技术领域
本发明属于酿酒技术领域，具体涉及使利用高产丁酸和己酸的功能微生物菌群快速制备 人工窖泥的方法。
背景技术
在浓香型白酒生产过程中，窖池既是发酵容器，其中的窖泥又是酿酒功能微生物的主要 来源之一。窖泥中的微生物多为厌氧菌，其代谢产生的丁酸、己酸以及与乙醇生成的脂肪 酸酯是浓香型白酒的主体风味物质，因此窖泥的产酸呈味能力直接决定着窖池的质量，最 终影响白酒酒质和酒体风格。窖泥中的产酸功能微生物是在生产过程中经过长年驯化、逐 渐富集的，因此有业界有“百年老窖出好酒”的说法。
随着我国白酒产业规模的扩大，各酒企都兴建了相当数量的窖池，但是窖池中的功能微 生物并不是一朝一夕形成的，因此人工窖泥的制备成了制约高品质白酒产量增加的主要限 制因素。目前，人工窖泥制备过程中的微生物主要来源于接种的老窖龄优质窖泥，由于优 质窖泥的稀缺性，限制了窖泥的接种量，最终大大延长了人工窖泥的制备时间和质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高效产丁酸、己酸能力的功能微生物菌群培 养，应用于人工窖泥的快速制备。
本发明提供了一种利用功能微生物菌群制备人工窖泥的方法。本发明方法包括以下步 骤：
a、用半合成黄水培养基分别厌氧发酵培养梭状芽孢杆菌属产丁酸、己酸微生物，然后 将培养液混合得窖泥产丁酸、己酸功能微生物菌群发酵液；
b、将pH值5.0的1:1黄水与水的混合液、功能微生物菌群发酵液、优质窖泥按照质量 比4～5：1：1的比例混合，制成悬液；
c、按照质量比9～12：6：1把黄泥、封窖泥和大曲粉混匀，加入步骤b制得的悬液， 控制该混合物含水率在45～50％之间；
d、将拌合完成的窖泥堆放，拍紧，密封厌氧发酵20～25天，即成初培窖泥；
e、将pH值5.0的1:1黄水与水的混合液、功能微生物菌群发酵液按照质量比4～5：1 混合均匀；
f、按照质量比30～40：20：1把黄泥、初培窖泥和大曲粉混匀，加入步骤e制得的悬 液，混匀制成窖泥混合物，控制窖泥混合物含水率在45～50％之间；
g、将步骤f得到的窖泥混合物对方，拍紧，密封发酵30～35天，即成人工窖泥。
其中，上述方法步骤a所述的高产丁酸和己酸的功能微生物菌为丁酸梭菌、酪丁酸梭菌 或克氏梭菌中的至少一种。
其中，上述方法步骤a中所述的半合成黄水培养基的配方为：乙酸钠4～6g/L、硫酸铵 0.3～0.7g/L、磷酸氢二钾0.2～0.6g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、酵母膏0.5～1.5g/L、半胱氨酸盐 酸盐0.3～0.7g/L，溶解于水与黄水按体积比各占一半的稀释液中，pH值为5.5～6.5，灭菌即 得。
其中，上述方法步骤a所述的梭状芽孢杆菌属产丁酸、己酸微生物的接种量为5～10％， 发酵温度33～37℃，厌氧发酵培养的时间为7天。
其中，上述方法步骤d所述的初培窖泥的的密封厌氧发酵期间控制窖泥堆心发酵温度在 25～35℃之间。
其中，上述方法步骤g所述的窖泥混合物密封发酵期间控制堆心发酵温度在25～35℃之 间。
其中，上述方法步骤a中各菌株分别发酵后得到的发酵液等比例混合得到混合发酵液。
可以理解的是，上述方法步骤b中所述的优质窖泥是来源于已有的经过生产实践证明能 够生产出高品质白酒的老窖窖泥。优选的，优质窖泥为来源于窖龄100年以上老窖的窖泥。
本发明同时还提供了由上述方法所制备的人工窖泥。
本发明的有益效果在于：本发明方法利用功能微生物菌群发酵液作为主要接种物之一， 增加了人工窖泥中功能微生物的初始含量，同时配合使用pH值为5的1︰1黄水作为人工 窖泥中微生物的主要营养源，此外还建立了独特的窖泥制备方法，从而大大缩短了制备人 工窖泥的时间，仅需要50～60天即可得到优质的人工窖泥。同时本发明方法降低了优质窖 泥的接种量，1份优质窖泥能得到60～70份人工窖泥，保护了优质窖泥资源，并可以快速获 得高质量的人工窖泥，提高了新窖的白酒的品质。本发明为新窖池窖泥的制备提供了一种 新的方案，具有广阔的应用前景。
说明书附图
图1、4个窖池中各取3份窖底泥，提取总DNA后，利用高通量测序解析窖泥中细菌群落 结构，对12个样本做主成分分析(PCA)的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步描述，并不因此将本发明限制在所述 的实施例范围中。
本发明使用功能微生物菌群发酵液作为主要接种物之一，这样可以增加人工窖泥中功能 微生物的初始含量，并大大缩短了制备人工窖泥的时间，仅需要50～60天即可得到优质的 人工窖泥。优选使用微生物为丁酸梭菌、酪丁酸梭菌或克氏梭菌中的至少一种。
此外，本发明还使用了pH值为5的1︰1黄水(本发明中的1︰1黄水指的是黄水和水 的等体积混合液，即等比稀释后的黄水)作为人工窖泥中微生物的主要营养源，主要利用 其中富含的低级醇和短链脂肪酸等碳源，研究发现，这些碳源可被窖泥微生物快速利用， 加速微生物的生长繁殖。而本发明创造性地把黄水培养基的pH值从一般的3.5左右调至弱 酸性的5.0，这样既能保持酸性环境抑制杂菌生长，又防止过酸抑制功能微生物活性。同时， 根据本发明的前期研究，利用稀释可把乙醇浓度降至2.5％左右，解除了高浓度乙醇对本发 明目标微生物以及其他发酵有益微生物的抑制。以上的种种措施结合起来，达到了降低优 质窖泥的接种量，保护优质窖泥资源，同时缩短制备时间，提高制得的人工窖泥的。
具体的本发明方法可按以下步骤进行：
a、功能微生物菌群的培养
产丁酸、己酸功能微生物分别在半合成黄水培养基(半合成黄水培养基的配方为乙酸钠 4～6g/L、硫酸铵0.3～0.7g/L、磷酸氢二钾0.2～0.6g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、酵母膏0.5～1.5g/L、 半胱氨酸盐酸盐0.3～0.7g/L，水与黄水按体积比各占一半，pH值为5.5～6.5，灭菌即得)中 培养，接种量5～10％，温度33～37℃，厌氧培养7天。然后将培养液等比例混合即得窖泥 产丁酸、己酸功能微生物菌群发酵液。
b、pH值5.0的1:1黄水、功能微生物菌群发酵液、优质窖泥按照质量比4～5：1：1的 比例混合，制成悬液。
c、把块状黄泥和封窖泥分别粉碎成粒径1～3cm大小的颗粒，按照质量比9～12：6：1 把黄泥、封窖泥和大曲粉混匀。
d、把步骤b制得的悬液加入步骤c制得的物料堆，控制物料堆含水率在45～50％之间。
e、将拌合完成的窖泥堆成圆锥形，拍紧，密封发酵20～25天，即成初培窖泥。期间控 制窖泥堆心发酵温度在25～35℃之间。
f、取调pH值至5.0的1：1黄水、功能微生物菌群发酵液按照质量比4～5：1混合均匀。
g、把块状黄泥和初培窖泥分别粉碎成粒径1～3cm大小的颗粒，按照质量比30～40：20： 1把黄泥、初培窖泥和大曲粉混匀。
h、把步骤f制得的悬液加入步骤g制得的物料堆，控制物料堆含水率在45～50％之间。
i、将加工完成的窖泥堆成圆锥形，拍紧，密封发酵30～35天，即成人工窖泥。期间控 制窖泥堆心发酵温度在25～35℃之间。
本领域技术人员在a步骤中功能微生物发酵液大量制备的时候可以采用分级扩大培养 的方式，最后可在发酵罐或者密闭容器中进行间歇震荡培养。这些都是本领域技术人员根 据现有技术容易实现的。在本领域，接种量指的是种子液的体积与接种后的体系的体积之 比。
在a步骤和f步骤中，为了窖泥微生物能尽快生长，黄水温度宜控制在30～40℃之间。
b步骤中，优质窖泥应来源于出酒品质高的窖池，最好选用100年窖龄以上的窖池。c 步骤和g步骤中中选用的黄泥宜选用深度10～30cm的农田土层，其中磷、钾和腐殖质丰富， 有利于窖泥微生物的生长。而c步骤和g步骤中，大曲粉选用市售常规大曲即可。为进一 步提高窖泥质量，优选用中温大曲。
本发明上述方法制备的人工窖泥是一种优秀的人工窖泥产品，能用于优质白酒的发酵过 程中。
以下用实施例对本发明方法进行更具体的说明。
实施例一、采用本发明方法制备人工窖泥
1、选取具产丁酸能力的菌株丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum，保藏号：ATCC19398) 和酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum，保藏号：ATCC25755)以及具有产己酸能力的 菌株克氏梭菌(Clostridiumkluyveri，保藏号：ATCC8527)在50L发酵罐中分别在半合成 黄水培养基中接种发酵，使用的半合成黄水培养基的配方为乙酸钠5gg/L、硫酸铵0.5gg/L、 磷酸氢二钾0.4gg/L、硫酸镁0.2gg/L、酵母膏1gg/L、半胱氨酸盐酸盐0.5gg/L、加1：1 无菌黄水(用水等体积稀释的黄水)至1000mL，调pH值为6.0，115℃灭菌20min。发酵 罐装液量20L，接种量10％，温度35℃，厌氧发酵7天，将各个菌种的培养液等比例混合 即得功能微生物菌群发酵液。
2、取60kg百年老窖窖泥，60kg功能微生物菌群发酵液，300kgpH值为5.0的1：1黄 水(用水等体积稀释的黄水)，搅拌成悬液。
3、取粉碎好的封窖泥300kg，大田黄泥450kg，中温大曲50kg，把三者混合均匀，含 水量约25％。
4、把步骤1悬液加入固态物料堆，一边加，一边充分混合，使土粒、菌体、曲粉混合 均匀，含水量约50％。
5、物料堆堆紧后，密封发酵25天，温度控制25～35之间，得到初培窖泥1100kg，含 水量约46％。
6、初培窖泥中加入2200kg黄泥(含水量约20％)，55kg曲粉，200kg功能微生物菌群 发酵液，800kgpH值为5.0的1︰1黄水。
7、物料堆堆紧后，密封发酵35天，温度控制25～35之间，得到人工窖泥约4000kg， 含水量约45％。
8、在新建窖池中敷上人工窖泥，投入粮糟发酵产酒。
采用本发明方法制备的人工窖泥的窖池(人工老窖)、新窖(黄泥、窖底泥、和封窖泥 混合而成)、30年窖池、50年窖池，在同样原料和工艺生产条件下，生产浓香型白酒，比 较白酒中主体香味物质含量，结果如表1所示。分别在4个窖池中各取3份窖底泥，提取 总DNA后，利用高通量测序解析窖泥中细菌群落结构，对12个样本做主成分分析(PCA)， 结果如图1所示。
表1各窖池出酒中主体香味物质含量(单位：g/L)
己酸乙酯 丁酸乙酯 乙酸乙酯 己酸 丁酸 乙酸 新窖 1.90 0.24 1.22 0.41 0.10 0.27 人工老窖 2.27 0.35 1.39 0.63 0.13 0.30 30年窖 2.35 0.38 1.53 0.65 0.18 0.33 50年窖 3.55 0.42 2.08 0.78 0.17 0.48
由表1可以看出，采用本发明制备的人工窖泥的人工老窖生产的浓香型白酒品质明显 高于新窖，主体香气物质含量接近30年窖池，与50年窖池仍有一定差距。而由图1的聚 类分析结果也可知，来自4个窖池的样本在PCA图中聚成3类，人工老窖与30年窖池中 窖泥的细菌组成相近，与新窖和50年窖的差异较大。此外，本方法每1份优质窖泥能得到 60～70份人工窖泥。较现有技术，比如专利文献CN102181342B中公开的1份优质窖泥产 出7～8份人工窖泥，优质窖泥的接种量降低了近90％，保护了优质窖泥资源。