摇动琼脂糖并以1M Tris缓冲液，pH 8.3 冲洗两次。抗原包被的珠子随后在含有2％BSA的1M Tris缓冲液中室温下摇晃1小时。
Biacore测量
使用标准EDC/NHS和碳水化合物耦联以共价固定mAb至CM5感测器芯片。为了 最小化大量的传输与拥挤，将mAb固定在一定水平上，此时气给予不超过50-100RU 的最大抗原结合应答(Rmax)。每个芯片上的参照流动细胞以无mAb的固定来激活或 阻止，使其当作对照。
在23℃下进行所有的Biacore动力学实验。对于每个实验，用2倍稀释液准备一组 连续的6至8个抗原浓度(从1.01μM pep-3开始)。在三个重复中在室温感测器的表 面以100μL/min任意的注射的抗原样品。每个pep-3浓度和空白都注射90秒。接着解 离13至180分钟。通过以三个额外空白注射替换三个额外251nM pep-3注射以及接着 3-4小时的解离时期获得了结合至mAb 131的pep-3解离数据。
使用Scrubber软件(Version 1.1f，BioLogic Software，Australia)处理所有的Biacore 感测谱。首先在y轴上调零感测谱，并且随后在注射开始时x排列。通过减去参照流动 细胞的应答而移除大量折射指数的改变。从所有的被分析物和空白感应谱中减去所有空 白注射的平均应答以移除实验与参照流动细胞间的系统人为因素。使用CLAMP生物感 测器数据分析软件(Version 3.40，BioLogic Software，Australia)确定经处理数据组的ka 和kd。所有流动细胞的数据都全部适合包括大量传输的条件的1∶1双分子结合模型。对 于一些mAb，对应于pep-3连续浓度的第一或第二浓度的注射被排除在非线性动力适合 之外，在适合非线性动力中感应谱不能通过1∶1互作模型很好的描述是明显的。从kd/ka 的商计算KD。
KinExA平衡测量
在室温下(～23℃)进行所有的KinExA实验。对于所有的平衡实验，抗原被连续地 稀释成具有恒定mAb结合位点浓度的溶液。对于第一10滴定点，稀释液是2倍的并且 第11和第12连续稀释液是10倍的。所有实验的样品流动速率是0.25mL/min，并且标 记抗体流动速率是0.5mL/min。抗原/抗体样品随后允许达到平衡，此过程需要花费 ～48-72hr。对于pep-3/mAb 131 KinExA实验，KD-控制滴定中pep-3的起始浓度是352 nM，并且恒定[mAb binding site]＝219pM；对于mAb-控制滴定，起始[pep-3]＝251nM， 且[mAb binding site]＝11nM。在pep-3/mAb 131的KD-控制实验期间，流动细胞中每个 样品提出1.25mL。抗体控制实验中分析了250μL的样品体积。对于所有平衡实验，测 量每个样品的两个或三个重复。使用KinExA软件(Version 2.4，Sapidyne Instruments)， 平衡滴定数据适合1∶1结合模型的双曲线分析。
仅在KD-控制条件下研究了EGFRvIIIpflag/mAb 131复合体的KinExA。起始 [EGFRvIIIpflag]是198nM，并且[mAb binding site]是150pM。流动细胞中提出1mL体 积的样品。收集所有样品的重复测试数据。使用KinExA软件(Version 2.4，Sapidyne Instruments)，平衡滴定数据适合1∶1结合模型的双曲线分析。参看以下实例28的结果 和预测平衡常数。
对于EGFRvIIIpflag/mAb 13.1.2复合体的KinExA滴定，EGFRvIII的起始浓度是5.26 μM(mAb-控制)、230.1nM(KD-控制)，并且[mAb binding site]＝9.59nM(mAb-控制)、 498pM(KD-控制)。在KD-控制实验期间，流动细胞中每个样品提出1.30mL。抗体控制 实验中分析了250μL的样品体积。对于所有平衡实验，测量每个样品的两个或三个重 复。使用KinExA软件(Version 2.4，Sapidyne Instruments)，平衡滴定数据适合1∶1结 合模型的双曲线分析。
实例24抗体结合常数的活体外确定
通过使用Biacore的Surface Plasmon Resonance(SPR)仪器观测野生型mAb 131的结 合动力学特征。归因于极低的kd和快速ka，因此KD是极低的，仅为380pM。从曲线装 置中分离到的其它动力学参数估计ka＝2.246x106和kd＝8.502x10-4。
在一个实施例中，展示了改进的或具由改进动力学的变体抗体。通过改进的动力学， 意为结合表位的一个抗体动力元件好于先前已知用同样表位的抗体的同样元件。举例而 言，具有大于(结合能力)1.3x10-9M KD结合pep-3的抗体可为改进抗体。涵盖如此具 有小于500nM、500-300nM、300-100nM、100-1nM、1.3nM、1.3nM至1000pM、1000 pM至900pM、900-500pM、500-400pM、400-300pM、300-100pM、100-50pM、50-1 pM的KD或更小KD的抗体。
实例25
抗体结合常数的活体外确定
与实例24相似，测验了mAb13.1.2至Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。估计KD的是67nM，但是实验之间有较小的偏差。从曲线装置中分离到的其它动力学参数估计 ka＝2.835x105和kd＝0.01922。
实例26
抗体结合常数的活体外确定
与实例24相似，测验了mAb 095至Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。估计的KD是66nM。从曲线装置中分离到的其它动力学参数估计ka＝1.491x105和kd＝9.927x10-3。
实例27
抗体结合常数的活体外确定
与实例24相似，测验了mAb 139结合Pep-3(EGFRvIII表位)的动力。估计的KD是 290nM。从曲线装置中分离到的其它动力学参数估计ka＝10328和kd＝2.98P10-3。
实例28
抗体结合常数的活体外确定
为了更完全的分析抗体的结合特征，进行KinExA实验以确定mAb 131的结合特征。 根据双曲线分析确定的KD是1.74x10-10。在一个KinExA实验中，EGFRvIIIpflag至mAb 131的KD是6.266x10-11。
实例29
变体抗体结合常数的活体外确定
为了更完全的分析13.1.2抗体的结合特征，进行KinExA实验以确定mAb 13.1.2的 结合特征。根据双曲线分析确定的KD是7.538x10-10。此外，本实例中的抗原是 EGFRvIIIpflag，并且其与碘乙酸(IAA)反应。
实例30
Biacore结果与KinExA结果的比较
下表30.1中展示了先前实例和KinExA测试的结果。表30.1中括号内的数字是95％ 的置信区间。“ND”是未确定，以及“*”代表结合EGFRvIIIpflag(反应的碘乙酸)，而不 是pep-3。
如速率常数所显示的，mAb 131展示具有最大的缔合常数并具有最小的解离常数， 因此使得mAb 131有最小的KD。
表30.1
实例31
L99T-5.3变体抗体结合常数的活体外确定
测验了mAb L99T-5.3至Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。第一步骤是使用标 准EDC/NHS耦联化学，将5,600个共振单元(RU)固定在CM5感测器芯片两个流动 细胞(Fc)的mAb L99T-5.3的8,000个RU上，以及将5,600个共振单元(RU)固定至 一个Fc的mAb 13.1.2的8,000个RU上。这个表面密度产生小于100个RU的具有pep-3 的结合信号。总共使用了两个CM5感测器芯片以固定两个mAb。使用先前收集的数据， 产生了两个抗体允许待计算95％置信区间的总共5个独立实验。所有研究都使用Biacore 2000光学生物感测器。
接着，pep-3流经mAb固定的生物感测器表面。pep-3起始浓度为1.25μM，此接在 任意三重复注射中8个两倍连续稀释液之后。为达到双参照的目的，贯穿连续注射中每 第六个样品进行空白注射。
最后，用Scrubber处理生物感测器数据，且数据适合采用具有包括大量传输条件的 1∶1互作模型的Clamp的曲线。1.25μM的高浓度注射排除出动力适合，因为数据明显 的不符合1∶1互作模型。这个偏离最有可能是由发生在高浓度pep-3的非特异互作引起 的。所有的动力数据满意地适合1∶1互作模型。
所估计的KD为54-70nM。估计的其它动力参数ka＝2.238x105和kd＝0.01217，此在 各个运行之间液由轻微差异。
实例32-38
实例32-38进一步测验通过使用Biacore装置，变体mAb的结合动力。这些实例中 的第一步骤是使用标准EDC/NHS耦联化学，将5,600个共振单元(RU)固定在CM5 感测器芯片的一个流动细胞(Fc)的每个经测试的mAb L99T-5.3的8,000个RU上。这 个表面密度产生小于100个RU的具有pep-3的结合信号。总共使用3个CM5感测器芯 片以一个固定在每个流动细胞上的同一mAb固定所有的突变子mAb。MAb 13.1.2包括 在3个感测器芯片中两个的一个流动细胞上。所有研究都使用Biacore 2000光学生物感 测器。
接着，pep-3运行经过mAb固定的生物感测器表面。pep-3起始浓度为4.98μM，此 接在任意两重复或三重复注射中8至11个两倍连续稀释液之后。为达到双参照的目的， 贯穿连续注射中每第六个样品进行空白注射。
最后，用Scrubber处理生物感测器数据，且数据适合采用具有包括大量传输条件的 1∶1互作模型的Clamp。取决于mAb及其亲和力，当数据明显的不符合1∶1互作模型 时，一些高浓度注射(4.98-1.25μM)排除出动力适合。这个偏离最有可能是由发生在 高浓度pep-3的非特异互作引起的。所有的动力数据适合1∶1互作模型。
实例32
L217Q-10.1变体抗体活体外结合常数确定测验了mAb L217Q-10.1至Pep-3 (EGFRvIII表位)的结合动力。估计的KD是92nM。从曲线装置中分离到的其它动力 学参数估计ka＝2.04x105和kd＝0.01885。
实例33
L217N-2.1变体抗体活体外结合常数确定相似于实例32，测验了mAb L217N-2.1 至Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。估计的KD是185nM。从曲线装置中分离到的 其它动力学参数估计ka＝2.198x105和kd＝0.04069。
实例34
N35G-3.1变体抗体活体外结合常数确定相似于实例32，测验了mAb N35G-3.1至 Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。估计的KD是204nM。从曲线装置中分离到的其 它动力学参数估计ka＝1.497x105和kd＝0.03057。
实例35
变体抗体结合常数的活体外确定
与实例32相似，测验了mAb L99H-9.2至Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。估计 KD为395nM。从曲线装置中分离到的其它动力学参数估计ka＝83390和kd＝0.03293。
实例36
变体抗体结合常数的活体外确定
与实例32相似，测验了mAb Y172R-1.2至Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。估 计的KD是927nM。从曲线装置中分离到的其它动力学参数估计ka＝82237和kd＝0.07622。
实例37
变体抗体结合常数的活体外确定
与实例32相似，测验了mAb L99N-4.1至Pep-3(EGFRvIII表位)的结合动力。估计 的KD是1.4μM。为了确定KD，因为动力是极快而难以适合的，因此MAb L99N-4.1适 合使用稳定状态(平衡)结合模型。
实例38
13.1.2与被设计变体的比较
如可见于表38.1，开发了具有改进结合特征的mAb。括号内显示了95％的置信区 间。L99T-5.3展示增加的ka，减少的kd，并且因此全部较低的KD。尽管如果Pep-3结 合mAb 13.1.2和L99T-5.3(在95％的置信区间)的平衡解离常数与动力速率常数间显 示统计上小的显著差异，但是似乎仍然存在Pep-3结合L99T-5.3亲和力的边际增量具有 直觉偏差。此外，当使用相同的生物感测器芯片时，L99T-5.3似乎总具有较13.1.2高的 亲和力。
表38.1
MAb ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(nM) 13.1.2 2.10(0.58)x105 0.016(0.003) 75(14) L99T-5.3 2.16(0.12)x105 0.013(0.001) 60(10) L217Q-10.1 2.04x105 0.019 92 L217N-2.1 2.20x105 0.040 185 N35G-3.1 1.50x105 0.030 204 L99H-9.2 8.34x104 0.033 395 Y172R-1.2 8.22x104 0.076 927 L99N-4.1 ND ND 1,400*
额外对接模型与选择模型级预测结合亲和力的方法
在其它实施例中，上述实例可以与不同长度肽一起进行而不仅仅时6氨基酸长度的 肽，只要肽中包括关键结合残基即可。举例而言，代替EEKKGN(SEQ ID NO：127)的6 氨基酸肽，可以使用EEKKGNY(SEQ ID NO：131)的7氨基酸肽。可以使用任何大小肽 的表位。在其它实施例中，肽是选自以下肽：LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO：56)、 LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO：59)、LEEKKGNYVVT(SEQ ID NO：132)和 EEKKGNYVVT(SEQ ID NO：57)。可以使用介于这里揭示的段片段至全长肽之间的任何 大小的肽或其变体。
如所述领域技术人员应了解的，存在额外氨基酸可以改变肽结合抗体的方式。不仅 额外氨基酸的存在允许形成在肽与抗体间替换及额外的键合，而且额外的氨基酸可以改 变肽的结构以及抗体结合肽的抗体结构。因此，在一个实施例中，可以测验不同长度表 位肽，例如EEKKGN(SEQ ID NO：127)和EEKKGNY(SEQ ID NO：131)的结合特性与结 合最佳化。不仅肽的较长片段精确描绘对肽较长节段的肽-抗体互作，而且结合强度和包 含在结合内的残基的改变测验允许关于较长肽，由数据推导的额外信息。
此外，并且可能是与测试所互补的较长肽片段，可以进行额外的过滤步骤以选择精 确的对接模型。额外的过滤步骤可以允许在许多对接模型中过滤以寻找与可用实验数据 一致的模型。
在一个实施例中，过滤是基于良好离析的表位制图数据，例如实验特征的单独残基 结合概况，所述制图数据联系于肽中每个氨基酸的计算结合能量概况。举例而言，7氨 基酸肽的结合能量概况可以用于选择含有相似结合能量概况的对接模型。结合能量概况 是肽中每个氨基酸与特定氨基酸的结合能量的赋值，氨基酸的结合创建肽的概况，其是 根据在所述模型中的每个氨基酸结合能量。举例而言，在一个对接模型中给定一个包含 氨基酸A与B的肽，其中A具有-5的结合能量且B具有-20的结合能量，可以具有A1 (-5时)与B2(-20时)的概况。这个概况可以用作选择其它对接模型的过滤。举例而 言，使用这个结合能量概况作为过滤或“模板”可以导致其它对接模型的选择，如果候选 模型中的肽具有贡献于位置A的相对低的值，并且具有贡献于位置B的相对高的值(较 大负值，较高绝对值)。在一个另外实施例中，模板需要额外的限制，例如位置B的值 比位置A的值高4倍。
可以以许多方式将结合能量概况模板与其它对接模型内肽的概况比较。如果结合能 量概况模板与所需结合能量概况相似，那么随后过滤可以用作选出有利对接模型用于进 一步测验。如果结合能量概况模板与所需结合能量概况不相似，那么随后过滤可以用作 消除不利对接模型。在一个实施例中，过滤过程包括具有有利和不利结合能量的模板， 并且过滤用于选择和排除对接模型。如所述领域技术人员以了解的，存在许多可能的不 同结合能量概况，并且因此取决于不同情况，可以使用许多不同结合能量概况。在一个 实施例中，可以定义结合能量概况为在肽内特定位置具有一系列相对高结合能量的模 板。在一个优选实施例中，结合能量高空模板和模板所选择的结合能量概况将在肽 EEKKGNY(SEQ ID NO：131)的位置2、4或6处具有相对高的结合能量。在另一个实施 例中，结合能量概况模板在肽EEKKGNY(SEQ ID NO：131)的位置2、4或6处具有相对 高的结合能量。在另一个实施例中，结合能量概况模板在肽EEKKGNY(SEQ ID NO：131) 的位置3处具有相对的的结合能量。在以上讨论中，所述位置倍指派如下：E1、E2、K3、 K4、G5、N6、Y7。
在一个实施例中，过滤处理首先包含在K3和K4处结合能量的对比。选择引起K4 对比于K3相对较高结合能量的对接模型，同时筛除引起K4对比于K3相对较低结合能 量的对接模型。因此，“相对高”意为K4的结合能量大于(负值更大，更大绝对值)K3。 然后，再一次在结合能量概况模板中过滤对接模型，这一次，选择在位置2、4或6处 具有相对较高能量的结合模型，同时可以移除其它模型。因此，“相对高”意为在肽中在 位置2、4或6处的结合能量比最低结合能量高(更大负值，更大绝对值)。因此，在 这个实施例中，可以如下总结结合能量特征模板：E1可以为任何值，E2应该比最低值 大，K3应该小于K4，K4应该大于最低值，G5可以为任何值，N6应该大于最低值， Y7可以为任何值。因此，只要至少一个(或K3)小于至少E2、K4和N6中一个，E1、 G5和Y7可以为任何值。在另一个实施例中，“相对高”可以设定为如模型化或实验确定 的标准值。在一个实施例中，对接模型通过第一过滤比对接模型通过第二过滤更佳重要。 如所属领域技术人员应了解的，不需要相继地进行这两个步骤，且这两个步骤可以同时 进行。
此外，取决于肽、抗体和结合条件，过滤结果的这些概况模板可以不同。给予本揭 示案，所属领域技术人员尤其参看实例14后，可以确定合适的结合能量概况模板。举 例而言，如表14.1所示，肽结合131和13.1.2抗体，存在一些可能的重要残基。在131 mAb中，位置E2、K4、N6和Y7对于特定经测试的肽是重要的。在13.1.2mAb中，位 置E1、E2、K4、G5和N6对于特定经测试的肽是重要的。这些重要的残基可以是包含 于创建结合能量概况模板中的残基。如从以下讨论可以清楚的知道，实例39中的结合 能量概况模板显示出与实例14分析所认为的不同。
实例39是模板严谨性较低的版本，其允许更多的模型通过筛选步骤。如果向减小 通过筛选步骤的模型的树木，那么可以进一步添加关于E1和G5的需要。
以下实例证明使用较长肽怎样可以改变以上证明的结果及这些改变可以意为什么， 以及证明使用上述用于选择特定对接模型的过滤。
实例39 7氨基酸肽的表位-抗体对接模型
本实例证明产生一组对接模型，所述模型是对于7残基肽在13.1.2的CDR区复杂 的结构模型。此外，本实例证明在另一对接模型上选择一个对接模型的方法。 首先，7残基肽EEKKGNY(SEQ ID NO：131)结构模型在延伸构造内建成，且用InsightII 模型化包装内的Discover_3模块最小化能量。然后，这个肽结构手工放置于连接位点内 以形成起始组装。使用InsightII中Docking模块随后在平移和旋转空间中自动进行Monte Carlo搜索。在对接过程中，允许5埃结合沟槽内的残基在其它抗体残基被固定的同时 移动。肽被限制在5埃起始位置内。Monte Carlo搜索发现的似是而非的构造接着经刺激 退火和能量最小化以达到最终复合体结构模型。获得总共63个对接模型。
对于每个对接模型，肽中抗体与单独残基间的互作能量用Discover_3计算。表位- 抗体结合中的单独残基贡献概况被检查以选择与良好离析表位制图数据一致的对接模 型，意即“结合能量概况模板”。63个对接模型中的19个通过了这个检查。表39.1中显 示了一个典型的单独残基结合能量概况。与实例14中表位制图数据一致的，K4的结合 能量是显著的，且N6和E2是大的。这个结合能量概况模板特别强调K4大于K3的实 事。这个结合能量概况也特别强调需要E2、K4和N6相对大。换句话说，E2、K4和 N6的结合能量并不是肽中结合能量最低的(最少负值或最小绝对值)。表39.17残基肽 内单独残基与抗体13.1.2的结合能量概况与实例14的表位制图数据一致。
E1 E2 K3 K4 G5 N6 Y7 总计
-10.97 -19.34 -13.46 -24.26 -10.1 -18.19 -15.15 -111.45
对于基于结合能量概况上通过过滤的19个模型，在具有亲和力数据的7个突变子 (Tyr172Arg，实例36；Leu217Asn，实例33；Leu217Gln，实例32；Asn35Gly，实例 34；Leu99Asn，实例37；Leu99His，实例35和Leu99Thr，实例31)的每一个上进行表 位-抗体结合热力学仿真。因为本复合体内的静电交感的程度已经接近，所有在一系列的 计算中使用许多不同的静电常数。突变通过残基替换完成，其后接着30-100步能量最小 化步骤，这解决了可由侧链改变所诱导的任何局部构像改变。对于每个对接模型，对每 个突变子的所选参数，计算7残基肽与整个抗体间的互作能量。对于每组8个结合能量
(7个突变子加野生型)，与Kd算法对比进行每组结合数据的线性适合过程。计算每 个线性适合的相关系数。获得一个模型的最佳相关性，所述模型具有表39.1中所述的数 据，所述最佳相关性具有静电常数l*r和50步的能量最小化。表39.2中显示了这个模 型的表位-抗体结合能量。所有数据的相关系数为0.80。参看以上实例37，因为没有测 量Leu99Asn的高精度KD，所以进行了除Leu99Asn数据之外的单独线性适合。如图20 所示，获得了一个极好的相关系数0.91。因此以上所选的模型很好地代表精确的对接模 型。图21显示了具有空格填充肽的模型，且图22显示了氢键。图22中L3 150是较低 部分且H3 160是较高部分。H2 140在肽结合区域的右边。肽自身位于结合位点内，结 合位点内E1位于亮遮光内的页顶部，其下是依次变暗的K3、K4、G5、N6和Y7。图 22显示了包含于氢键合的抗体残基。本实例制得的模型证明存在7个氢键。K4...Q95， K4...Q95，N6...Q98，G5...H31，Y7...H31和Y7...W165。
表39.2.
与Kd对数对比，仿真表位-抗体结合热力学
如可见于实例39中所选模型，图21中代表，对接模型显示了一些非预测结果。一 个有趣的结果是尽管残基E2、K4和N6在结合作为整体的肽中是重要的，但是并不是 所有的这些氨基酸模型化作为包含于与抗体形成H-键。显示K4包含于都与Q95形成两 个H-键，这与K4在结合能量概况与概况模板中的重要性一致。也显示N6模拟以键合 Q98；然而，在这个特别模型中，E2并步显示在模型中形成H-键。一个一致的有趣趋势 是来源于结合能量概况模板的每个关键残基(例如E2、K4和N6)大部分被埋藏，并因 此与抗体结合沟槽紧密接触。因此，对接模型选择可以说明这些关键残基是重要的实事， 因为其与抗体的紧密互作。此外，E1可能与W214形成氢键。
实例39也证明上述方法引起结合能量与KD间的高相关，这认为本方法所创建的模 型也允许抗体-肽复合体的KD的最佳化或至少预测。
如可见于实例39与实例19的对比，存在一些是两个模型间重要的残基，一些残基 仅在7氨基酸对接模型中显示，以及一些残基在7氨基酸对接模型中步显示是重要的。 举例而言，7肽表位显示在K4...Q95、K4...Q95、N6...Q98、G5...H31、Y7...H31、和Y7...W165 间创造H键。另一方面，6肽表位显示在E2...Y172、K3..H31、K4...H31、N6...D33、 N6...Y37和N6...K55间创造H键。如可从上述数据看出，6与7氨基酸肽模型都强调H 31的重要性，因为两个模型都包含与肽形成两个氢键的H31。尽管存在两个数据组之间 的其它可能趋势，但是其也显示许多结合互作已经从6氨基酸模型改变成7氨基酸模型。 然而，这些实例证明可以用这些模型检测出归因于表位大小的变化，并因此从较短至较 长表位肽的缩放并步应该是按照本揭示案的问题。存在氨基酸连续证明其在许多结合模 型内的重要性允许因此偏离许多互作的重要性，因此较短肽模型可以是较长肽互作的更 典型代表。
如所属技术领域技术人员应了解的，关于6氨基酸肽EEKKGN(SEQ ID NO：127) 的以上讨论或实例也可以应用于7氨基酸肽EEKKGNY(SEQ ID NO：131)，或任何更长 的肽。举例而言，实例20可以重复实例39的信息，其是通过位点定向突变发生合理设 计亲和力改进的抗体。此外，使用实例39的结果可以重复实例21，接着是通过位点定 向突变发生尝试合理设计亲和力改进抗体以测试从实例20分离的任何新的抗体。
在一个实施例中，使用实例39的结果以重新定义抗体与肽之间的互作区域。举例 而言，EEKKGNY(SEQ ID NO：131)的互补位可以定义为包括抗体上预测为与肽互作(例 如，残基95)的其它残基。或者，如实例19，互补位可以定义为5埃对接肽内的所有 残基。不同蛋白的计算机模拟亲和力成熟。
在许多不同研究中已经在活体外成功的得到抗体亲和力成熟。通常，任意突变文库 需要通过分子生物学方法构建，并且需要开发选择/筛选测定以丰富具有良好结合能力的 克隆。所选变体随后需要经纯化以确定亲和力。这个过程需要进行一系列长且艰苦的实 验。以下实例证明了通过单独利用抗体-抗原复合体结构的选择可能精确预测亲和力成 熟。
实例40通过抗体-抗原结合热力学仿真的计算机模拟亲和力成熟
本实例证明可以使用计算机模拟抗体-抗原结合热力学仿真用于亲和力成熟。本实例 特别证明Fab-12(IgG形式，已知为rhuMAb VEGF)与VEGF(微管内皮生长因子)的 结合动力可以通过上述计算机模拟过程预测。
使用的VEGF-Fab复合体晶体结构在PDB数据库中，并具有登录号1BJ1，其在2.4 埃解析。使用抗VEGF Fab的一系列突变子的发表实验亲和力数据用于测试观点。 VEGF-Fab结构的3-D相配物用于以下突变子的计算机模拟突变：H97Y、S100aT、T28D、 28D31H、28D31H97Y100aT、N31H、Y53W、71I73K、71V73V。所述亲和力数据从Chen， Y等人(J Mol Biol.，293(4)：865-81(1999))获得。如实例39所描述的在许多VEGF-Fab 突变子间进行热力学仿真。结果列在表40.1中。本实例的结果证明通过这个过程获得了 结合能量与亲和力列间的显著相关。图23显示结合能量的详细适合对相对亲和力的对 数。-0.91的相关系数阐明计算机模仿真激在原子水平精确地捕获详细互作。
表40.1抗体-抗原结合能量仿真对比亲和力数据。
如可从以上实例清楚的了解，可以推断仿真鉴定不使用活体外实验的较高亲和力突 变。此外，本方法对于不同抗体和不同肽明显是有用的。仅使用高解析抗体-抗原复合体 结构，本方法可以通常应用于执行亲和力成熟计算机模拟。在一个实施例中，这个使用 计算机模拟亲和力成熟将节省极大量的时间和资源。
实例41规范类抗体确定
Chothia等人已经描述每个免疫球蛋白链的超变区的根据“规范类”的抗体结构(J. Mol.Biol.1987 Aug 20；196(4)：901-17)。分析多种免疫球蛋白的Fab和VL片段的原子 结构，以确定氨基酸序列与其抗原结合位点的三维结构的关系。Chothia等人发现在其 包装中，存在主要负责超变区主链构造的相对极少的残基，其氢键或能力呈现不平常的 phi、psi或omega构造。发现这些残基发生在超变区内的位点并在保守beta-薄片框内。 通过测验具有未知结构的免疫球蛋白序列，Chothia等人显示许多免疫球蛋白具有超变 区，这些超变区与已知结构具有相似的大小，并额外在负载所观察构造的位点处含有同 一残基。
其发现暗示这些超变区具有与已知结构相近的构造。对于5个超变区，构造的所有 组成部分显示限制于相对小数目的离散结构类。这些通常发生超变区的主链构造的是术 语“规范结构”。Chothia等人(Nature.1989 Dec 21-28；342(6252)：877-83)和其它(Martin， 等人J Mol Biol.1996Nov 15；263(5)：800-15)的进一步工作证实至少抗体6个超变区的5 个存在一小部分所有组成部分的主链构造。
分析一些上述抗体以确定每个抗体互补决定区(CDR)的规范类。如所知的，仅将 规范类分配给抗体重链的CDR1和CDR2，以及抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3。下 表(41.1)总结了分析结果。规范类数据是以*HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3 的形式，其中“HCDR”指重链CDR且“LCDR”指轻链CDR。因此，例如，一类规范1-3-2-1-5 指具有HCDR1落入规范类1、HCDR2落入规范类3、LCDR1落入规范类2、LCDR2落 入规范类1、LCDR3落入规范类5的抗体。
表41.1
如果其满足长度需要并符合规范类中所定义的关键残基，那么每个CDR(除了H3 之外)都分配至规范结构。可以发现每个抗体所定义的氨基酸，例如在参看以上Chothia 等人的文章中。
等效物
先前描述和实例详述了本发明的特定优选实施例，并描述发明者所涵盖的最佳模 式。然而，应了解不管内容出现多详细的先前描述，本发明可以以许多方式实现，并且 本发明应该根据附加权利要求书和其任何等同物构建。