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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510954266.4 (22)申请日 2015.12.17 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国检验检疫科学研究院 地址 100176 北京市大兴区亦庄荣华南路 11 号 (72)发明人 雷荣 蒋弘山 胡帆 范晓红 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 张立娜 (54) 发明名称 一种基于 RPA 检测检疫性茄属杂草银毛龙葵 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种基于 RPA 检测检疫性茄属 杂草银毛龙葵的方法。本发明提供了用。
2、于鉴定 银毛龙葵的引物对， 为如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序 列表中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 分 子组成的引物对 ； (b) 由将序列表中序列 1 和序 列 2 经过一个或几个核苷酸的取代和 / 或缺失 和 / 或添加后所得序列所示的两条单链 DNA 分子 组成的， 且与 (a) 中所述引物对功能相同的引物 对。利用本发明的引物对对检疫性杂草银毛龙葵 进行 RPA 检测， 具有很高的特异性， 能有效地与其 它三种我国明文规定的检疫性茄属杂草北美刺龙 葵 (Solanum carolinense)、 刺萼龙葵 (Solanum rostratum)和水茄(Sola。
3、num torvum)区别开来， 另外还具有很高的灵敏度， 且操作方便用时短。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 105400884 A 2016.03.16 CN 105400884 A 1/1 页 2 1.用于鉴定银毛龙葵的引物对， 为如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 分子组成的引物对 ； (b) 由将序列表中序列 1 和序列 2 经过一个或几个核苷酸的取代和 / 或缺失和 / 或添 加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的。
4、， 且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。 2.用于鉴定银毛龙葵的重组酶介导等温扩增试剂， 包括能结合单链核酸的重组酶、 单 链 DNA 结合酶、 链置换型 DNA 聚合酶、 dNTPs、 醋酸镁和权利要求 1 所述的引物对。 3.用于鉴定银毛龙葵的重组酶介导等温扩增试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒含有权 利要求 1 所述的引物对或权利要求 2 所述的试剂。 4.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒在鉴 定银毛龙葵中的应用。 5.一种鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否来自于银毛龙葵的方法， 包括如下步骤 ： (1)从待测植物样品中提取基因组DNA作为模板， 采。
5、用权利要求1所述的引物对进行重 组酶介导等温扩增， 得到扩增产物 ； (2) 按照如下方法确定所述待测植物样品是否来自于银毛龙葵 ： 若所述扩增产物中含 有210bp的DNA片段， 则所述待测植物样品来自于或候选来自于银毛龙葵 ； 若所述扩增产物 中不含有 210bp 的 DNA 片段， 则所述待测植物样品不来自于或候选不来自于银毛龙葵。 6.根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (1) 中， 进行所述重组酶介导等温扩 增的反应条件为 ： 37-42恒温反应 10-30min。 7.根据权利要求 5 或 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 210bp 的 DNA 片段为序列。
6、表中 序列 3 所示 DNA 片段。 8.根据权利要求 5-7 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述待测植物样品来自于银毛 龙葵、 北美刺龙葵、 刺萼龙葵或水茄。 9.根据权利要求 5-8 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述待测植物样品为所述待测 植物的叶和 / 或茎和 / 或种子。 10.权利要求1所述引物对的制备方法， 包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分 别单独包装的步骤 ； 或 权利要求 2 所述试剂的制备方法， 包括将所述能结合单链核酸的重组酶、 所述单链 DNA 结合酶、 所述链置换型 DNA 聚合酶、 所述 dNTPs、 所述醋酸镁和组成所述引物对的两条单链 DN。
7、A 分子分别单独包装的步骤。 权 利 要 求 书 CN 105400884 A 2 1/6 页 3 一种基于 RPA 检测检疫性茄属杂草银毛龙葵的方法 技术领域 0001 本发明属于植物检疫领域， 涉及一种基于 RPA 检测检疫性茄属杂草银毛龙葵的方 法。 背景技术 0002 茄属全世界有 1400 余种， 大多起源于南美， 分布广， 适应性强， 危害性大， 其中北 美刺龙葵 (Solanum carolinenes)、 刺萼龙葵 (Solanum rostratum)、 银毛龙葵 (Solanum elaeagnifolium) 及水茄 (Solanum torvum)2007 年被列入我国。
8、颁布的 中华人民共和国进 境植物检疫性有害生物名录 ， 另外有 30 余种具有潜在危害性。茄属分子系统学研究表明 银毛龙葵属于茄亚属分支 (Leptostemonum)， 该分支有 350-450 种， 在进化关系树上分属于 10 个亚支， 银毛龙葵属于银毛龙葵亚支 (Elaeagnifolium Clade)。在口岸截获发现的几 乎都是只有果实和种子， 几种检疫性的茄属杂草及其相近种间的种子和果实形态上十分相 似， 尤其是检疫性杂草鉴定到种， 难度较大。因此构建茄属杂草分子检测平台， 准确快速对 茄属植物鉴定到种， 有效防止检疫性茄属杂草传入我国， 保障国门安全的意义十分重大。 0003 传。
9、统的茄属杂草检疫鉴定方法是采用植物形态学及解剖学的方法， 以植物的生 长器官和生殖器官等外部形态及内部解剖结构特征结合地理分布作为划分依据， 对植物 种类进行鉴定、 描述、 命名和分类。随着分子检测技术的发展， PCR 技术、 DNA 条形码 (DNA Barcoding) 技术、 RAPD、 RFLP 等分子标记技术均有用于茄属杂草的报。这些技术主要是以 PCR为基础的变温扩增技术， 其中RAPD图谱稳定性差， 而RFLP技术耗时费力， 且茄属4种检 疫杂草现有的几个条形码基因变异位点固定， 采用 RFLP 分辨难度较大。目前采用较为广泛 的 DNA 条形码技术是采用特定基因的通用引物扩增，。
10、 对获得片段进行测序， 需要时间长， 对 于较偏远检疫部门花费时间更长， 再者， 目前挖掘的茄属杂草条形码基因进化相对较慢， 变 异较小， 相似性均在 92以上， 鉴定种难度较大。 0004 目前已报道的比较成熟的等温扩增技术主要有 ： 重组酶介导等温扩增 (Recombinase Polymerase Amplification,RPA)、 链 置 换 扩 增 (Strand Displacement Amplification,SDA)、依 赖 核 酸 序 列 扩 增 技 术 (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification， NASBA)、滚 环 扩 。
11、增 技 术 (Rolling Circle Amplification， RCA)、 环 介 导 等 温 扩 增 技 术 (Loop-Mediated Isothermal Amplification， LAMP)、转 录 介 导 扩 增 技 术 (Transcription Mediated Amplification,TMA)、 依 赖 解 螺 旋 酶 扩 增 (Helicase-Dependant Amplification,HAD)、交 叉 引 物 扩 增 (Cross Priming Amplification， CPA)。这些技术不需要热循环仪， 只需要一个相对恒定的温度下即可以完。
12、 成反应， 并能通过浊度、 Sybergreen 显色等简单快速的指示结果， 能做到快速、 灵敏反应结 果， 是下一代快速检测的发展方向。 0005 重组酶介导等温扩增(RPA)技术被认为是可以取代PCR的核酸检测技术。 常规PCR 必须经过变性、 退火、 延伸三个步骤， 而 PCR 仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA 技术主要依赖于三种酶 ： 能结合单链核酸 ( 寡核苷酸引物 ) 的重组酶、 单链 DNA 结合蛋白 说 明 书 CN 105400884 A 3 2/6 页 4 (SSB)和链置换DNA聚合酶。 这三种酶的混合物在常温下也有活性， 最适温度在37-42 之间， 无需变性。
13、， 在常温下即可进行。这无疑能大大加快核酸扩增速度。RPA 检测的灵敏度 很高， 能够将痕量的核酸 ( 尤其是 DNA) 模板扩增到可以检出的水平， 从单个模板分子得到 大约1012扩增产物。 而且RPA还用不着复杂的样品处理， 适用于无法提取核酸的实地检测。 此外， 由于不需要温控设备， RPA 可以真正实现便携式的快速核酸检测。 发明内容 0006 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定银毛龙葵的引物对。 0007 本发明所提供的用于鉴定银毛龙葵的引物对， 具体可为如下 (a) 或 (b) ： 0008 (a) 由序列表中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 分子组成的引物对 ； 0。
14、009 (b) 由将序列表中序列 1 和序列 2 经过一个或几个核苷酸的取代和 / 或缺失和 / 或添加后所得序列所示的两条单链 DNA 分子组成的， 且与 (a) 中所述引物对功能相同的引 物对。 0010 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定银毛龙葵的重组酶介导等温扩增试剂。 0011 本发明所提供的用于鉴定银毛龙葵的重组酶介导等温扩增试剂， 包括能结合单链 核酸的重组酶、 单链 DNA 结合酶、 链置换型 DNA 聚合酶、 dNTPs、 醋酸镁和所述引物对。 0012 在本发明中， 所述能结合单链核酸的重组酶、 所述单链 DNA 结合酶、 所述链置换型 DNA聚合酶、 所述dNTPs和所。
15、述醋酸镁均为TwistDx公司的试剂盒中的产 品。 0013 本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定银毛龙葵的重组酶介导等温扩增试剂 盒。 0014 本发明所提供的用于鉴定银毛龙葵的重组酶介导等温扩增试剂盒， 含有所述引物 对或所述试剂。 0015 所 述 引 物 对 或 所 述 试 剂 或 所 述 试 剂 盒 在 鉴 定 银 毛 龙 葵 (Solanum elaeagnifolium) 中的应用也属于本发明的保护范围。 0016 本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否来自于银毛 龙葵的方法。 0017 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否来自于银毛龙葵的方法， 具体。
16、 可包括如下步骤 ： 0018 (1)从待测植物样品中提取基因组DNA作为模板， 采用所述引物对(序列1和序列 2) 进行重组酶介导等温扩增， 得到扩增产物 ； 0019 (2) 按照如下方法确定所述待测植物样品是否来自于银毛龙葵 ： 若所述扩增产物 中含有210bp的DNA片段， 则所述待测植物样品来自于或候选来自于银毛龙葵 ； 若所述扩增 产物中不含有210bp的DNA片段， 则所述待测植物样品不来自于或候选不来自于银毛龙葵。 0020 在所述方法的步骤 (1) 中， 进行所述重组酶介导等温扩增的反应条件可为 ： 37-42恒温反应 10-30min ； 具体如 38恒温反应 20min。。
17、 0021 在所述方法的步骤 (1) 中， 进行所述重组酶介导等温扩增的反应体系具体为 ： 再 水化缓冲液 (TwistDx 公司的试剂盒所含 )29.5L， 去离子水 12.4L， 正、 反向引物各 2.4L(10mol/L)， 待测植物基因组 DNA 0.8L( 如 20.8ng/L)， 混合 说 明 书 CN 105400884 A 4 3/6 页 5 后， 加入含有冻干酶粉(TwistDx公司的试剂盒所含)的0.2mL TwistAmp Basic 反应管， 溶解后加入醋酸镁溶液 (280mmol/L)2.5L。 0022 在所述方法中， 所述 210bp 的 DNA 片段为序列表中序。
18、列 3 所示 DNA 片段。 0023 在实际应用中， 判断扩增产物中是否含有目的 DNA 片段时， 可通过将扩增产物进 行琼脂糖凝胶电泳 ( 如 1.5琼脂糖凝胶电泳 )， 看电泳图谱上是否含有目的条带 ： 电泳图 谱上含有目的条带， 则扩增产物中含有相应的目的 DNA 片段。 0024 在实际应用中， 判断扩增产物中是否含有序列表中序列3所示DNA片段， 可通过对 扩增产物进行核苷酸序列测定来判断。 0025 在 所 述 方 法 中，所 述 待 测 植 物 样 品 可 来 自 于 银 毛 龙 葵 (Solanum elaeagnifolium)、 北美刺龙葵(Solanum carolin。
19、ense)、 刺萼龙葵(Solanum rostratum)或 水茄 (Solanum torvum) 等。所述待测植物样品可为所述待测植物的叶和 / 或茎和 / 或种 子。 0026 所述引物对的制备方法以及所述试剂的制备方法也属于本发明的保护范围。 0027 所述引物对的制备方法， 具体包括将组成所述引物对的两条单链 DNA 分子分别单 独包装的步骤。 所述试剂的制备方法， 具体包括将所述能结合单链核酸的重组酶、 所述单链 DNA结合酶、 所述链置换型DNA聚合酶、 所述dNTPs、 所述醋酸镁和组成所述引物对的两条单 链 DNA 分子分别单独包装的步骤。 0028 实验证明， 本发明是利。
20、用 RPA 反应在恒温水浴中进行的检测， 具有快速、 灵敏、 方 便、 特异性好等特点。RPA 反应对实验条件和仪器要求不高， 在恒温培养箱、 水浴锅、 金属浴 等能够维持所需温度的任何条件下即可保持RPA反应的活性， 无需昂贵的仪器。 与常规PCR 方法相比， RPA 反应时间短。本发明筛选得到的引物对 ( 序列 1 和序列 2) 对目的样品的扩 增具有较高的特异性和稳定性， 且模仿体内复制机理， 反应不需要退火过程， 整个反应简单 快速。本发明方法对检疫性杂草银毛龙葵具有特异性， 能有效地与其它三种我国明文规定 的检疫性茄属杂草北美刺龙葵(Solanum carolinense)、 刺萼龙。
21、葵(Solanum rostratum)和 水茄 (Solanum torvum)。 附图说明 0029 图 1 为 RPA 引物筛选结果。其中， 泳道 M 为 100bp Marker ； 泳道 1-4 的引物为 Waxy-F1/Waxy-R1， 依次为茄属杂草刺萼龙葵 (Solanum rostratum)， 北美刺龙葵 (Solanum carolinense)， 水茄 (Solanum torvum) 和银毛龙葵 ； 泳道 5-8 的引物为 Waxy-F2/Waxy-R1， 依次为茄属杂草刺萼龙葵 (Solanum rostratum)， 北美刺龙葵 (Solanum caroline。
22、nse)， 水 茄 (Solanum torvum) 和银毛龙葵。 0030 图2为不同RPA反应时间对检测的影响。 其中， 泳道M为Marker ； 泳道1为10min ； 泳道 2 为 20min ； 泳道 3 为 30min ； 泳道 4 为 40min ； 泳道 5 为 60min ； 泳道 6 为 90min.。 0031 图 3 为 RPA 灵敏度检测图。其中， 泳道 M 为 Marker ； 泳道 1-6 的 DNA 模板分别为 ： 0.0104ng、 0.052ng、 0.104ng、 0.52ng、 1.04ng 和 5.2ng。 0032 图 4 为 RPA 对杂草种子的特。
23、异性检测图。其中， 泳道 M 为 Marker ； 泳道 1 为刺萼 龙葵 (Solanum rostratum) ； 泳道 2 为水茄 (Solanum torvum) ； 泳道 3 为银毛龙葵。 说 明 书 CN 105400884 A 5 4/6 页 6 具体实施方式 0033 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0034 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0035 银毛龙葵 (Solanum elaeagnifolium) ： 记载于 “张伟 , 范晓虹 , 赵宏 . 外来入侵 杂草银毛龙葵 . 植物检疫 ,2013 年 。
24、04 期” 一文， 公众可从申请人处获得， 仅用于重复本 发明实验使用。 0036 刺萼龙葵 (Solanum rostratum) ： 记载于 “刘勇 , 廖芳 , 杨秀丽等 . 重要检疫性杂 草刺萼龙葵分子生物学检测的研究 . 植物检疫 ,2011 年 02 期” 一文， 公众可从申请人处获 得， 仅用于重复本发明实验使用。 0037 水茄 (Solanum torvum) ： 记载于 “舒伟虎 , 周光雄 , 叶文才 . 水茄的化学成分研 究 . 中草药 ,2011,42(03):424-427” 一文， 公众可从申请人处获得， 仅用于重复本发明实验 使用。 0038 实施例 1、 鉴定。
25、银毛龙葵的 RPA 试剂盒的制备及鉴定方法的建立 0039 一、 鉴定银毛龙葵的 RPA 引物的设计 0040 本发明用于鉴定银毛龙葵的 RPA 的试剂盒， 含有用于特异性检测银毛龙葵的引物 对， 以及能结合单链核酸的重组酶、 单链 DNA 结合酶、 链置换型 DNA 聚合酶、 dNTPs、 醋酸镁 等。其中引物对的设计过程大致如下 ： 0041 根据检疫性茄属杂草银毛龙葵核基因 Solanum elaeagnifolium voucher Bohs 3204UT granule-bound starch synthase(GBSSI)gene(NCBI ： AY996412.1)， 采用引物。
26、设计 软件设计了多组理论可行的 RPA 引物， 并选出二组引物进行特异性实验验证， 这两组引物 为 ： 0042 Waxy-F1 ： 5 -AGCTTGTTCTGTCAAGTAAGTTACTAGCTGTATGG-3 ( 序列 1) ； 0043 Waxy-F2 ： 5 -ACTAGCTGTATGGTTGTCTTGACTTAATGTGGC-3 ； 0044 Waxy-R1 ： 5 -ATTGCCAAGGAGATTTCTGAAACTGGGATGT-3 ( 序列 2)。 0045 采用引物对 Waxy-F1/Waxy-R1 进行 RPA 反应， 目的扩增产物的理论大小为 210bp， 具体如序列表中。
27、序列 3 所示。 0046 采用引物对 Waxy-F2/Waxy-R1 进行 RPA 反应， 目的扩增产物的理论大小为 188bp。 0047 二、 基于 RPA 鉴定银毛龙葵的方法的建立 0048 1、 待测植物样本基因组 DNA 的提取 0049 供试茄属杂草标本 ： 银毛龙葵 (Solanum elaeagnifolium)、 北美刺龙葵 (Solanum carolinense)、 刺萼龙葵 (Solanum rostratum) 和水茄 (Solanum torvum)。 0050 取 0.1g 供试茄属杂草标本的叶和茎， 用液氮冷冻研磨后， 根据植物总 DNA 提取试 剂盒 ( 天。
28、根生化科技公司产品， 其产品目录号为 DP320) 的说明， 提取 DNA， 具体操作按照试 剂盒说明书进行。微量分光光度计 (Nanodrop) 测 DNA 的浓度， 保存于 -20。 0051 2、 RPA 反应 0052 采用 TwistDx 公司的试剂盒对步骤 1 提取的检疫性茄属杂 草总 DNA 进行 RPA 反应， 具体操作如下 ： 在 1.5mL 离心管中， 加入再水化缓冲液 (TwistDx 公司的试剂盒所含 )29.5L， 去离子水 12.4L， 正、 反向引物各 2.4L(10mol/L)， 植物基因组 DNA 0.8L(20.8ng/L)， 混合均匀后， 加入含有冻干酶 。
29、说 明 书 CN 105400884 A 6 5/6 页 7 粉 (TwistDx 公司的试剂盒所含 ) 的 0.2mL TwistAmp Basic 反应管， 充 分溶解， 最后加入醋酸镁溶液 2.5L(280mmol/L)， 充分混匀后在 38恒温水浴中反应 20 分钟， 得到扩增产物。反应体系中的再水化缓冲液的作用是溶解这些酶类， 并在 RPA 反应中 提供稳定的缓冲体系和 dNTP， 醋酸镁具有启动 RPA 反应的作用。 0053 3、 扩增产物的纯化 0054 采用 Beckman Agencourt AMPure XP 磁珠 (Beckman 公司产品， 其产品目录号为 A6388。
30、0)进行简单纯化， 加入80L磁珠溶液于50L步骤2反应后所得的RPA扩增体系中， 在室温静置 8min， 放于磁力架上， 用移液枪吸去反应液， 加入 200L 乙醇 / 水 (v/v， 4:1)， 在磁力架上洗 30s， 移去乙醇 / 水， 室温晾干， 加入 30L 高压灭菌过的二次蒸馏水， 与磁珠 充分混后， 在室温放置 5min， 放于磁力架上， 把液体转移到一个干净的离心管中， 备用。 0055 4、 1.5琼脂糖凝胶电泳检测 ： 0056 对上述步骤 3 磁珠处理过的扩增产物进行 1.5琼脂糖凝胶电泳检测， 紫外凝胶 成像观察。 0057 5、 目的条带的测序及分析 0058 6、 。
31、根据电泳和测序结果确定待测植物样品是否为银毛龙葵 0059 根据电泳和测序结果鉴定待测杂草的方法如下 ： 0060 (1) 采用引物对 Waxy-F1/Waxy-R1 进行 RPA 反应 0061 若所得扩增产物中含有 210bp( 序列表中序列 3) 的 DNA 片段， 则所述待测植物样 品来自于银毛龙葵 ； 若所得扩增产物中不含有210bp(序列表中序列3)的DNA片段， 则所述 待测植物样品不来自于银毛龙葵。 0062 (2) 采用引物对 Waxy-F2/Waxy-R1 进行 RPA 反应 0063 若所得扩增产物中含有188bp的DNA片段， 则所述待测植物样品来自于银毛龙葵 ； 若所。
32、得扩增产物中不含有 188bp 的 DNA 片段， 则所述待测植物样品不来自于银毛龙葵。 0064 7、 结果 0065 结果如图 1 所示 ： 0066 采用引物对 Waxy-F1/Waxy-R1 对银毛龙葵有特异性扩增， 能够扩增得到大小约为 210bp 的目的条带， 对其它三种检疫性茄属杂草无特异性扩增。进一步， 将 210bp 的目的条 带测序， 结果证实其序列确实如序列表中序列 3 所示。 0067 而采用引物对 Waxy-F2/Waxy-R1 对刺萼龙葵 (Solanum rostratum) 无特异性扩 增， 而对北美刺龙葵(Solanum carolinense)， 水茄(So。
33、lanum torvum)和银毛龙葵均能扩增 出大小约为 188bp 的目的片段。 0068 由此确定， Waxy-F1/Waxy-R1 这组引物可用于特异性检测银毛龙葵。即本发明所 提供的用于鉴定银毛龙葵的 RPA 试剂盒中的引物对为由序列表中序列 1 和序列 2 所示两条 单链 DNA 分子所组成的引物对。 0069 实施例 2、 RPA 的快速分析 0070 以银毛龙葵的叶和茎作为供试样本， 采用上述实施例 1 筛选鉴定的引物对 (Waxy-F1/Waxy-R1， 序列 1 和序列 2) 进行 RPA 检测， 设计几个反应时间梯度， 即 10min、 20min、 30min、 40mi。
34、n、 60min、 90min， 分析 RPA 反应时间对检测的影响。其余操作参照实施例 1 步骤二。 说 明 书 CN 105400884 A 7 6/6 页 8 0071 结果发现 ： 反应 10min， 就能检测到大小为 210bp( 序列 3) 的目标条带， 20min 以 后， 扩增片断的亮度没有明显增加， 反应90min时， 亮度有所下降， 说明RPA反应能够在相对 短的时间内对 DNA 片断进行扩增， 该实验确定 20min 为 RPA 反应的优选。实验如图 2 所示。 0072 实施例 3、 RPA 检测的灵敏度分析 0073 将检疫性茄属杂草银毛龙葵的总DNA从20.8ng/。
35、L， 依次稀释到5.2、 1.04、 0.52、 0.104、 0.052、 0.0104ng/L， 用于 RPA 检测。在 25L 反应体系中， 加入上述溶液 1L， 得 到的 DNA 模板为 5.2、 1.04、 0.52、 0.104、 0.052、 0.0104ng。其余操作参见实施例 1 步骤二。 0074 RPA 反应结果显示 ： DNA 模板为 0.0104ng 时， 目标片段 (210bp， 序列 3) 也比较清 楚， 证明 RPA 反应具有较高的灵敏度。实验结果如图 3 所示。 0075 实施例 4、 RPA 检测茄属杂草种子 0076 为了验证引物对(Waxy-F1/Wax。
36、y-R1， 序列1和序列2)和方法对银毛龙葵的准确性 和用于口岸分析的可能性， 本发明的发明人利用 RPA 方法检测了杂草种子。 0077 供试检疫性茄属杂草种子为银毛龙葵 (Solanum elaeagnifolium)、 刺萼龙葵 (Solanum rostratum) 和水茄 (Solanum torvum) 的种子。 0078 主要步骤如下 ： 0079 1、 供试检疫性茄属杂草种子总 DNA 的提取 ： 将供试杂草种子用研钵磨碎后提取总 DNA， 具体采用植物总 DNA 提取试剂盒 ( 天根生化科技公司产品， 其产品目录号为 DP302) 进 行总 DNA 提取， 具体操作按照试剂盒。
37、说明书进行。微量分光光度计 (Nanodrop) 测 DNA 的浓 度， 保存于 -20。 0080 2、 RPA 反应 ： 以提取的杂草种子总 DNA 为模板， 进行 RPA 反应。具体参照实施例 1 步骤二进行。 0081 3、 RPA 扩增产物纯化 ： 利用磁珠法， 除去反应体系中的各种酶和盐， 用水溶解磁珠 上吸附的 DNA。具体参照实施例 1 步骤二进行。 0082 4、 RPA 扩增产物检测 ： 利用 1.5琼脂糖凝胶进行电泳检测， 并进行测序验证。 0083 结果发现 ： 本发明所建立的 RPA 方法只能特异性扩增出银毛龙葵的目标条带， 而 对刺萼龙葵 (Solanum rost。
38、ratum) 和刺茄 (Solanum torvum) 无特异性扩增。银毛龙葵的 目标条带为 210bp， 进一步， 将 210bp 的目的条带测序， 结果证实其序列确实如序列表中序 列 3 所示。1.5琼脂糖凝胶检测结果如图 4 所示。 0084 综合以上各实施例的结果， 可见用本发明所建立的 RPA 方法同时检测多种茄属检 疫性杂草， 结果说明 RPA 反应在短时间内就能够特异地扩增出银毛龙葵目标条带， 不需要 昂贵的仪器设备， 操作程序简单， 适合用于口岸和田间的快速检测。 说 明 书 CN 105400884 A 8 1/2 页 9 0001 序 列 表 CN 105400884 A 9 2/2 页 10 0002 序 列 表 CN 105400884 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 105400884 A 11 。