技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法。
背景技术
植物病虫害一直是农业生产的大敌，严重影响着农作物的生长，制约着农业的持续发展，造成了巨大的经济损失，因此关于植物病害防治的研究越来越受到重视。目前我国主要以化学农药防治为主，长期大量施用对生态环境和我们人类都造成严重危害。随着生物防治植物病害研究的深入，这种绿色、对环境友好、人畜无害、可降低化学农药的使用的防治方法，得到社会越来越多的关注和认可，成为近年来研究植物病害防治的热点，其中拮抗细菌在生物防治中发挥着重要作用。
目前在拮抗细菌中研究最多的是芽孢杆菌，芽孢杆菌以其种类繁多、环境友好、易定植于植物根际表面等诸多优点，其产生的多种抗菌活性物质如脂肽类抗生素、抗菌蛋白或多肽类化合物对大多植物病原真菌都表现出很强的抑菌活性，且芽孢杆菌内生芽孢，抗逆性强，繁殖速度快，有利于工业化生产。利用微生物防治植物病害具有广阔的应用前景。
杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)是芽孢杆菌属的一种，杰米拉类芽孢杆菌能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶或多肽等活性物质，对植物病原细菌、真菌有很好的抑制作用，显著提高植物的抗病性，同时能促使植物生长，提高植物产量，是一种很好的生防促生菌。本发明申请人从深海沉积物中分离获得一株杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)ZDC-04，保藏号为CGMCC No.16231。经试验证明该菌株对由胶孢炭疽菌引起的果树(柑橘、苹果、葡萄)炭疽病和由尖孢镰刀菌引起的蔬菜枯萎病均具有良好的防治效果。
微生物菌剂绝大部分以活菌作用，有效的活菌数是其重要的质量指标，菌剂中必须含有一定量的活菌数才能达到作用。我国对各种批准生产的菌剂都有明确的有效活菌数量和用量的规定。活菌数与芽孢得率是衡量杰米拉类芽孢杆菌菌剂的重要指标，但目前国内外很少对生防杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵优化的研究，且高密度发酵工艺优化中多数只提高活菌数，而芽孢形成数并不高，芽孢数低将导致菌剂的活性和质量不稳定，保存时间大幅降低，不适合实际使用防病。因此，开发一种既具有生防功能，又高芽孢数的菌剂产品对于实际的应用具有非常大的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法。本发明使用廉价易得的的农副产品作为碳、氮源液体发酵生产杰米拉类芽孢杆菌，降低其生产成本，提高单位体积发酵液中的活菌数和芽孢得率，为杰米拉类芽孢杆菌的工业化生产以及推广提供参考。
本发明首先提供了一种杰米拉类芽孢杆菌的发酵培养基，包括以下组分：玉米粉、豆粕粉、麸皮、蔗糖、碳酸钙、磷酸二氢钾和氯化钠。本发明所使用的杰米拉类芽孢杆菌为杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)ZDC-04。
优选的，本发明的发酵培养基组成为：玉米粉12-30g/L，豆粕粉5-17g/L，麸皮5-14g/L，蔗糖6-12g/L，碳酸钙1-5g/L，磷酸二氢钾1-6g/L，氯化钠0-5g/L、初始pH值为6.4-7.4。
更优选的，本发明的发酵培养基组成为：玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，麸皮8g/L，蔗糖6g/L，碳酸钙5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠2g/L、初始pH值为6.4-7.4。
所述的豆粕粉为粉碎后的豆粕，所述的麸皮为小麦粉碎后的麸皮，所述的氯化钠为工业氯化钠，其中蔗糖为一级白砂糖。
本发明提供了上述发酵培养基在发酵杰米拉类芽孢杆菌中的应用。
本发明还提供了一种杰米拉类芽孢杆菌的高密度发酵方法，其特征是，将杰米拉类芽孢杆菌活化后，经一级、二级种子液制备和发酵培养，当发酵液中90％以上菌体转化为芽孢时，停止发酵；
具体包括以下步骤：
(1)摇瓶一级种子液制备：将活化后的杰米拉类芽孢杆菌转入摇瓶种子培养基，在温度为28-37℃、摇床转速为160-200r/min下培养16-30h；
所述摇瓶种子培养基组成为：蛋白胨10±2g/L、酵母提取物10±2g/L、蔗糖30±5g/L，pH6.5±0.1。
(2)种子罐二级种子液制备：将培养好的摇瓶种子液按接种量1-5％(体积比)转接入二级种子培养基中，于温度30±2℃下培养14-18h；
所述二级种子培养基组成为：玉米粉20±5g/L、豆粕粉15±3g/L、蔗糖30±5g/L、磷酸二氢钾5±1g/L，pH 6.5±0.1。
(3)将步骤(2)中所得的种子液按3-10％(体积比)的接种量接入装有上述发酵培养基的发酵罐中，于30±2℃发酵培养，当发酵液中90％以上菌体转化为芽孢时，停止发酵。
优选的，所述步骤(2)的搅拌转速300-400r/min、装液量50-70％，通气量0.4-1m3/h，罐压0.03-0.05Mpa。
所述的，所述步骤(3)发酵培养时，0-10h，发酵条件为：搅拌转速300-400r/min、通气量2-4m3/h，罐压0.03-0.05Mpa；11h之后的发酵培养条件为：搅拌转速200-300r/min、通气量1-2.5m3/h，罐压0.03-0.05Mpa。
进一步的，所述活化杰米拉类芽孢杆菌菌种方法：将沙土管保存的杰米拉类芽孢杆菌划线接种于LB培养基平板上进行培养，28-37℃下培养16-48h，然后挑取单菌落划线转接于LB斜面培养基，28-37℃下培养16-48h后得活化菌种；所述的LB平板培养基与LB斜面培养基的组成为：蛋白胨100g/L，氯化钠100g/L，酵母提取物50g/L，琼脂15-20g/L、pH 6.5±0.1。
本发明在杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵工艺中，根据摇瓶一级种子、二级种子和发酵罐发酵情况的不同，分别配制了不同的培养基以提高种子活力促进高密度发酵。此外，在发酵培养过程中采用了两步发酵技术，第一步目的使得菌体在短时间内大量增殖，第二步营造不适于菌体生长的环境，促进活菌向芽孢的转变，提高芽孢生成率，从而使活菌数与芽孢得率都能得到提高。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明首次研究了杰米拉类芽孢杆菌的高密度发酵工艺，为杰米拉类芽孢杆菌的工业化生产以及推广提供参考；
2)本发明发酵培养基的原料主要来自廉价易得的农副产品玉米粉、豆粕粉、麸皮，成本低，易于扩大生产；
3)本发明发酵工艺简单，发酵周期短(15h)，有效活菌数和芽孢得率高，在50L发酵罐规模条件下，有效活菌数达7.5×109cfu/mL以上，产芽孢率达92.6％以上。
具体实施方式
实施例1：杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的分离与筛选
(1)杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的分离方法
本发明的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04分离于东海海底沉积物(120.6°E，34°N)，水深17米，采用稀释涂布法分离获得，具体方法为：称取10g海底沉积物样品溶于90mL无菌水中，置于摇床中振荡30min，使样品与水充分混合，即获得10-1稀释液。取1ml上述稀释液至9ml无菌水中，摇匀即获得10-2稀释液。相同的方法得到10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。分别取10-4、10-5、10-6的稀释液100μL于倒好的LB平板中，用涂布器将稀释液涂布均匀，每个浓度重复3次。置于30℃的恒温箱中培养48h，挑取培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化，并分别编号保存。
(2)胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌拮抗芽孢杆菌的筛选
①初筛：采用对峙平板法，以胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌为靶标，PDA平板中央划线接种细菌，距细菌2.5cm的两端接种病原菌菌饼，25℃恒温培养，对照只接种病原菌菌饼。每个处理设3个重复，待对照长满3/4培养皿时，测量抑菌带宽度，筛选出对上述病原菌有明显拮抗作用的细菌菌株。
②复筛：初筛后的细菌菌株制备种子液，取2mL种子液接种于100mL LB培养基中，180r/min、30℃恒温振荡培养48h。采用菌丝生长速率法，将发酵液与融化后冷却的PDA培养基(45～50℃)混匀，倒平板，以加入等体积LB液体培养基的PDA培养基作为对照，于平板中央接种直径为5mm的病原菌菌饼。每个处理设3个重复，待对照长满3/4培养皿时，十字交叉法测量对照组及处理组菌落直径，计算抑菌率，筛选出对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌拮抗效果最优的细菌菌株。
抑制率(％)＝(对照菌落半径(mm)―处理菌落半径(mm))/对照菌落半径(mm)×100
(3)结果与分析：利用稀释平板法从海底沉积物中分离得到20株细菌，对峙平板法筛选出7株对上述病原菌有明显抑制效果的拮抗菌株，占所分离菌株的35％，其中菌株ZDC-04拮抗效果最好，对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的抑菌带宽度分别为17.00mm和15.50mm。选取该菌株的发酵液于PDA培养基中稀释10倍进行菌丝生长速率法试验，结果表明该菌株的发酵液对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率分别为100％和96.5％。
本发明还通过田间试验证明：杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的发酵液对柑橘炭疽病的叶片和果实的防效分别为81.53％和81.82％。
实施例2：杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的鉴定
(1)菌株形态：菌体长杆状，大小为(0.5～1.1)μm×(3.2～5.2)μm，产芽孢，革兰氏染色呈阳性。在LB培养基上30℃培养48h，菌落呈白色，圆形，边缘凸起。
(2)分子鉴定结果
该菌株的16S rRNA基因序列测定结果(SEQ-1)如下：
AAGCTTGCTTCTAATTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGATAGAGTAACTGCTCTTGAAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGATCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGGAGCGATCTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC
根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株ZDC-04与Paenibacillus jamilae序列相似性为100％，故将菌株ZDC-04鉴定为杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)。该菌株已于2018年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.16231。
实施例3：发酵培养基的筛选
一、菌种的活化
将沙土管保存的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04划线接种于LB培养基平板上进行培养，30℃下培养48h，然后挑取镜检，将典型的单菌落划线转接于LB试管斜面培养基，30℃下培养48h后得活化菌种，备用；
LB培养基的组成为：蛋白胨100g/L，氯化钠100g/L，酵母提取物50g/L，琼脂15-20g/L、pH 6.5±0.1，121℃高压蒸汽灭菌30min。
二、发酵培养基的确定
本发明的发酵培养基主要经过以下步骤得到：
1、杰米拉类芽孢杆菌发酵培养基的筛选
本发明首次研究杰米拉类芽孢杆菌，本发明利用NCBI和中国知网查阅国内外相关文献发现，并无杰米拉类芽孢杆菌发酵培养基的报道，因此只能借鉴与杰米拉类芽孢杆菌亲缘关系最近的菌株的发酵培养基，查找出了11种，然后结合菌种生长条件、发酵原理和产孢条件等对11种发酵培养基进行筛选，最后确定了3种芽孢杆菌发酵培养基，进行后续实验。
2、杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04发酵培养基成分的确定
分析发酵培养基的原理及产孢条件，并结合实际原料购买途径和成本等，并结合单因素试验法培养基成分进行筛选，结果评价采用稀释平板计数法。最后确定主要培养基成分为玉米粉，豆粕粉，麸皮，蔗糖。
3、杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04发酵培养基成分含量的确定
发酵培养基营养成分通过正交试验法，最后确定培养基成分及含量：玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，麸皮8g/L，蔗糖6g/L，碳酸钙5g/L，磷酸二氢钾5g/L及氯化钠2g/L。
4、发酵温度的确定
发酵培养基接种后，设定发酵温度分别为25、28、30、35、37℃，摇床转速200r/min，测定活菌量和芽孢率，试验重复三次。最终确定其最佳培养温度为30℃。
5、发酵pH的确定
设定培养基初始pH值分别为：6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，接种后，培养温度为37℃，摇床转速200r/min，测定活菌量和芽孢率，试验重复三次。最终确定其最佳pH值为6.5±0.1。
实施例4：50L发酵罐高密度发酵杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04
摇瓶种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、蔗糖30g/L、pH 6.5±0.1；
二级种子培养基：玉米粉20g/L、豆粕粉15g/L、蔗糖30g/L、磷酸二氢钾5g/L、pH 6.5±0.1；
发酵培养基：玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，麸皮8g/L，蔗糖6g/L，碳酸钙5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠2g/L，初始pH6.5±0.1。
(1)摇瓶一级种子液制备：在1个500mL三角瓶中装入摇瓶种子培养基，121℃高压蒸汽灭菌30min，将实施例1中活化后的杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04在超净工作台中用接种环接入摇瓶种子培养基中，培养条件为：温度30℃、摇床转速200r/min、培养时间24h。
(2)种子罐二级种子液制备：将步骤(1)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后，按2％的接种量接入10L二级种子罐中，培养条件：温度30℃、搅拌转速300r/min，通气量0.6m3/h、罐压0.04Mpa，培养14h。
(3)50L发酵罐高密度发酵培养：将步骤(2)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按5％的接种量接入50L发酵罐中，发酵罐装液量30L。发酵0-10h，培养条件为：温度30±0.1℃、搅拌转速400r/min、通气量3m3/h，罐压0.03-0.05Mpa；11h之后的发酵培养条件：温度30±0.1℃、搅拌转速300r/min、通气量1m3/h，罐压0.05Mpa。发酵液镜检发现视野中90％以上菌体形态为芽孢时，发酵停止，发酵周期为15h，发酵液备用。
(4)菌体数量和芽孢得率计算
1)菌体总数的测定：稀释平板涂布法计数，计数单位cfu/mL；
2)芽孢总数的测定：菌液于80℃水浴加热15min，杀死营养体细胞，采用梯度稀释平板涂布法；
3)芽孢率计算公式：指样品按照活菌总数计算和灭活后芽孢计算分别测定活菌总数和芽孢数，计算公式为：
芽孢率＝(芽孢数/活菌总数)×100％
(5)实验结果：
在50L发酵罐规模条件下，发酵周期为15h，有效活菌数达7.5×109cfu/mL以上，产芽孢率达92.6％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛中达农业科技有限公司
<120> 一种杰米拉类芽孢杆菌高密度发酵方法
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 杰米拉类芽孢杆菌ZDC-04的16S rRNA基因序列
<400> 1
aagcttgctt ctaattaacc tagcggcgga cgggtgagta acacgtaggc aacctgccca 60
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cc 1382