技术领域
本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法。
背景技术
原位肝移植是治疗终末期肝病的金标准。但是，肝源的短缺成为了肝细胞移植在临床应用上最大的瓶颈，限制的其有效开展。所以，找到合适的、丰富的肝细胞来源是现在生物学领域研究的热点。同时，大量研究证实，细胞疗法是治疗终末期肝病(End-stage liver diseases,ESLDs)有效的方法之一，应用前景十分光明。胎肝干/祖细胞(FLSPCs)具有成活率高，增殖量小，安全性高等优点，是用于肝脏疾病的干细胞治疗理想的细胞之一。在我们研究的早期阶段，我们申请了一种三步分离方法来富集FLSPCs，并获得与流式细胞分选方法相似的分离效率。并且，使用暴发性肝衰竭大鼠模型，我们证明FLSPCs可以促进肝形态发生和功能的恢复。
业已证实，胎肝干细胞是一种双向分化潜能的多能干细胞。在适当的信号通路的调节下，肝干细胞可以分化为成熟的肝细胞和胆管细胞。从而完成肝脏的损伤修复。胎肝干细胞能表达干细胞表面标志物，如CD133、EpCAM、CD49f、Dlk1、CD13等。肝干细胞体外能长期培养而保持染色体组型的稳定性不变，且其增殖分化潜能明显高于其他来源的干细胞。早期研究已证实：Wnt信号通路调控肝干细胞向肝细胞分化，而Notch信号通路则促进肝干细胞向胆管系分化，Notch信号是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的重要通路。Notch基因的配体Jagged1由Thy1+的肌纤维母细胞产生，并与肝干细胞上的受体作用从而活化下游信号通路，促进肝干细胞向胆管细胞分化。于此相反，Wnt信号分子作用于肝干细胞诱。
导β-链蛋白信号并同时表达Notch信号途径的抑制物，最终导致肝干细胞向胆管细胞分化的Notch信号通路受抑制，向肝细胞分化受促进。Notch信号途径是人体最重要的信号转导通路之一，其分子广泛表达于胚胎和成年个体组织中，主要由表达于相邻细胞上的Notch配体和Notch受体、以及表达于细胞内的转录因子、下游分子和其他调节分子组成。RBP-J是激活Notch信号通路所必需的一个核心转录因子，它的缺失意味着Notch信号的完全阻断。Notch信号途径对细胞的分化、增殖、凋亡有重要的调控作用，它广泛参与组织器官的发育、生长以及再生进程，其功能的异常与很多疾病及肿瘤发生有关。我们前期研究发现，肝再生的进程伴有Notch信号通路分子的广泛变化。Notch信号途径对于维持肝脏的稳态具有重要作用。然而，仍有一个问题需要解决，以探索FLSPCs的治疗潜力。
首先，如何准时诱导干细胞分化为肝细胞仍然是一个挑战。研究显示：Notch信号在调节许多类型的干细胞的分化和自我更新中起着关键作用。我们早期研究发现，Notch信号在FLSPC向肝细胞分化中发挥重要作用。然而，在从胎儿肝干/祖细胞分化为(FLSPCs)成熟的肝细胞的过程中Notch的作用，尤其是主要的Notch受体的作用是未知的。因此，需确定主要的促进FLSPCs分化的特异性Notch受体。同时，在组织水平和细胞水平上，我们发现与成人成熟肝脏和BRL细胞相比，Notch3是在胚胎14日的胎肝和FLSPCs中唯一表达较多的。
其次，我们从形态学表型和功能方面分析评价，在利用GSIs(c-分泌酶抑制剂，Notch抑制剂)抑制Notch信号通路后，FLSPCs向肝细胞分化的结果。结果表明作为GSI的类似物N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)能够促进FLSPC分化为成熟肝细胞，并且从FLSPC分化而来的细胞显示出与正常成熟肝细胞相似的表型和形态，表达成熟肝细胞的标记物，具有与成熟肝细胞类似的功能。因而得出，GSIs的分化效率、效能与肝细胞生长因子(HGF)诱导的相似。更具体地说，随着FLSPCs向成熟肝细胞的分化，Notch3的表达逐渐下调，与其他干细胞标记物下调一致。这些发现意味着Notch3可能不仅是FLSPCs分化成肝细胞的调节剂，而且也是FLSPCs的潜在标志。故一定程度的信号通路的失衡，可以调控肝干细胞向成熟肝细胞的分化，从而为成熟肝细胞治疗肝病带来希望。
细胞移植是在肝源短缺情况下治疗终末期肝病的最有效的潜在治疗方法。但是，细胞移植在临床应用上的最大瓶颈是如何大量获得大量的肝干细胞和如何快速有效的将肝干细胞诱导分化为具有功能的肝细胞。所以，如何解决这两个问题是目前生物学领域研究的热点。
在我们研究的早期阶段，我们获得授权了一种三步分离方法来富集FLSPCs的方法，并证明此方法获得的细胞与流式细胞分选方法相似的分离效率。并且，使用暴发性肝衰竭大鼠模型，我们证明FLSPCs可以促进肝形态发生和功能的恢复，从而解决了上述的第一个问题。
接下来，如何快速、高效的诱导胎肝干细胞分化为肝细胞仍然是一个挑战。胎肝干细胞是一种双向分化潜能的多能干细胞，在适当的信号通路的调节下，肝干细胞可以分化为成熟的肝细胞和胆管细胞。目前各种诱导分化的模型存在效率低、准确性差等缺点。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法以达到能够采用分离培养的胎肝干细胞，利用体外干细胞诱导技术，研究肝干细胞的多能性和肝细胞定向分化，并通过体内移植用于小鼠肝脏部分切除的急性肝损伤模型进行研究，为肝脏疾病的干细胞治疗提供一种新的途径的目的。
本发明所采用的技术方案为：一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)胎肝干细胞的分离培养和扩增；
2)胎肝干细胞的鉴定；
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6-8天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养6-8天；
c)将步骤b)所获得的细胞用加入含HGF的细胞快速扩增培养基，继续快速扩增6-8天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。
进一步地，所述步骤1)中进行胎肝干细胞的分离培养和扩增所采用的具体步骤如下：
a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；
b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；
c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
进一步地，所述步骤b)中的Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂，且γ-分泌酶抑制剂的浓度为0.5μmol/L-1.5μmol/L。
进一步地，所述γ-分泌酶抑制为DAPT、LY-450139、MK-0752、E2012、BMS-708163、PF-3084014以及2GSI-953中的任意一种。
进一步地，所述步骤c)中的细胞快速扩增培养基为加入HGF的Williams’E培养基，且HGF的稀释终浓度为15ng/mL-25ng/mL。
进一步地，还包括培养成熟肝细胞，其具体步骤如下：
A、对步骤(c)所培养的细胞每隔1-3天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理；
B、对步骤A所获得的细胞培养25-35天，即为成熟肝细胞。
进一步地，所述步骤2)中胎肝干细胞的鉴定方法：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定。
进一步地，所述免疫组化和免疫荧光多重抗体染色所采用的干细胞标记物为CD133、EpCAM、CD49f、Dlk1或CD13。
本发明的有益效果为：
1.本发明的成熟肝细胞分化的方法中细胞来源丰富，分离培养技术已掌握，提供了一种全新的肝干细胞来源；通过体外定向诱导分化为肝脏样功能细胞，提供了一种大量获得肝脏细胞的方法。
2.通过体内移植，发现该细胞不仅能融入受损伤肝脏，而且可以一定程度恢复肝脏白蛋白水平和抑制转氨酶的活性，为临床终末期肝病的治疗提供了一种新的选择。
3.本发明采用分离培养的胎肝干细胞，利用体外干细胞诱导技术，研究肝干细胞的多能性和肝细胞定向分化，并通过体内移植用于小鼠肝脏部分切除的急性肝损伤模型进行研究，证实其用于急性肝损伤治疗的可行性，为肝脏疾病的干细胞治疗提供一种新的途径。
附图说明
图1是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中肝干细胞向成熟肝细胞分化过程流程图；
图2是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中各种细胞表达Notch分子的相对表达量(A)；
图3是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中肝干细胞和正常成熟肝细胞表达各型Notch分子的相对表达量(B)；
图4是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中各种诱导剂诱导分化后成熟肝细胞标记物检测结果；
图5是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中各种诱导剂诱导分化后胆管细胞标记物检测结果；
图6是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中胎肝干细胞在DMSO、DAPT、HGF诱导分化后的细胞ICG排泄时间和正常成熟肝细胞排泄时间对比试验观察图；
图7是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中胎肝干细胞在DMSO、DAPT、HGF诱导分化后的细胞ICG排泄时间和正常成熟肝细胞排泄时间对比试验表格；
图8是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中DMSO、DAPT、HGF诱导分化的肝干细胞合成糖原能力检测观察图；
图9是本发明所提供的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法中DMSO、DAPT、HGF诱导分化的肝干细胞合成糖原能力检测对比表格。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1：
如图1所示，本发明中提供了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)胎肝干细胞的分离培养和扩增，主要为以下步骤：a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
2)胎肝干细胞的鉴定：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定，其中，所采用的干细胞标记物为CD133。
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，将匀浆液在3℃、19000G转速的离心条件下离心，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，配制为终浓度8％(体积分数)的溶液甲，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，选用γ-分泌酶抑制剂为Notch信号通路抑制剂，并配制γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基，标记为溶液乙，继续培养6天；γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基的配制方法如下：将γ-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜(DMSO),再用Williams’E培养基稀释为终浓度0.5μmol/L。其中，γ-分泌酶抑制优选为DAPT。
c)将步骤b)所获得的细胞用加入HGF的Williams’E培养基，继续快速扩增6天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为15ng/mL。
(3)对步骤(c)所培养的细胞每隔1天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理。
(4)对步骤(3)中所获得的细胞培养25天，即为成熟肝细胞。
实施例2：
如图1所示，本发明中提供了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)进行胎肝干细胞的分离培养和扩增，主要为以下步骤：a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
2)胎肝干细胞的鉴定：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定，其中，所采用的干细胞标记物为EpCAM。
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，将组织悬液在4℃、20000G转速的离心条件下离心处理，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，配制为终浓度10％(体积分数)的溶液甲，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养7天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，选用γ-分泌酶抑制剂作为Notch信号通路抑制剂，并配制γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基，标记为溶液乙，继续培养7天；γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基的配制方法如下：将γ-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜(DMSO)，再用Williams’E培养基稀释为终浓度1μmol/L。其中，γ-分泌酶抑制优选为LY-450139。
c)将步骤b)所获得的细胞用加入HGF的Williams’E培养基，继续快速扩增7天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为20ng/mL。
(3)对步骤(c)所培养的细胞每隔2天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理。
(4)对步骤(3)中所获得的细胞培养28天，即为成熟肝细胞。
实施例3：
如图1所示，本发明中提供了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：
1)进行胎肝干细胞的分离培养和扩增，主要为以下步骤：a、利用Percoll非连续密度梯度离心富集大鼠胎肝细胞；b、利用时差贴壁和时差消化对培养的胎肝细胞进行纯化；c、利用Percoll连续密度梯度离心富集大鼠胎肝干细胞。
2)胎肝干细胞的鉴定：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定，其中，所采用的干细胞标记物为CD49f。
(2)胎肝干细胞的诱导分化：
a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，将组织悬液在5℃、21000G转速的离心条件下离心处理，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，配制为终浓度12％(体积分数)的溶液甲，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养8天；
b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，选用γ-分泌酶抑制剂作为Notch信号通路抑制剂，并配制γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基，标记为溶液乙，继续培养8天；γ-分泌酶抑制剂Williams’E培养基的配制方法如下：将γ-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜(DMSO)，再用Williams’E培养基稀释为终浓度1.5μmol/L。其中，γ-分泌酶抑制优选为MK-0752。
c)将步骤b)所获得的细胞用加入HGF的Williams’E培养基，继续快速扩增8天，以获得有功能的肝细胞，主要用于细胞的快速增殖。所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为25ng/mL。
(3)对步骤(c)所培养的细胞每隔3天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理。
(4)对步骤(3)中所获得的细胞培养35天，即为成熟肝细胞。
在上述实施例1-实施例3中，可采用c-jun替代HGF作为使细胞扩增的细胞因子，两者均可发挥同等作用的使细胞扩增。
由图2中可知，成熟肝细胞在Notch3的信号通道受到抑制；
图3可知，成熟肝细胞相对肝干细胞在Notch3的信号通道受到抑制；
图4可知，各种诱导剂诱导分化后成熟肝细胞标记物的表达量值分布情况；
图5可知，各种诱导剂诱导分化后胆管细胞标记物的表达量值分布情况；
图7可知，HGF诱导分化后的细胞ICG排泄时间较正常成熟肝细胞排泄时间更长；
图9可知，HGF诱导分化的肝干细胞合成糖原能力较其他诱导剂的能力更强。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。