技术领域
本发明属于化工和生物工程结合技术领域。
背景技术
姜黄色素通常称为姜黄素,是一种植物中稀少的天然二酮类色素,被认为最有开发价值的食用天然色素之一。在自然界中多存在于姜科、天南星科植物的块根或根茎中,是其主要生物活性成分。因其苯环侧链取代基不同,姜黄素在自然界存在多种形式。姜黄素作为一种安全无毒的色素,广泛应用于食品生产中的着色过程以及酸碱度的标定。近年来,姜黄素在降血脂、抗肿瘤、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等方面的药理作用逐步被发现证实。目前制备姜黄素的主要方法为植物提取、化学合成和微生物转化。微生物转化法可解决传统的植物提取法受植物种属限制所带来的不便,及化学合成法的高能耗、高污染问题,为姜黄素的生产提供了一种新的策略及技术手段,因此微生物转化制备姜黄素是一种不仅快速且绿色有效的安全途径,但目前的微生物转化方法是以阿魏酸或香豆酸为底物制备姜黄素,底物较单一且价格昂贵,限制了其工业化应用的前景,因此急需开发利用更廉价的大宗原料简便合成姜黄素的方法。
发明内容
本发明的目的是以香草醛及其类似物为原料,结合化学合成与生物转化途径,利用廉价原料制备姜黄素的利用香草醛及其类似物制备姜黄素的方法。
本发明步骤是:
①香草醛及其类似物化学合成制备生物发酵底物:
(1)将香草醛及其类似物和催化剂在50℃左右烘干至恒重,干燥保存备用;
所用催化剂为K2CO3、Na2CO3、CH3COOK或CH3COONa;
(2)在装有带干燥管和回流冷凝管的50mL圆底烧瓶内加入香草醛或其类似物和催化剂搅拌混匀,搅拌均匀后在烧瓶内加入6.7mL乙酸酐,油浴130-170℃,反应1-14h;
香草醛及其类似物与催化剂用量按照质量比计算1g:0.7-1.8g;
(3)反应后趁热将步骤(2)产生的棕黄色溶液倾倒在装有30g左右碎冰的烧杯中,终止反应,此时分离成油层和水层;
(4)将烧杯冷冻过夜分离出淡黄色粉末状物质,将产物抽滤,对滤饼进行水洗至水洗液无酸味;并将水洗产物在50℃烘干,保存备用;
②生物发酵制备姜黄素:
(1)从划线平板上挑取工程菌J1的单克隆菌落于一管含3mL LB培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的小试管中,37℃,250rpm摇床过夜培养,至菌体生长到对数生长中期;上述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为:胰蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min;
(2)将过夜培养的种子液按1:100加入到含30mL的发酵培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的250mL锥形瓶中,37℃,250rpm培养约2 h左右至OD600达到0.4-0.6,加入200μM IPTG诱导表达,30℃,250rpm摇床培养;上述发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为:蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;甘油4%;硫酸镁0.025%;磷酸氢二钠0.475%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min;
(3) 5 h后,加7mg步骤(1)产物,继续在30℃,250rpm摇床培养48 h;
(4)将步骤(3)经摇床培养得到的发酵液,在25℃,4000rpm,离心5min,去除上清;在沉淀中加入甲醇,重悬混合均匀,利用细胞超声破碎仪在600W连续超声2min;
(5)将破碎后的细胞萃取液于25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液;在沉淀中再次加入少量甲醇,重悬混合均匀,超声破碎仪在600W连续超声1min;将超声处理后的样品在25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液;将上述两次收集到的上清液合并进行旋转蒸发浓缩至干,即获得姜黄素。
本发明结合化学合成与生物转化途径,利用廉价原料制备姜黄素,不仅仅实现了姜黄素的快速安全合成,更具有非常重要的工程化意义。
具有以下优点和积极效果:
1. 以香草醛及其类似物为原料化学合成中间产物,作为生物发酵的底物,中间产物合成后不需要繁琐的分离和提纯步骤,且不会对后续微生物利用造成影响。
2. 化学合成的中间产物不需要去乙酰化,可直接用于生物发酵转化生产姜黄素,简化了操作流程,提高了产物利用效率且节省了反应时间。
3. 制备方法、操作工艺均简单,且整个合成过程不涉及任何有毒有害物质。
4. 避免了原料和气候条件的制约,在可控条件下实现姜黄素的生产制备。
附图说明
图1是实施例1条件下步骤1产品的LC-MS谱图;
图2是实施例1条件下步骤2产品的LC-MS谱图;
图3是实施例26条件下步骤1产品的LC-MS谱图;
图4是实施例26条件下步骤2产品的LC-MS谱图;
图5是步骤2产品的发酵实物图。
具体实施方式
本发明是以香草醛及其类似物为原料,通过化学反应生成可生物发酵利用的底物,经含有特定表达基因的大肠杆菌通过微生物发酵过程制备姜黄素的方法。该方法生产姜黄素工艺简单、操作简便且安全无毒。
本发明步骤是:
①香草醛及其类似物化学合成制备生物发酵底物:
(1)将香草醛及其类似物和催化剂在50℃左右烘干至恒重,干燥保存备用;
所用催化剂为K2CO3、Na2CO3、CH3COOK或CH3COONa;
(2)在装有带干燥管和回流冷凝管的50mL圆底烧瓶内加入香草醛或其类似物和催化剂搅拌混匀,搅拌均匀后在烧瓶内加入6.7mL乙酸酐,油浴130-170℃,反应1-14h;
香草醛及其类似物与催化剂用量按照质量比计算1g:0.7-1.8g;
(3)反应后趁热将步骤(2)产生的棕黄色溶液倾倒在装有30g左右碎冰的烧杯中,终止反应,此时分离成油层和水层;
(4)将烧杯冷冻过夜分离出淡黄色粉末状物质,将产物抽滤,对滤饼进行水洗至水洗液无酸味;并将水洗产物在50℃烘干,保存备用;
②生物发酵制备姜黄素:
生物发酵所用的菌株为工程菌J1,其可以表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,4CL)和姜黄素类合成酶(Curcuminoid synthase,CUS),以此来完成以下姜黄素的生物转化过程:
(1)从划线平板上挑取工程菌J1的单克隆菌落于一管含3mL LB培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的小试管中,37℃,250rpm摇床过夜培养,至菌体生长到对数生长中期;上述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为:胰蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min;
(2)将过夜培养的种子液按1:100加入到含30mL的发酵培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的250mL锥形瓶中,37℃,250rpm培养约2 h左右至OD600达到0.4-0.6,加入200μM IPTG诱导表达,30℃,250rpm摇床培养;上述发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为:蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;甘油4%;硫酸镁0.025%;磷酸氢二钠0.475%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min;
(3) 5 h后,加7mg步骤(1)产物,继续在30℃,250rpm摇床培养48 h;
(4)将步骤(3)经摇床培养得到的发酵液,在25℃,4000rpm,离心5min,去除上清;在沉淀中加入甲醇,重悬混合均匀,利用细胞超声破碎仪在600W连续超声2min;
(5)将破碎后的细胞萃取液于25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液;在沉淀中再次加入少量甲醇,重悬混合均匀,超声破碎仪在600W连续超声1min;将超声处理后的样品在25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液;将上述两次收集到的上清液合并进行旋转蒸发浓缩至干,即获得姜黄素。所得上清液稀释定容,液相检测确定姜黄素产量。
上述4CL和CUS的表达基因序列均来源于Genbank数据库,在Genbank中的登记号分别为U50846.1和AK109558,上述质粒pACYCduet-1-4CL以及pET28a-CUS是依据上述U50846.1和AK109558登记的基因序列进行全基因合成,并分别连入商品化工程质粒pACYCduet-1和pET28a获得,最后通过基因测序证明基因合成及质粒构建过程正确无误,以上基因合成及质粒构建工作由苏州金维智生物科技有限公司完成。根据《分子生物学实验指南》中描述的质粒转化大肠杆菌的常规方法,将质粒pACYCduet-1-4CL和pET28a-CUS转化入商品化大肠杆菌菌株BL21(DE3),获得工程菌J1。
本发明的化学合成和生物发酵过程如下:
。
为了更好的理解本发明,列举出如下实施例进行说明:
实施例1
1. 香草醛化学反合成乙酰阿魏酸作为生物发酵底物:
(1)将香草醛和K2CO3在50℃左右烘干至恒重。
(2)在装有带干燥管和回流冷凝管的50mL圆底烧瓶内加入干燥的香草醛1g和K2CO31.27g搅拌混匀,搅拌均匀后在烧瓶内加入6.7 mL乙酸酐,油浴160℃,反应8h。
(3)反应后趁热将步骤(2)产生的棕黄色溶液倾倒在装有30g左右碎冰的烧杯中,终止反应,此时分离成油层和水层。
(4)将烧杯冷冻过夜分离出淡黄色粉末状物质,将产物抽滤,对滤饼进行水洗至水洗液无酸味;并将水洗产物在50℃烘干,获得烘干产物1.35g,产物主要成分为乙酰阿魏酸。
2. 生物发酵制备姜黄素:
生物发酵所用的菌株为工程菌J1,其可以表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,4CL)和姜黄素类合成酶(Curcuminoid synthase,CUS),以此来完成以下姜黄素的生物转化过程:
(1)从划线平板上挑取工程菌J1的单克隆菌落于一管含3 mL LB培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的小试管中,37℃,250 rpm摇床过夜培养,至菌体生长到对数生长中期。上述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为:胰蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min。
(2)将过夜培养的种子液按1:100加入到含30 mL的发酵培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的250mL锥形瓶中,37℃,250 rpm培养约2 h左右至OD600达到0.48,加入200μM IPTG诱导表达,30℃,250 rpm摇床培养。上述发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为:蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;甘油4%;硫酸镁0.025%;磷酸氢二钠0.475%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min。
(3) 5 h后,加7mg步骤1产物,继续在30℃,250rpm摇床培养48 h。
(4)将步骤(3)经摇床培养得到的发酵液,在25℃,4000rpm,离心5min,去除上清。在沉淀中加入甲醇,重悬混合均匀,利用细胞超声破碎仪在600W连续超声2min。
(5)将破碎后的细胞萃取液于25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液。在沉淀中再次加入少量甲醇,重悬混合均匀,超声破碎仪在600W连续超声1min。将超声处理后的样品在25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液。所得上清液溶解定容,液相检测确定姜黄素产量,1g香草醛经化学合成与生物发酵生成姜黄素质量为0.64g。
上述4CL和CUS的表达基因序列均来源于Genbank数据库,在Genbank中的登记号分别为U50846.1和AK109558,上述质粒pACYCduet-1-4CL以及pET28a-CUS是依据上述U50846.1和AK109558登记的基因序列进行全基因合成,并分别连入商品化工程质粒pACYCduet-1和pET28a获得,最后通过基因测序证明基因合成及质粒构建过程正确无误,以上基因合成及质粒构建工作由苏州金维智生物科技有限公司完成。根据《分子生物学实验指南》中描述的质粒转化大肠杆菌的常规方法,将质粒pACYCduet-1-4CL和pET28a-CUS转化入商品化大肠杆菌菌株BL21(DE3),获得工程菌J1。
实施例2
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3改为Na2CO3,添加量为0.98g。
实施例3
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3改为CH3COONa,添加量为0.76g。
实施例4
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3改为CH3COOK,添加量为0.90g。
实施例5
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为1h。
实施例6
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为2h。
实施例7
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为3h。
实施例8
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为4h。
实施例9
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为6h。
实施例10
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为10h。
实施例11
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为12h。
实施例12
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为14h。
实施例13
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)油浴温度设定为130℃,反应时间设定为10h。
实施例14
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)油浴温度设定为140℃,反应时间设定为10h。
实施例15
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)油浴温度设定为150℃,反应时间设定为10h。
实施例16
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)反应时间设定为10h。
实施例17
其它步骤同实施例1,但将步骤1中(2)油浴温度设定为170℃,反应时间设定为10h。
实施例18
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为0.91g,(2)反应时间设定为10h。
实施例19
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为1.09g,(2)反应时间设定为10h。
实施例20
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为1.18g,(2)反应时间设定为10h。
实施例21
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为1.36g,(2)反应时间设定为10h。
实施例22
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为1.45g,(2)反应时间设定为10h。
实施例23
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为1.55g,(2)反应时间设定为10h。
实施例24
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为1.64g,(2)反应时间设定为10h。
实施例25
其它步骤同实施例1,但将步骤1中K2CO3添加量调整为1.82g,(2)反应时间设定为10h。
实施例26
1. 对羟基苯甲醛化学合成乙酰香豆酸作为生物发酵底物:
(1)将对羟基苯甲醛和K2CO3在50℃左右烘干至恒重。
(2)在装有带干燥管和回流冷凝管的50mL圆底烧瓶内加入干燥的对羟基苯甲醛0.8g和K2CO3 1.46g搅拌混匀,搅拌均匀后在烧瓶内加入6.7 mL乙酸酐,油浴160℃,反应10h。
(3)反应后趁热将步骤(2)产生的棕黄色溶液倾倒在装有30g左右碎冰的烧杯中,终止反应,此时分离成油层和水层。
(4)将烧杯冷冻过夜分离出淡黄色粉末状物质,将产物抽滤,对滤饼进行水洗至水洗液无酸味;并将水洗产物在50℃烘干,获得烘干产物1.37g,产物主要成分为乙酰香豆酸。
2. 生物发酵制备姜黄素:
生物发酵所用的菌株为工程菌J1,其可以表达4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,4CL)和姜黄素类合成酶(Curcuminoid synthase,CUS),以此来完成以下姜黄素的生物转化过程:
(1)从划线平板上挑取工程菌J1的单克隆菌落于一管含3 mL LB培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的小试管中,37℃,250 rpm摇床过夜培养,至菌体生长到对数生长中期。上述LB培养基中各组分用量占LB培养基质量用量的百分比分别为:胰蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min。
(2)将过夜培养的种子液按1:100加入到含30 mL的发酵培养基和50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素的250mL锥形瓶中,37℃,250 rpm培养约2 h左右至OD600达到0.48,加入200μM IPTG诱导表达,30℃,250 rpm摇床培养。上述发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为:蛋白胨1%;酵母浸粉0.5%;甘油4%;硫酸镁0.025%;磷酸氢二钠0.475%;氯化钠1%;pH7.0;于121℃灭菌20 min。
(3) 5 h后,加7mg步骤1产物,继续在30℃,250rpm摇床培养48 h。
(4)将步骤(3)经摇床培养得到的发酵液,在25℃,4000rpm,离心5min,去除上清。在沉淀中加入甲醇,重悬混合均匀,利用细胞超声破碎仪在600W连续超声2min。
(5)将破碎后的细胞萃取液于25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液。在沉淀中再次加入少量甲醇,重悬混合均匀,超声破碎仪在600W连续超声1min。将超声处理后的样品在25℃,4000rpm,离心5min,收集上清液。所得上清液溶解定容,液相检测确定姜黄素产量,1g对羟基苯甲醛经化学合成与生物发酵生成姜黄素质量为0.81g。
上述4CL和CUS的表达基因序列均来源于Genbank数据库,在Genbank中的登记号分别为U50846.1和AK109558,上述质粒pACYCduet-1-4CL以及pET28a-CUS是依据上述U50846.1和AK109558登记的基因序列进行全基因合成,并分别连入商品化工程质粒pACYCduet-1和pET28a获得,最后通过基因测序证明基因合成及质粒构建过程正确无误,以上基因合成及质粒构建工作由苏州金维智生物科技有限公司完成。根据《分子生物学实验指南》中描述的质粒转化大肠杆菌的常规方法,将质粒pACYCduet-1-4CL和pET28a-CUS转化入商品化大肠杆菌菌株BL21(DE3),获得工程菌J1。
下述表1为实施例1-4产物检测结果;表2为实施例1与实施例5-12产物检测结果;表3为实施例13-17产物检测结果;表4为实施例16与实施例18-25产物检测结果。由结果可知,K2CO3作为催化剂,1g香草醛投加1.45g K2CO3,反应温度为160℃,时间为10h,在此条件反应产物姜黄素的含量达到最高值。并且在此合成条件下进项对羟基苯甲醛的实验,来实现双去甲氧基姜黄素的合成 。
表1催化剂对合成产物与姜黄素产量的影响
不同催化剂,160℃油浴,反应8h后,合成产物与姜黄素的产量。
表2时间对合成产物与姜黄素产量的影响
不同时间,K2CO3 1.27g催化,160℃油浴反应后,合成产物与姜黄素的产量。
表3温度对合成产物与姜黄素产量的影响
不同温度,K2CO3 1.27g催化,反应10h后,合成产物与姜黄素的产量。
表4底物投加量对合成产物与姜黄素产量的影响
不同底物投加量,160℃油浴反应10h后,合成产物与姜黄素的产量。