本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年12月1日，申请号为 200580041847.3(PCT/US2005/043578)，发明名称为“测量对多西他赛抗药 性或敏感性的方法”。
发明领域
本发明涉及某些新颖、有效且在此之前是未知的方法，这些方法通过 测量特定遗传标记物较对照物的增加或减少，可预测或监测患者对于紫杉 醇类(taxoid)化合物分子的反应。本发明还提供了某些试剂盒，这些试剂盒 通过测量特定遗传标记物的核酸或蛋白质水平并与对照物或参照标记物比 较，可预测或监测患者对于紫杉醇类分子的反应。
发明背景
多西他赛(Docetaxel)是一种抗有丝分裂药物，广泛地用于乳癌、肺癌 和卵巢癌的治疗，其次，还用于头颈部、胃部和前列腺的癌症治疗(Hong， Oncology 16：9，2002)。多西他赛通过与β-微管蛋白结合以及阻止α-和β- 微管蛋白异二聚体的分解来抑制微管动力学过程，从而终止肿瘤的生长 (Ringel和Horwitz，J Natl Cancer Inst 83：288，1991)。多西他赛和一种 相关紫杉烷(taxane)即泰素(paclitaxel)的抗肿瘤活性，起因于靶向有丝分裂 纺锤体的微管，阻止染色体的排列和分离，阻止细胞周期进程并激活凋亡 途径(Wang等，Cancer 88：2619，2000)。通过涉及p53/p21waf1/Cip1、raf/ras 和有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的细胞信号事件，泰素的促凋亡活 性与Bcl-2的磷酸化和失活被联系起来(Wang等，Cancer 88：2619，2000)。 虽然多西他赛是一种比泰素更有效的抗癌剂，但涉及其细胞毒性的途径却 尚未很好地确定(Katsumata，Br J Cancer 89：S9，2003)。在所选择的细胞 系中观察到了多西他赛通过一种涉及Bcl-2磷酸化和胱天蛋白酶 -3(caspase-3)活化的机制所诱导的凋亡(Kolfschoten等，Biochem Pharmacol 63：733，2002)。在各种培养的细胞系内调节紫杉烷诱导的细胞 杀伤作用的其它蛋白包括HeLa细胞内的Aurora-A(Anand等，Cancer Cell 3：51，2003)、乳腺癌细胞内的HER-2(Tanabe等，Int J Oncol 22：875，2003)、 胶质母细胞瘤细胞内的p21waf1/Cip1(Li等，J Biol Chem 277：11352，2002) 以及卵巢癌细胞内的JNK/MKK1(Lee等，J Biol Chem 273：28253，1998)。
在本领域内存在着一种需要，即需要鉴别某些可诱导多西他赛抗药性 的药用蛋白，这种抗药性使这些蛋白在药物开发过程中可用于鉴别那些可 消除其活体内功能并能提高细胞对于抗肿瘤药物化疗敏感性的药剂(小分 子、siRNA等)。在本领域内还需要一种测定方法，用于在化疗前可靠地预 测哪些患者在接受基于多西他赛抗肿瘤药物的化疗之后会有起色，而哪些 患者则不会。申请人在本文中描述了一种新颖的测定方法，该测定方法能 预测对于多西他赛的抗药性和/或敏感性，并为能消除癌症抗药性的新疗法 的发展提供了某些筛选方法。
发明概述
依照本发明提供了某些新颖和有效的方法，通过比较患者和对照物体 内特定遗传标记物的活化和/或表达的水平，监测和/或预测患者对紫杉醇类 分子的反应。
在一实施方案中，本发明提供了一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类 分子的反应的方法，其包括以下步骤：
a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；
b)获得对照样品；
c)测量一种或一种以上遗传标记物的水平；以及
d)在测试样品和对照样品之间比较所测量的所述一种或一种以上 遗传标记物的水平；
其中，与对照样品相比，在测试样品内所测量的所述一种或一种以上 遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子抗药性的增强。
在本发明该方面所提供的特定遗传标记物包括：
BubR1：人(Homo spiens)的类似于蛋白激酶(BUBR1)mRNA，完 全cds(互补DNA)(GenBank登录号：AF046079)；
Mad2：人MAD2蛋白的mRNA(GenBank登录号：AJ000186)；
Mps1：人TTK蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank登录号： NM_003318)；
Rac1/CDC42的GEFT：人RAC/CDC42交换因子(GEFT)，转录 变体2，mRNA(GenBank登录号：NM_133483)；
Bub1：人BUB1(不受苯并咪唑1同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUB1)， mRNA(GenBank登录号：NM_004336)；
hSepharase：人额外纺锤体极样1(酿酒酵母(S. cerevisiae))(ESPL1)，mRNA(GenBank 登录号： NM_012291)；
CamKIId：人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)II δ(CAMK2D)，转录变体3，mRNA(GenBank登录号： NM_001221)；
CDK6：人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶6(CDK6)， mRNA(GenBank登录号：NM_001259)；和
GRB2：人生长因子受体结合蛋白2(GRB2)，转录变体1， mRNA(GenBank登录号：NM_002086)。
在另一实施方案中，本发明涉及一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类 分子的反应的方法，其包括以下步骤：
a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；
b)获得对照样品；
c)测量一种或一种以上遗传标记物的水平；以及
d)在测试样品和对照样品之间比较所测量的所述一种或一种以上 遗传标记物的水平；
其中，与对照样品相比，在测试样品内所测量的所述一种或一种以上 遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子敏感性的增强。
在本发明的这一具体方面，一种或一种以上遗传标记物可选自：
P21(Waf1)：人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1A(p21， Cip1)(CDKN1A)，转录变体1，mRNA(GenBank登录号： NM_000389)；
Pim-1：人pim-1癌基因(PIM1)，mRNA(GenBank登录号： NM_002648)；
GBP-1：人鸟苷酸结合蛋白1，干扰素可诱导，67kDa(GBP1)， mRNA(GenBank登录号：NM_002053)；
RXRA：人类类视黄醇X受体，α(RXRA)，mRNA(GenBank登录 号：NM_002957)；
SPF45：人RNA结合基序蛋白17(RBM17)，mRNA(GenBank登 录号：NM_032905)；
Hec1：人动粒相关2(KNTC2)，mRNA(GenBank登录号： NM_006101)；
Raf1：人raf癌基因的mRNA(GenBank登录号：X03484)；
Aurora A：人aurora-相关激酶1(ARK1)mRNA，完全 cds(GenBank登录号：AF008551)；
TACC3：人转化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3(TACC3)， mRNA(GenBank登录号：NM_006342)；
RelB：人v-rel网状内皮组织增生病毒癌基因同系物B，B-细胞3(鸟 类)的κ轻多肽基因增强子的核因子(RELB)，
mRNA(GenBank登录号：NM_006509)；
PRKCD：人蛋白激酶C，δ(PRKCD)，转录变体1，mRNA(GenBank 登录号：NM_006254)；
BRAF35：人高泳动族20B(HMG20B)，mRNA(GenBank登录号： NM_006339)；
HSPA1L：人热休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)，mRNA(GenBank 登录号：NM_005345)；
STK11：人丝氨酸/苏氨酸激酶11(波-杰综合征)(STK11)， mRNA(GenBank登录号：NM_000455)；和
MKK3：人MAP激酶激酶3(MKK3)mRNA，完全cds(GenBank 登录号：L36719)。
在一更进一步的实施方案中，本发明涉及一种预测或监测癌症患者对 紫杉醇类分子的反应的方法，其包括以下步骤：
a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；
b)测量选自以下一种或一种以上遗传标记物的水平：
BubR1：人的类似于蛋白激酶(BUBR1)mRNA，完全cds(互补 DNA)(GenBank登录号：AF046079)；
Mad2：人MAD2蛋白的mRNA(GenBank登录号：AJ000186)；
Mps1：人TTK蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank登录号： NM_003318)；
Rac1/CDC42的GEFT：人RAC/CDC42交换因子(GEFT)，转录 变体2，mRNA(GenBank登录号：NM_133483)；
Bub1：人BUB1(不受苯并咪唑1同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUB1)， mRNA(GenBank登录号：NM_004336)；
hSepharase：人额外纺锤体极样1(酿酒酵母(S. cerevisiae))(ESPL1)，mRNA(GenBank 登录号： NM_012291)；
CamKIId：人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)II δ(CAMK2D)，转录变体3，mRNA(GenBank登录号： NM_001221)；
CDK6：人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶6(CDK6)， mRNA(GenBank登录号：NM_001259)；和
GRB2：人生长因子受体结合蛋白2(GRB2)，转录变体1， mRNA(GenBank登录号：NM_002086)。
c)测量选自以下一种或一种以上参照遗传标记物的水平：
GAPDH：人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)，mRNA(GenBank登录 号：NM_002046)；和
RPS9：人cDNA克隆IMAGE：6647283，部分cds(GenBank登录 号：BC071941)；
d)比较测试样品中所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水平 和所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平；
其中，与所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平相比，在所述一 种或一种以上遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子抗药性的增强。
本发明的另一个进一步的实施方案涉及一种预测或监测癌症患者对 紫杉醇类分子的反应的方法，其包括以下步骤：
a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；
b)测量选自以下一种或一种以上遗传标记物的水平：
P21(Waf1)：人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1A(p21， Cip1)(CDKN1A)，转录变体1，mRNA(GenBank登录号： NM_000389)；
Pim-1：人pim-1癌基因(PIM1)，mRNA(GenBank登录号： NM_002648)；
GBP-1：人鸟苷酸结合蛋白1，干扰素可诱导，67kDa(GBP1)， mRNA(GenBank登录号：NM_002053)；
RXRA：人类类视黄醇X受体，α(RXRA)，mRNA(GenBank登录 号：NM_002957)；
SPF45：人RNA结合基序蛋白17(RBM17)，mRNA(GenBank登 录号：NM_032905)；
Hec1：人动粒相关2(KNTC2)，mRNA(GenBank登录号： NM_006101)；
Raf1：人raf癌基因的mRNA(GenBank登录号：X03484)；
Aurora A：人aurora-相关激酶1(ARK1)mRNA，完全 cds(GenBank登录号：AF008551)；
TACC3：人转化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3(TACC3)， mRNA(GenBank登录号：NM_006342)；
RelB：人v-rel网状内皮组织增生病毒癌基因同系物B，B-细胞3(鸟 类)的κ轻多肽基因增强子的核因子(RELB)， mRNA(GenBank登录号：NM_006509)；
PRKCD：人蛋白激酶C，δ(PRKCD)，转录变体1，mRNA(GenBank 登录号：NM_006254)；
BRAF35：人高泳动族20B(HMG20B)，mRNA(GenBank登录号： NM_006339)；
HSPA1L：人热休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)，mRNA(GenBank 登录号：NM_005345)；
STK11：人丝氨酸/苏氨酸激酶11(波-杰综合征)(STK11)， mRNA(GenBank登录号：NM_000455)；和
MKK3：人MAP激酶激酶3(MKK3)mRNA，完全cds(GenBank 登录号：L36719)。
c)测量选自以下一种或一种以上参照遗传标记物的水平：
GAPDH：人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)，mRNA(GenBank登录 号：NM_002046)；和
RPS9：人cDNA克隆IMAGE：6647283，部分cds(GenBank登录 号：BC071941)；
d)比较测试样品中所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水 平和所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平；
其中，与所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平相比，所述一种 或一种以上遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子易感性的增强。
本发明涉及预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的各种方法。 因此，本发明的一个进一步的实施方案包括紫杉醇类分子泰素、多西他赛 XRP9881和XRP6258。
通过采用下文中详述的各种技术来测量RNA、DNA或蛋白质的水 平，可评估本发明所述的各种遗传标记物。本发明的另一些实施方案则涉 及用于预测或监测患者对紫杉醇类分子的反应的各种试剂盒。
通过以下结合附图所作的详细说明，对本发明的上述方面和其它方 面、特点和优点将能更好地理解。
附图简述
图1显示了某些基因的特性，它们的下调可产生对多西他赛的抗药 性。所显示的多西他赛剂量效应曲线为用RB1、BubR1、Mad2和Mps1 siRNA(实心正方形)与对照siRNA(空心正方形)转染的HCT116细胞相比 的情况。RB1是在筛选中没有得分的siRNA的一个实例。在加入WST-1 之后于450nM吸收度条件下测量细胞存活率。最小比率(MR)是多西他赛 剂量为40nM时基因的WST-1值与对照物WST-1值的比率。
图2显示了将BubR1和Mps1shRNA(实心正方形)与对照 shRNA(空心正方形)比较的剂量效应曲线。
图3显示了在分别含有BubR1 shRNA和Mps1 shRNA的细胞内， 对BubR1 shRNA和Mps1 mRNA水平进行的TaqMan实时PCR分析。
图4分别显示了在使用或不使用多西他赛处理的情况下，用Mad2、 BubR1和Mps1 siRNA转染的HCT116细胞的细胞存活率和形态学。在 转染后24小时，对细胞不加处理(-多西他塞)或以200nM多西他赛处理(+ 多西他赛)，并在处理后16和72小时以钙荧光素-AM染色以显现活细胞。
图5显示了用Mad2、BubR1、Mps1和对照siRNA转染的HCT116 细胞继多西他赛处理之后的有丝分裂指数。转染后24小时细胞以200nM 多西他赛处理16小时和72小时并加以进一步处理。以磷酸化的组蛋白H3 抗体检测有丝分裂细胞，此处显示为染色细胞核的红色斑点(有丝分裂指数 试剂盒，Cellomics)。用Hoechst染料将细胞核染成蓝色。
图6显示了在分别用Mps1、BubR1和Mad2 siRNA转染的HCT116 细胞内，对Mps1、BubR1和Mad2 mRNA水平进行的TaqMan实时PCR 分析。
图7显示了用三种有丝分裂检查点基因siRNA转染的HCT116细胞 的细胞周期分析。在用Mps1、BubR1和Mad2 siRNA转染之后，未用多 西他赛(-多西他赛)处理细胞或以200nM多西他赛(+多西他赛)处理24小 时。在加入多西他赛后72小时，收获细胞并分析细胞周期。峰顶的数字表 示DNA含量，例如2N、4N、8N、16N或32N。
图8显示了使用稳定敲低细胞系进行的产克隆细胞存活分析。将含 有BubR1或载体对照shRNA的HCT116细胞接种在10cm培养皿中并 在5nM多西他赛中保持10天。用PBS洗涤克隆并以结晶紫染色。
图9显示了几种基因的剂量效应曲线，这些基因的下调能增加对多 西他赛的敏感性。所显示的多西他赛剂量效应曲线为用RB1、Pim-1、p21、 Aurora A和TACC3 siRNA(实心正方形)与对照siRNA(空心正方形)转染 的HCT116细胞相比的情况。最小比率(MR)是多西他赛浓度为40nM时 基因的WST-1读数与对照物WST-1读数的比率。IC50(IR)比率是基因的 IC50与对照物IC50的比率。
图10显示了Aurora A shRNA(实心正方形)与载体对照物(空心正方 形)比较的剂量效应曲线。
图11显示了在含有Aurora A shRNA的细胞内，对Aurora A mRNA 水平的TaqMan实时PCR分析。
图12显示了用Pim-1和TACC3 siRNA(实心正方形)与对照siRNA(空 心正方形)转染的HCT116细胞比较在增殖方面的区别。也就是在用 Pim-1、TACC3和对照siRNA转染后的不同时刻，在6孔培养板内剩下 的细胞数量。
图13显示了在siRNA转染后对Pim-1和TACC3 mRNA水平进行 的TaqMan分析。
图14显示了在用Pim-1和BubR1siRNA转染的HCT116细胞内活 性胱天蛋白酶-3的水平。使用活性胱天蛋白酶-3beadmates试剂盒 (Upstate)，活性胱天蛋白酶-3的水平显示为荧光强度。检查了3种多西他 赛的浓度(即0、5和40nM)以及3个时刻(即加入多西他赛后24、48和72 小时)的情况。
图15显示了用Pim-1和BubR1 siRNA转染的HCT116细胞内AKT 的磷酸化水平。磷酸化AKT和总AKT水平的比率是用基于珠的测定法 (bead-based assay)(Biosource)确定的。转染后24小时，对细胞不加处理或 以5nM和40nM多西他赛处理。在多西他赛处理后48小时，分析细胞裂 解物。计算磷酸化水平，并以磷酸化AKT(p-AKT)与总AKT(t-AKT)的比 率表示。
图16以Western印迹法结果显示转染后48小时Pim-1和BubR1的 水平下降。
发明详述
本发明以申请者对基因标记物的鉴定为充分依据，该基因标记物可预 测受试者对紫杉醇(taxoid)类药物是否具有抗性或敏感性。采用以细胞为基 础的RNA干扰(RNAi)筛选，申请者观察到对多西他赛的抗药性或敏感性 与特定基因标记物相关。
本专利说明及专利权要求中使用了许多术语及短语。这些术语及短语 的定义如下：
在本文中，“预后”这个术语，是指关于因癌症而引起的死亡或疾病 进程的预测或可能性，其中包括抗药性以及复发、转移扩散和赘生性疾病。
在本文中，“预测”这个术语，是指患者对一种药物或一组药物反应 良好或不良的可能性以及这些反应的程度，例如，患者于手术摘除原发性 肿瘤后及/或化疗一段时间后是否能存活而无癌症复发。本发明所预见的预 测方法可在临床上使用，通过为任何特定患者选择最合适的治疗方法，尤 其是紫杉醇类药物的化疗方法，而做出治疗决定。本发明的各种预测方法 对预测患者对某种治疗法(包括采用一种给定药物或药物组合的化疗及/或 放射治疗)是否反应良好，或在停止化疗或其它形式的治疗后能否长期存活 颇有价值。
在本文中，“肿瘤”这个术语是指所有良性及恶性的赘生细胞生长和 增殖，并指所有的癌前和癌性细胞与组织。
在本文中，“癌”和“癌性”是指哺乳动物的某种生理病状，其典型 特征为无节制的细胞生长。癌症的例子包括但不限于以下各种癌症：乳腺 癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢 癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、癌、黑素瘤、脑癌(包括成胶质细胞瘤和成神 经管细胞瘤)、胆道癌、绒膜癌、食道癌、胃癌、血液肿瘤(包括急性淋巴 细胞性和髓性白血病)、多发性骨髓瘤、爱滋病相关白血病和成人T-细胞白 血病淋巴瘤、上皮内肿瘤(包括鲍恩病和佩吉特病)、淋巴瘤(包括何杰金氏 病和淋巴细胞性淋巴瘤)、成神经细胞瘤、口腔癌(包括鳞状细胞癌)、肉瘤(包 括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包 括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞性癌和鳞状细胞癌)、睾丸癌(包括胚组 织瘤如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒膜癌)、间质瘤以及生殖细 胞肿瘤)、甲状腺癌(包括甲状腺腺癌和髓样癌)、肾癌(包括腺癌和维尔姆斯 瘤)。
在本文中，“患者”这个术语主要是指人，但也可包括非人类灵长类动 物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫和啮齿类动物。优选地，受试者是 人，其疑似患有癌症，或已确诊患有癌症，或属于患癌高危人群，例如有 家族癌症史。在本发明的优选实施方案中，癌为乳腺癌。鉴定疑似患有癌 症的受试者的方法包括手检、活组织检查、受试者家族病史、受试者病史 或若干成像技术，包括乳房X线照相、磁共振成像、磁共振波谱或正电子 发射断层扫描。癌症的诊断方法和癌症诊断的临床特性为医疗领域技术人 员所熟知。
在本文中，“样品”这个术语是指采用相关医疗领域内普通技术人员 熟知的方法所取得的组织。活组织检查等各种方法包括分割组织块、显微 解剖、以激光为基础的显微解剖或本领域内熟知的其它细胞分离方法。由 于病变组织活检材料中细胞类型的可变性和所用诊断方法灵敏度的可变 性，分析所需样品的细胞数量可从1、10、50、100、200、300、500、1000、 5000、10,000至50,000或更多不等。合适的样品大小取决于细胞组成和活 检状况，确定细胞组成和活检状况时的标准制备步骤及其后在本发明中所 采用的核酸分离方法为本领域内普通技术人员所熟知。例如，取自活检的 样品可能足以评价RNA表达而无需扩增。反之，若小型活检区域中细胞 数量未达合适的数量，则需要采用RNA转换方法和/或扩增方法，或采用 其它提高核酸分子分辨率的方法。所述的允许采用有限活检材料的方法为 本领域内普通技术人员所熟知。一些例子包括但不限于直接RNA扩增、 RNA反转录为cDNA、cDNA扩增或生成放射性标记核酸分子。
在本文中，关于样品的术语“测试”是指取自身体癌变区域的样品， 或取自显示某阶段癌变或癌变特征的身体区域的样品。
在本文中，关于样品的术语“对照”是指用于比较目的的样品。优选 地，这些样品为“对照”意思是指该样品未显示或据信未患有任何影响基 因表达的疾病或病症，在以这些样品作为标准的疾病方面尤其如此。也可 以这样认为：疾病和病症的不同阶段可以加以比较，在此情况下，“对照” 样品相当于该疾病或病症的较早阶段。例如，对照样品可以是取自身体上 非癌变但可比较部位的样品。此外，对照样品可取自同一个受试者的可比 较部位，或与该第一个受试者实质上相似的第二个受试者(物种、年龄、体 重、性别等相同或相似)的非癌变部位。最后，对照样品亦可取自对紫杉醇 类分子治疗产生良好反应的第二个受试者的癌变部位。
“核酸分子”是指核苷(腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧 啶核苷；“RNA分子”)或脱氧核苷(腺嘌呤脱氧核苷、鸟嘌呤脱氧核苷、 胸腺嘧啶脱氧核苷或胞嘧啶脱氧核苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合体形 式或其磷酸酯类似物(例如硫代磷酸酯和硫酯)，可为单链形式或双链螺旋 形式。也可能是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。核酸分 子(特别是DNA或RNA分子)这个术语仅指该分子的一级和二级结构，并 不限于任何特定的三级结构。因此该术语包括双链DNA分子，其形式可 为直链或环形DNA分子(如限制片段)、质粒和染色体。在讨论特定双链 DNA分子的结构时，可根据仅给出顺着5′端至3′端的方向沿着非转录DNA 链(即含有与mRNA同源序列的链)的序列的惯例来描述序列。“重组DNA 分子”是指已经过分子生物学操作的DNA分子。
在本文中，为特定蛋白质编码的、分离的核酸分子的“部分”这个术 语，是指包含编码肽或多肽的足够数量相邻核苷酸的分离核酸分子的部分 或片段。自然，分离核酸分子的一个“部分”不止一个核苷酸，而由这个 部分编码的肽或多肽含有许多氨基酸残基，如下文肽和多肽的定义所述。
在本文中，“肽”这个术语，是指由肽键共价连接的两个或两个以上 氨基酸。在一特定实施方案中，一个肽包含至少10个氨基酸，优选至少 20个、更优选至少30个、甚至更优选至少40个、最优选50个或更多氨 基酸。
在本文中，“多肽”这个术语，是指由多个相邻氨基酸组成的直链聚 合物，特别是多肽的分子量可高于100kD。
在本文中，“遗传标记物”这个术语，是指一生理组成成分，可用其 在样品中测定的RNA、DNA或蛋白质质水平来预测所测试受试者对紫杉 醇类药物是否有抗性或敏感性。此外，遗传标记物可编码特定蛋白质，也 可用作其活性与身体样品中遗传标记物的水平相关的蛋白质的“替代”标 记物。该相关性可以是正比关系，即蛋白质活性水平的下降对应于遗传标 记物水平的下降。或者，该相关性也可以是反比关系，即蛋白质活性水平 的下降对应于遗传标记物水平的上升。这种生理组成成分包括(但当然不限 于)细胞(例如其前体干细胞(progenitor stem cell))蛋白质、多肽、DNA、 RNA、碳水化合物或脂肪酸，在此仅举数例。在本发明的一个特定实施方 案中，根据已测定的基因标记物水平，可预测受试者对紫杉醇类药物是否 有抗性或敏感性。此类遗传标记物的例子包括但不限于下列各项：
BubR1：人的类似于蛋白激酶(BUBR1)mRNA，完全cds(互补 DNA)(GenBank登录号：AF046079)；
Mad2：人MAD2蛋白的mRNA(GenBank登录号：AJ000186)；
Mps1：人TTK蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank登录号： NM_003318)；
Rac1/CDC42的GEFT：人RAC/CDC42交换因子(GEFT)，转录 变体2，mRNA(GenBank登录号：NM_133483)；
Bub1：人BUB1(不受苯并咪唑1同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUB1)， mRNA(GenBank登录号：NM_004336)；
hSepharase：人额外纺锤体极样1(酿酒酵母(S. cerevisiae))(ESPL1)，mRNA(GenBank登录号： NM_012291)；
CamKIId：人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)II δ(CAMK2D)，转录变体3，mRNA(GenBank登录号： NM_001221)；
CDK6：人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶6(CDK6)， mRNA(GenBank登录号：NM_001259)；和
GRB2：人生长因子受体结合蛋白2(GRB2)，转录变体1， mRNA(GenBank登录号：NM_002086).
P21(Waf1)：人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1A(p21， Cip1)(CDKN1A)，转录变体1，mRNA(GenBank登录号： NM_000389)；
Pim-1：人pim-1癌基因(PIM1)，mRNA(GenBank登录号： NM_002648)；
GBP-1：人鸟苷酸结合蛋白1，干扰素可诱导，67kDa(GBP1)， mRNA(GenBank登录号：NM_002053)；
RXRA：人类类视黄醇X受体，α(RXRA)，mRNA(GenBank登录 号：NM_002957)；
SPF45：人RNA结合基序蛋白17(RBM17)，mRNA(GenBank登 录号：NM_032905)；
Hec1：人动粒相关2(KNTC2)，mRNA(GenBank登录号： NM_006101)；
Raf1：人raf癌基因的mRNA(GenBank登录号：X03484)；
Aurora A：人aurora-相关激酶1(ARK1)mRNA，完全 cds(GenBank登录号：AF008551)；
TACC3：人转化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3(TACC3)， mRNA(GenBank登录号：NM_006342)；
RelB：人v-rel网状内皮组织增生病毒癌基因同系物B，B-细胞3(鸟 类)的κ轻多肽基因增强子的核因子(RELB)， mRNA(GenBank登录号：NM_006509)；
PRKCD：人蛋白激酶C，δ(PRKCD)，转录变体1，mRNA(GenBank 登录号：NM_006254)；
BRAF35：人高泳动族20B(HMG20B)，mRNA(GenBank登录号： NM_006339)；
HSPA1L：人热休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)，mRNA(GenBank 登录号：NM_005345)；
STK11：人丝氨酸/苏氨酸激酶11(波-杰综合征)(STK11)， mRNA(GenBank登录号：NM_000455)；和
MKK3：人MAP激酶激酶3(MKK3)mRNA，完全cds(GenBank 登录号：L36719)。
在本文中，“参照遗传标记物”这个术语，是指所测定的RNA、DNA 或蛋白质质水平在服用紫杉醇类药物之前、期间或之后保持不变的生理组 成成分。“参照遗传标记物”被称为持家基因。这些基因的选择基于在诸 如癌症之类特定疾病的被检验系统中表达水平相对不变。持家基因用于使 表达的结果归一化。此类遗传标记物的例子包括但当然不限于以下两项：
GAPDH：人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)，mRNA(GenBank登录 号：NM_002046)；和
RPS9：人cDNA克隆IMAGE：6647283，部分cds(GenBank登录 号：BC071941)；
在本文中，“紫杉醇类分子”这个术语，是指属于紫杉烷族的一类化 疗化合物。紫杉醇类的具体成员包括但不限于泰素(紫杉醇)、多西他赛(泰 索帝)及其类似物(即XRP9881和XRP6258；参见Ojima和Gemey，Curr Opin Investig Drugs 4：737，2004)。由于此类分子为β-微管蛋白结合物， 可稳定类似于多西他赛的聚合形式的微管，因此可以预期，此处所描述的 生物标记物的临床表达将反映对这些药物的类似反应状况。
在本文中，“分子”、“化合物”或“药剂”等术语，是指现在已知 或以后发现的任何组合物。本专利中应用的化合物或药剂的例子包括有机 化合物(例如人造的、天然的和光活性化合物)、肽(例如人造的、天然的和 光活性化合物，即D型或L型氨基酸)、碳水化合物、核酸分子等。
在本文中，“杂交严格度”或“严格条件下的杂交”，是指本领域内 普通技术人员能够轻易判定的条件，通常是一种取决于探针长度、洗涤温 度和盐浓度的经验性计算。通常，较长的探针需要较高的温度，以便进行 适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处 于低于其解链温度的环境时变性DNA的重退火能力。探针与可杂交序列 之间同源性程度越高，所能采用的相对温度越高。于是，较高的相对温度 往往使反应条件更严格，而在较低的温度下，则严格度较低。关于杂交反 应严格度的进一步细节和解释，可参阅Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
在本文中，“严格条件”或“高度严格条件”是指下列参数：(1)洗涤 时采用低离子强度和高温，例如50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬 酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)杂交时采用甲酰胺等变性剂，例如42℃ 下50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷 酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸 钠；或(3)在42℃下过夜杂交，杂交溶液含50％甲酰胺，5x SSC(0.75M 氯化钠，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt’s溶液、超声波处理的鲑鱼精子DNA(50.mu.g/ml)、0.1％SDS 和10％硫酸葡聚糖，然后在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10 分钟，再以含有EDTA的0.1x SSC于55℃进行高严格度洗涤。适度严格 条件可按Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989中的描述加以鉴定，该适度严格条 件包括采用严格度低于以上描述的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度 和SDS百分比)。适度严格条件的一个例子为37℃下在一溶液中进行过夜 杂交，该溶液含20％甲酰胺、5x SSC(150mM氯化钠、15mM柠檬酸三 钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖、和 20mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA，然后于37-50℃在1x SSC中洗涤 滤膜。专业人员将会根据探针长度等因素调节温度、离子强度等。杂交核 酸时的适当严格度取决于核酸分子长度和互补程度，以及其它本领域内众 所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则含有这些 序列的核酸杂合体的Tm越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm) 以下列顺序递减：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。优选地，可杂交 核酸的最低长度至少约为12个核苷酸，优选至少约为16个、更优选至少 约为24个、最优选至少约为36个核苷酸。
在本文中，“标记”或“可检测标记”是指一种带有可检测标记的化 合物或组合物，它直接或间接与一种抗体、寡肽或其它有机分子缀合，而 生成“标记的”抗体、寡肽或其它有机分子。该标记本身可被检测到(如放 射性同位素标记或荧光标记)，或者，如果该标记为酶标记，则可催化可检 测的底物化合物或组合物的化学改变。
在本文中，“直接标记”是指在其自然状态下轻易可见的物体，可为 肉眼所见，或借助于滤光器和/或使用刺激(如以紫外光激发荧光)的情况下 可见。其例子包括但不限于加色标记、金属溶胶颗粒、染料溶胶颗粒、染 色乳胶或染料包封脂质体(见第4,313,734号美国专利、第4,373,932号美国 专利、WO 88/08534、EP-A 0 280 559、0 281 327、第4,703,017号美国专 利所描述)。其它的直接标记包括放射性核苷酸、不透射线物、荧光部分或 发光部分。
在本文中，“间接标记”是指可依照本发明加以使用的酶。与免疫测 定相关的各种类型的酶为本领域内所熟知，例如，碱性磷酸酶和辣根过氧 化物酶、溶菌酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶和尿素酶，Eva Engvall 在Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT一文(Methods in Enzymology， 70：419-439(1980))和第4,857,453号美国专利中详细地讨论了这些酶以及其 它一些酶。
在本文中，“试剂盒”这个术语是指包含一个或多个容器以及在容器 上或者与容器相关的标签(label)或说明书(package insert)的一种产品。在一 优选实施方案中，此类容器可包含带有可检测标记的抗体、带有可检测标 记的抗体片段、或带有可检测标记的寡核苷酸。在另一实施方案中，此类 容器提供各种手段，以便从身体样品获得总RNA，将总RNA反转录以获 得cDNA，以及使用一套引物对cDNA进行聚合酶链式反应，这套引物中 的一个或两个均具有可检测标记。试剂盒可包括其它容器，这些容器包含 诸如稀释液和缓冲剂、对照抗体、寡肽、或小的有机分子。该标签或说明 书可提供组成成分的描述，以及关于贮藏和旨在体外使用或诊断使用的说 明。
再则，按照本发明，可运用本领域的常规分子生物学、微生物学和重 组DNA技术。这些技术在文献中得到充分解释。参见：Sambrook，Fritsch 和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(本 文简称“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach， Volumes I和II(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait 编，1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames和S.J.Higgins编 (1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames和S.J.Higgins编 (1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
通常，RNAi技术使用合成的或载体生成的双链RNA以诱导含有同源 序列的mRNA的降解(McManus和Sharp，Nat Rev genet 3：737，2002)。 RNAi筛选已被用来阐明许多生物体中的基因功能，例如线虫 (Caenorhabditis elegans)(Simmer等，PloS Biol 1：E12，2003)，果蝇(Lum 等，Science 299：2039，2003)和哺乳动物细胞(Aza-Blanc等，Mol Cell 12：627， 2003)。
在本发明中，使用HCT116结肠癌细胞针对101种与癌相关的基因(大 多数为激酶族成员)筛选siRNA，并以高分辨率的剂量-效应曲线量化多西 他赛的杀伤作用。采用此方法，申请者已经证明9个基因(包括BubR1、 Bub1，Mad2、Mps1和GEFT Rac/CDC)的低水平表达可抑制多西他赛的 杀伤作用，而降低15个其它基因(包括Pim1、p21、TACC3和Aurora-A) 的表达可加强多西他赛所诱导的细胞死亡。
因此，本发明广泛扩展至某些诊断方法和试剂盒，可将这些诊断方法 和试剂盒用于鉴定正在服用多西他赛或考虑服用该药物的个体对该药物是 否会有抗性或敏感性。
申请者已经观察到对多西他赛的抗药性，抗药性与丧失一组广泛的检 查点控制基因相关，这些基因包括BubR1、Bub1、Mad2、Msp1和GEFT Rac/CD。
对多西他赛的敏感性增加与若干基因之一的丧失有关，这些基因包括 GBP-1、STK11、RXRA、Hec1、SPF45、Raf1、RELB、MKK3、PRKCD、 HSPA1A、BRAF35、Aurora-A、Pim-1、TACC3和p21waf1/Cip1，抑制 这些基因的抑制剂可在多西他赛疗法中用作有价值的辅助药。
有丝分裂的检查点基因可通过抑制Cdc20-APC(后期促进复合物)作为 延迟细胞分裂后期的可靠机制，直至姊妹染色单体的动粒正确附着于有丝 分裂纺锤体上，并在赤道板上排列(Zhou等，J Cell Sci 115：3547，2002)， 从而使细胞可靠地退出有丝分裂，并以精确的DNA互补进入另外的细胞 周期。如有微管抑制剂存在，退出有丝分裂的细胞不再能正确分离其染色 体，通常立即凋亡或在若干细胞周期后凋亡(Taylor和McKeon，Cell 89：727，1997)。微管抑制剂与有丝分裂检查点基因(如BubR1)丧失这两种 因素的结合可使细胞避免有丝分裂阻滞，而不经历细胞凋亡，从而导致染 色体不稳定性(CIN)和非整倍性(Shin等，Cancer Cell 4：483，2003)。近来， 在将微管抑制剂泰素用于处理其BubR1和Mad2下调的MCF-7细胞时， 产生了抗药性资料(Sudo等，Cancer Res 64：2502，2004)。
Pim-1基因编码一种属于相关激酶小家族的丝氨酸/苏氨酸激酶。 Pim-1的功能一直与增殖、分化、细胞凋亡，肿瘤发生、组织缺氧、血管 生成和有丝分裂联系在一起(Wang等，Biochim Biophys Acta 1593：45， 2002)。显微成像资料以及AKT低磷酸化资料和升高的胱天蛋白酶-3活性 测量值显示，通过使介导细胞生存的AKT信号失活，Pim-1的下调增强了 多西他赛诱导的细胞凋亡。Pim-1和p21在使HCT116细胞对多西他赛敏 化中具备极为相似的特点；与证明p21为Pim-1的磷酸化底物这一报道一 致(Wang等，Biochim Biophys Acta 1593：45，2002)。在不存在多西他赛的 情况下，Pim-1的下调诱导了一定程度的细胞凋亡，但当该药物存在时效 力则更高；然而在多西他赛不存在时下调转化酸性卷曲螺旋蛋白质TACC3 并不诱导细胞死亡，表明仅RNAi技术本身对细胞增殖没有影响。所述结 果表明不同蛋白质的损毁可引起细胞对多西他赛敏化的不同机制。
因此，在本发明的一个方面，可根据表I和表II中所述的一个或多个 基因的活化以及这些基因的蛋白质水平来选择治疗策略，并监测所选治疗 策略的有效性。
在一特定的实施方案中，我们提供了一种方法，监测化疗过程中表I 和表II中所示的一个或多个基因的活化水平，以评价和预测化疗对患者的 有效性。对取自肿瘤(如乳腺瘤、结肠瘤、非小细胞肺瘤和胃瘤)的活检材 料、或取自未确诊癌症患者或正接受治疗的患者的肿瘤活检材料的短期培 养物进行处理，以便分离出DNA(Hafner等，Arch Pathol Lab Med 127：1221，2003；Rodriguez等，Clin Cell Res 10：5785，2004)、信使 RNA(Chang等，Lancet.362：340，2003)和/或蛋白质(Espina等，J Immunol Methods 290：121，2004)，以评价表I和表II中所描述的基因或其亚群的活 化水平或蛋白质水平。基因转录和蛋白质表达图谱可用于诊断和预测可能 的治疗策略的疗效，并可作为监测患者治疗反应的有用工具。
按照本发明，可用本领域常用的任何现有方法(Ullmann等，J Biomol Screen 9：95，2004；Badiee等，BMC Biotechnol 3：23，2003)从肿瘤样品中 分离RNA。从受试者身上获取一个或多个细胞，并从细胞中分离出RNA。 例如，可从受试者身上获得外周血白细胞(PBL)，亦可以获得一细胞样品 后，针对需要的细胞类型富集该样品。可采用各种技术将细胞从细胞混合 体中分离出来，例如，采用与所需细胞类型上的特定表位结合的抗体来分 离细胞。如果所需的细胞是在固体组织中，则可使用显微切割或激光捕获 显微切割(LCM)之类的方法分割特定细胞(Bonner等，Science 278：1481， 1997；Fend等，Am J Path 154：61，1999)。可用各种方法从组织或细胞样 品中提取RNA，例如硫氰酸胍溶解继以氯化铯离心(Chirgwin等， Biochemistry 18：5294，1979)。可从单个细胞获取RNA，如从单个细胞制备 cDNA文库的方法所述(Dulac，Curr Top Dev Biol.36：245，1998)。RNA样 品可针对特定种类进一步富集。例如，在一实施方案中，可从RNA样品 中分离出poly(A)+RNA。特别是，poly-T寡核苷酸可作为mRNA的亲合 配体被固定于固体载体上。用于该目的的试剂盒已有市售，如 MessageMaker试剂盒(Life Technologies，Grand Island，N.Y.)。该富集 过程可通过引物特异性cDNA合成、或以cDNA合成为基础进行多轮线性 扩增以及模板指导的体外转录等方法(Wang等，Proc Natl Acad.Sci USA 86：9717，1989；Dulac等，同上)实现。
有多种扩增方法适用于本发明的方法，包括例如聚合酶链式反应 (PCR)、连接酶链式反应(LCR)(Wu和Wallace，Genomics 4：560，1989)、 自主序列复制(SSR)(Guatelli等，Proc Natl Acad Sci USA 87：1874，1990)、 基于核酸的序列扩增(NASBA)和转录扩增(Kwoh等，Proc Natl Acad Sci USA 86：1173，1989)。PCR技术专用方法为本领域内所熟知(例如参见PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification(H.A. Erlich编，Freeman Press，N.Y.，N.Y.，1992)；A Guide to Methods and Applications(Innis等编，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)。
可采用本领域技术人员了解的方法标记RNA以进行检测。例如，采 用由Affymetrix公司等生产的微列阵。采用任何常用方法进行杂交以标记 和检测RNA，例如用染料如Cyanine-3或Cyanine-5(Perkin Elmer MPS544001KT)直接标记RNA。其它方法包括通过核苷酸反转录使用 Cyanine-3或Cyanine-5(Badiee A 2003)、荧光素或Alexa染料(Molecular Probes)或其它荧光团对cDNA直接标记。再则，还可利用间接的cDNA标 记，如FairPlayTM/氨基烯丙基标记(Stratagene目录号：252002)、3DNA 树状聚体标记(Genisphere Inc)或酶信号扩增(MICROMAX TSA，Perkin Elmer)。另外，可使用通过酶、荧光、放射性或发光等方法检测的RNA 探针量化RNA。
在本发明的一个方面，RNA取自肿瘤样品，并运用Taqman技术检测 遗传标记物。生成引物以检测表I和表II中标明的特定RNA或其亚群， 并用反转录酶来扩增引物。对反转录扩增的特定片段的检测可通过以下方 式完成：凝胶电泳、多聚体电泳、直接DNA定序、光检测、荧光信号的 丧失、酶反应或经由对互补RNA的杂交进行检测。
在本发明的另一方面，利用实时PCR来检测寡核苷酸。将取自肿瘤样 品的mRNA反向翻译为cDNA。生成引物以通过聚合酶链式反应技术来扩 增表I和表II中标明的特定RNA或其亚群。可通过凝胶电泳和溴化乙啶 或CYBR绿染色，或通过测量聚合酶所释放的荧光团标记序列特异探针发 出的荧光强度来完成mRNA水平的检测。
在本发明的又一个方面，采用了Northern印迹法。RNA取自肿瘤样 品，然后凝胶电泳分离，并转移至一膜上。通过采用P32等放射性同位素 标记探针的杂交，或通过基于酶的显色法或发光法，来确定RNA丰度。
在本发明的另一方面，基因的量可作为转录水平的替代指示物。表I 和表II中的转录物或其亚群的基因的量可以定量地确定，从而评价肿瘤对 多西他赛疗法是否有反应(Rodriguez等，Clin Cancer Res 10：5785，2004)。 由于此评价在新辅助治疗(手术前的治疗)之前进行，所以，如果患者属于 有反应之列，则可用多西他赛治疗，如果属于无反应之列，则可施用另一 种化疗药剂。
从患者肿瘤活检材料中提取DNA，并以本领域技术人员所用方法对其 纯化以去除污染物。用来确定肿瘤DNA中的基因量的方法包括但不限于 定量PCR、基因组DNA芯片、原位杂交或Southern印迹法(Hafner等， Arch Pathol Lab Med 127：1221，2003；Rodriguez等，Clin Cancer Res 10：5785，2004)。因此，这些方法可用于确定表I和表II中一个基因或多个 基因的拷贝数，并将其与对照样品或参照标记物相比较。
在本发明的又一个方面，蛋白质水平可用作转录水平的替代测量标准。 已表明蛋白质水平与转录水平的抑制或提高相关。因而，本发明包括用来 测量与由表I和表II中转录物编码的多肽产物相关的蛋白质水平的技术。 蛋白质作为对多西他赛的预测反应的标记物加以检测和使用。蛋白质检测 方法为本领域所熟知。例如，免疫测定是运用抗体检测靶蛋白表达的方法。
在一特定实施方案中，免疫测定被用来检测表I和表II所列的一个或 多个基因的蛋白质产物。另外，抗表I和表II所列任何一种蛋白质的抗体 可用于许多其它检测方法中。这些检测方法包括但不限于下列各项： Western印迹法、ELISA测定和夹心ELISA。另外，亦考虑采用其它不使 用抗体的测定法，包括那些使用识别由表I和表II所列转录物所编码蛋白 质的DNA寡核苷酸或多肽(如适体)的方法。亦可采用生物样品的质谱分析 方法，通过确定蛋白水解分裂后肽片段的精确分子量，来确定多肽的组成 成分。
本发明进一步包含合适的标记，其中包括酶、荧光团，如异硫氰酸荧 光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、得克萨斯红(Texas red，TR)、罗丹明、游离 或螯合的镧系盐、发色团、放射性同位素、螯合剂、染料、胶体金、乳胶 颗粒、配体(如生物素)和化学发光剂。
在本发明的一个方面，所用放射性标记可为同位素，如3H、14C、32P、 35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、和186Re等。 可通过目前已知和可得到的计算程序定量放射活性水平。反之，亦可采用 不透射线的物质。在标记为酶的实施方案中，可采用目前利用的比色法、 分光光度法、荧光分光光度法、电流测量法或本领域熟知的气体定量分析 法等任何一种技术实现检测。
本发明的又一个方面是采用肽结合剂，例如抗体或抗体片段。抗体包 括按照常规方法制备的多克隆抗体和单克隆抗体。仅抗体分子的一小部分， 即抗原互补位，参与该抗体与其表位的结合(一般内容参见，Clark，W. R.(1986)，The Experimental Foundations of Modem Immunology，Wiley & Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)，Essential Immunology，第7版， Blackwell Scientific Publications，Oxford)。例如，pFc’和Fc区域为补体 级联的效应因子，但不参与抗原结合。其pFc’区域已被酶断裂，或生成 时缺失pFc’区域的抗体被称为F(ab’)2片段，它保留完整抗体的两个抗原 结合位点。因此，本发明的一个实施方案采用带有可检测标记的抗体片段， 如F(ab’)2。同样，其Fc区域已被酶断裂，或其生成时缺失Fc区域的抗 体被称为Fab片段，它保留完整抗体分子的抗原结合位点之一。Fab片段 由一个共价结合的抗体轻链和抗体重链的一部分(被称为Fd)组成。Fd片段 为抗体特异性的主要决定子(一个单一Fd片段可与多达10个不同的轻链相 结合而不改变抗体特异性)，单独存在的Fd片段保留了表位结合能力。
正如本领域所熟知的，在抗体的抗原结合部分内，有互补决定区 (CDR)，而互补决定区直接与抗原的表位和主链区域(FR)发生相互作用， 主链区域维持抗原互补位的三级结构(一般内容参见Clark，1986；Roitt， 1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，有4个主链区域(FR1 至FR4)，它们分别被3个互补决定区(CDR1至CDR3)分隔开。这些CDR， 特别是CD3区域，尤其是重链CDR3，在很大程度上决定着抗体特异性。 哺乳动物抗体的非CDR区域可为同种或异种抗体的相似区域所替代，同 时保留原抗体的表位特异性，这已为本领域所公认。这在“人源化”抗体 的研发和利用中得到极为清楚的证明，在该“人源化”抗体中非人类CDR 与人类的FR和/或Fc/pFc’区域共价连接产生功能抗体(参见第4,816,567、 5,225,539、5,585,089、5,693,762和5,859,205号美国专利)。
完全人类单克隆抗体亦可通过对转基因小鼠进行免疫处理来制备，这 些转基因小鼠在很大部分基因座上具有人类免疫球蛋白重链和轻链。对这 些小鼠(如XenoMouse(Abgenix)，HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))进行 免疫处理后，可按照标准的杂种瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体 将具备人类免疫球蛋白氨基酸序列，因而，应用于人类时不会引起人类抗 小鼠抗体(HAMA)反应。
因此，对本领域普通技术人员显而易见的是，本发明亦包括F(ab’)2、 Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗体(其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2 和/或轻链CDR3区域已被同源的人类或非人类序列所替代)；嵌合F(ab’)2 片段抗体(其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源 的人类或非人类序列所替代)；嵌合Fab片段抗体(其中FR和/或CDR1和 /或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源的人类或非人类序列所替代)以及 嵌合Fd片段抗体(其中FR和/或CDR1和/或CDR2区域已被同源的人类 或非人类序列所替代)。本发明亦包括所谓单链抗体。
通过参考下列非限制性实施例可更好地理解本发明，这些实施例作为 本发明的范例提供。列出以下实施例是为了更充分地说明本发明的优选实 施方案，而决不应以任何方式将其解释为限定本发明的广泛范围。
实施例
实施例1：siRNA筛选
为了鉴别能增加细胞对多西他赛的抗药性或敏感性的基因，在 HCT116细胞内针对101种基因进行了siRNA筛选，同时使用一系列多 西他赛浓度以产生剂量效应曲线。人的结肠癌细胞系HCT116从ATCC获 得，并在37℃与95％CO2和5％O2的条件下在补加100单位/ml青霉 素、100μg/ml链霉素、4mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的McCoy 5A 中培养。siRNA列表包含癌相关基因，其中包括在对多西他赛具有抗药性 的乳房肿瘤中过表达的那些基因，正如基因表达图谱实验所显示(Chang 等，Lancet 362：362，2003)。其它的准则是，该目标可经得起药物开发的验 证。总的方案概括如下。第一天，将HCT116细胞按每孔5,000个细胞接 种在96孔培养板上，第二天按每基因用3-4种siRNA转染。所用siRNA的 代表性样品如表I和表II所示。用脂质体试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)在96孔培养板上将siRNA(Dharmacon)转染至HCT 116 细胞内。第三天，将siRNA除去并加入浓度范围为0到40nM的多西他 赛。第六天，使用WST-1测定法定量测定细胞存活率。这是一种监测存 活细胞内线粒体脱氢酶活性的测定法，该活性导致了四唑盐WST-1的裂解 而形成甲臜(formazan)。在测定当天，将培养基从96孔培养板上除去。将 WST-1试剂(Roche)在McCoy 5A培养基中稀释10倍并于每孔内加入 100ul。然后将培养板于37℃培养40-80分钟，再在SpectroMax(Molecular Devices)上于450nm读数。通过计算实验siRNA与对照siRNA数值的比 率，将WST-1值按等级分组，结果共15个基因被鉴定为可增加敏感性， 9个基因可增加抗药性，如下文的表III所示。增加敏感性和抗药性的基 因可进一步划分为以下两种类型：1)在多西他赛浓度较低时(1-6nM)观察到 siRNA改变IC50的效应，或2)在较高浓度时(＞6nM)观察到显著的效应和 较小的IC50变化。
与Mad2、BubR1和Mps1的siRNA相比，靶向Grb2、CDK6、 Sepharase，以及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ(CamKIID)的siRNA在 较低的多西他赛浓度范围(1-6nM)内显示了更显著的效应和典型的IC50 变化。总之，这一亚组显示了比有丝分裂检查点基因较弱的抗药性，而且 CamKIID siRNA形成了最高水平的保护，比对照细胞高出两倍。这些数 据显示，四个有丝分裂检查点基因以及其它几个基因的丧失可在不同程度 上增加对多西他赛的抗药性。图1的数据显示了对于用siRNA转染随后又 接触各种浓度多西他赛的细胞的几条典型的剂量效应曲线。针对四种有丝 分裂检查点基因，包括BubR1、Bub1、Mad2和Mps1(Bub1的数据未显 示)以及Rac/Cdc42的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFT)的siRNA，显示了对 多西他赛的显著抗药性，在较高的多西他赛浓度范围(＞6nM)此效应更为显 著。对于Mad2显示了抗药性的最高水平，其细胞存活率比对照siRNA转 染的细胞增加五倍。在筛选中大多数siRNA没有得分，作为一个代表性实 例，我们在此处显示了人的成视网膜细胞瘤1(RB1)。
综上所述，这些结果显示，siRNA筛选可帮助人们了解基因表达的下 调是如何敏化细胞或在用多西他赛处理时如何保护细胞，以及根据不同的 浓度而产生不同的作用机制以减缓多西他赛引起的细胞死亡。
表III：影响对多西他赛反应的基因
增加对多西他赛敏感性的siRNA：
实施例2：对可增强对多西他赛抗药性的siRNA亚类进行交叉验证
siRNA筛选法一个潜在的缺点在于这样一种观察，即siRNA可与具 有部分同一性的转录物退火或引发micro-RNA(miRNA)的翻译阻滞，使得 靶特异性作用和非特异性(偏离位点的)作用难以区分(Jackson等，Nat Biotechnol 21：635，2003)。为了使用带有第二种序列的独立方法证实抗药 性，用一种带有编码短发夹(sh)RNA的DNA寡核苷酸的反转录病毒载体 感染HCT116细胞，产生了BubR1和Mps1稳定敲低细胞系。该shRNA 含有一个不同于siRNA的序列，靶向于开放读框的一个独特的区域。反转 录病毒包装的细胞系GP2-293从Clontech得到。将细胞保存在补加了100 单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、4mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清 的DMEM内。经瞬时转染GP2-293细胞而产生病毒。在转染前24小时 在一10cm培养皿上总共接种了3.6x 106个细胞。在用含有10％FBS但 不含抗生素的DMEM转染前4小时，更换培养基。用6μg载体DNA、6μg 包膜质粒VSV-G(Clontech)以及72μl脂质体试剂Lipofectamine-2000转 染细胞。在14-16小时后更换培养基；24小时之后收获病毒上清液，通过 0.45μM过滤器过滤，并用于在8μg/ml polybrene存在的条件下感染 HCT116细胞，感染复数(M.O.I)为5.在感染后48小时在0.5μg/ml嘌呤 霉素中选择细胞达7天或直至背景细胞死亡。以BubR1和Mps1敲低细 胞系产生的剂量效应曲线再次显示抗药性增加，在较高的多西他赛浓度下 更为显著(图2)，与经siRNA瞬间转染所获的结果相似。为了检验shRNA 是否降低了mRNA水平，我们采用了实时PCR来检测内源性转录物，并 证实与载体对照稳定细胞系相比，BubR1和Mps1稳定敲低细胞系内 RNA水平降低(图3).
将细胞溶解并用RNAqueous-96(Ambion)提取RNA。用Primer ExpressTM软件(英国PE Applied Biosystems)设计TaqmanTM探针及正向 引物和反向引物。除了与所测试的特定基因具有同一性以外，对于探针和 引物序列的BLAST检索未显示与其它序列具有显著同一性。为了进行实 时PCR，为每孔制备了20μl TaqManTM主混合物：4.825μl无RNA酶的 水、12.5μl 2x Universal PCR主混合物和0.625μl 40x MultiscribeTM和 RNA酶抑制剂混合物(Applied Biosystems)、0.9μl正向和反向引物(100 μM)、0.25μl探针(100μM)。每孔加入了5μl样品RNA(约1ng/ml)。在 TaqManTM ABI Prism 7700Sequence DetectorTM(英国Perkin-Elmer)上分 析板。循环参数为于48℃，30分钟；95℃，10分钟；再于95℃，15秒 和60℃，1分钟，40个循环。从标准曲线外推得到测试基因mRNA值并 表示为剩余百分数。
实施例3：通过避免有丝分裂阻滞和产生非整倍性，Mad2、BubR1和Mps1 的下调可保护细胞避免多西他赛诱导的死亡
正如WST-1测定所确定的，在多西他赛存在的情况下，有丝分裂检 查点基因的丧失与意味着抗药性的细胞存活率上升相关(图1)。为了进一步 测试WST-1测量的有效性，进行了细胞学实验以观察细胞形态学和存活 率(图4)。使用共焦显微镜追踪细胞并使用钙荧光素-AM(一种通过细胞内 酯酶而转变成绿色荧光的活体染料)作为新陈代谢活性细胞指示剂。图4显 示加入多西他赛后16小时，Mad2、BubR1及Mps1(程度较小)siRNA转 染的细胞过早地退出了有丝分裂而进入一种明显的分裂间期状态，并呈现 一种扁平的细胞形态，而大多数对照siRNA转柒的细胞则处于有丝分裂阻 滞状态，并呈现一种圆形的细胞形态。以前对于其它微管抑制剂已经描述 过扁平的细胞表型，并述及细胞从有丝分裂阻滞状态退出、实际上并没有 完成有丝分裂而进入一种明显的分裂间期状态的能力(Kung等，Proc Natl Acad Sci 87：9553，1990；Lanni和Jacks，Mol Cell Biol 18：1055，1998)。在处 理后72小时，关于Mad2、BubR1或Mps1 siRNA下调细胞最引人注目的 观察结果是增加了许多细胞以及非常大的细胞，而对照siRNA转染的细胞 与之相比，由于多西他赛处理的结果它们已被实质上消灭。在多西他赛不 存在的情况下，在两个不同的时刻，有丝分裂检查点下调的细胞看起来与 对照物细胞相似，处理后72小时细胞数量的增加，表明在siRNA存在的 情况下细胞在活跃地增长。
在微管抑制剂如秋水酰胺(colcemid)、洛可达唑(nocodazole)和泰素处 理之后，有丝分裂检查点受损的细胞能够绕过有丝分裂阻滞并过早地退出 有丝分裂(Taylor和McKeon，Cell 89：727，1997；Shin等，Cancer Cell 4：483， 2003；Masuda等，Am J Pathol 163：1109，2003；Sudo等，Cancer Res 64：2502，2004)。为了确定经多西他赛处理的HCT116细胞经三种特定的检 查点基因Mad2、BubR1或Mps1抑制之后是否过早地退出有丝分裂，我 们测量了所转染细胞的有丝分裂指数。将siRNA转染的Mad2、BubR1或 Mps1细胞未经处理(0)或在经多西他赛处理后8、16、24、36、48和72 小时收获，然后加以固定并与多克隆抗体一起孵育，该多克隆抗体检测组 蛋白H3的磷酸化作为有丝分裂的迹象(有丝分裂指数试剂盒，Cellomics)。 图5以曲线显示了所有时刻的情况。有丝分裂指数在处理后16小时和24 小时之间达到高峰，表明在所有情况下均发生了有丝分裂阻滞。对于用对 照siRNA转染的细胞，有丝分裂指数达到了最高值，但用Mad2和BubR1 siRNA转染的细胞则显示了有丝分裂指数的显著下降。Mps1 siRNA的效 应不象Mad2和BubR1那样显著。这些结果清楚地显示，有丝分裂检查 点受损的细胞能绕过多西他赛诱导的有丝分裂阻滞状态，而且BubR1 siRNA是最有效的，其次是Mad2和Mps1。
为了排除有丝分裂指数的变化与敲低效率的重大差异是巧合的可能 性，我们采用实时PCR来测量有丝分裂检查点转录水平。图6所示的实验 显示，mRNA的水平降低到了与Mad2、BubR1和Mps1 siRNA转染的细 胞相当的水平，提示有丝分裂指数的差异更能反映基因的功能。
从显微镜观察获得的数据看来，非常大的细胞也许含有异常的DNA 含量。为了进一步调查这些有丝分裂检查点受损的细胞是否能够克服多西 他赛诱导的细胞周期阻滞，重新进入S阶段而产生非整倍细胞，我们进行 了FACS分析以测量DNA含量。分别在多西他赛存在或不存在的条件下 培养Mps1、BubR1、Mad2和对照siRNA转染的细胞，固定并用碘化丙 啶染色，再进行FACS分析。在加入多西他赛后的几个不同时刻收集数据 (数据未显示)，图7显示了处理后72小时的分布图。用Mps1、BubR1、 Mad2和siRNA的转染在多西他赛加入后72小时导致了细胞的积聚，其 DNA含量分别为8N、16N以及32N(BubR1的情况)。在仅使用对照siRNA 的情况下，当多西他赛存在时，检测出了(DNA含量为)8N的克隆，但对于 有丝分裂检查点下调的细胞，此8N克隆的数量要大得多。在加入多西他 赛后一个较早的时刻(数据未显示)，大多数对照细胞被阻滞在4N，而用 Mps1、BubR1和Mad2 siRNA转染的细胞则从4N前进到8N。这些结果 表明，有丝分裂检查点基因的敲低使得细胞能更迅速地积累至异常的DNA 水平，而且与野生型细胞比较，越过了更高的倍数性阈值。我们的结果显 示了Mad2、BubR1和Mps1在用以前未表征的微管抑制剂多西他赛调节 有丝分裂指数和细胞周期性进化过程中的作用。
实施例4：在BubR1下调细胞内多西他赛抗药性克隆的形成
假定与抗微管剂结合的BubR1表达不足与非整倍性相关，而且BubR1 的恢复与激活检查点和非整倍细胞的凋亡相关，那么BubR1的凋亡作用 对于染色体保真性的调节似乎是很重要的(Shin等，Cancer Cell 4：483， 2003)。为了确定有丝分裂检查点基因的永久性下调是否能使细胞以更大的 增殖能力增长，测试了BubR1和Mps1稳定敲低细胞系(图4)在多西他赛 持续存在的条件下增殖和建立克隆的能力。由于Mad2的损伤对于细胞是 致命的，故Mad2稳定敲低细胞系无法产生(Michel等，Proc Natl Acad Sci 101：4459，2004)。用5nM多西他赛处理BubR1、Mps1和对照shRNA稳 定敲低细胞系达10天之后，用结晶紫染色。图8显示，与对照细胞系相 比，BubR1敲低细胞系产生了多得多的大克隆。在5nM多西他赛存在时， Mps1敲低细胞系不能产生克隆。当将这些培养板培养17天后，在对照培 养板上可观察到克隆，但其数量与BubR1敲低细胞系相比仍然较少。这 些结果将BubR1(但不是Mps1)的低水平与化疗药物多西他赛存在时细胞 的快速生长相关联。
实施例5：对于能增加对多西他赛敏感性的siRNA的交叉验证
除了鉴别能保护细胞免遭多西他赛诱导的杀伤的siRNA之外，此筛选 过程也鉴别了能使细胞对杀伤作用更敏感的siRNA。在表III中，Pim-1、 p21waf1/Cip1、GBP-1、RXRA、Hec1、SPF45、Raf1代表了一组在较高多西 他赛浓度下(＞6nM)显示具有显著杀伤作用而IC50只有很小变化的siRNA。 致癌的丝氨酸/苏氨酸激酶Pim-1和细胞周期抑制剂p21waf1/Cip1的siRNA 剂量效应曲线是非常相似的(图9)，这可能反映了信号通路内的叠加或协作 作用；而且先前的报导显示，p21waf1/Cip1是Pim-1的底物(Wang等，Biochim Biophys Acta 1593：45，2002)。更令人感兴趣的是Pim-1在前列腺上皮细胞 内过表达，这种过表达导致了有丝分裂检查点的干扰和基因的不稳定性 (Roh等，Cancer Res 63：8079，2003)。这些结果与Mad2、BubR1和Mps1 的表达不足是一致的，显示了一种具有相反表达水平的可比表型(参见图 1)。可增加对多西他赛敏感性的另一种siRNA是Hec1。
在表III中，TACC3、RELB、Aurora-A、PRKCD(PKC)、HSPA1A 以及BRAF35代表了一组在较低多西他赛浓度(1-6nM)下增加敏感性且 IC50发生特有变化的siRNA。Aurora-A是在有丝分裂发生时起作用并涉 及中心体成熟和纺锤体装配的丝氨酸/苏氨酸激酶(在Meraldi等，Curr Opin Genet Dev 14：29，2004中综述)。很令人感兴趣的是某些公开的数据显 示，Aurora-A在HeLa细胞内的过表达保护了细胞免遭泰素的杀伤，这与 我们的Aurora-A表达不足增强了多西他赛杀伤作用的结果是一致的 (Anand等，Cancer Cell 3：51，2003)。诚然，这是Aurora-A的IC50小幅 度的下降，代表了存活率下降25％；但是，通过用反转录病毒递送shRNA 造成HCT116细胞内Aurora-A的稳定敲低(将图9与图10和图11比较)， 该结果得以完全重现。
实施例6：Pim1在多西他赛不存在时可抑制HCT116细胞的增殖
为了进一步评估筛选出来的阳性结果，重要的是要将在多西他赛不存 在时影响细胞存活率的siRNA和那些与多西他赛共同起作用而增强杀伤能 力的siRNA加以区别。为了区别各种可能性，我们研究了siRNA转染对 增殖的影响，使用台盼蓝排除分析法和细胞计数来确定转染后24、48、72 小时6孔培养板上存活细胞的数量。我们的结果显示，Pim-1 siRNA可抑 制HCT116细胞的增殖，而TACC3 siRNA对增殖则没有影响(图12；图 13显示了定量敲低)，尽管两种siRNA均能提高多西他赛诱导的细胞死亡 (图9)。
实施例7：使用Live/Dead分析对抗药性基因和敏感性基因进行验证
为了直观地比较能对多西他赛产生敏感性和抗药性的siRNA，使用了 显微成像来确定活细胞与死细胞的比率，用钙荧光素-AM将活细胞染成绿 色，用碘化丙啶(PI)将死细胞核染成红色。在加入多西他赛之后(72小时)， BubR1 siRNA转染的细胞含有的存活细胞最多，而Pim-1和TACC3 siRNA转染的含有的死细胞最多，对照细胞则介于两者之间(数据未显示)。 虽然单独的BubR1 siRNA显示通过72小时细胞死亡增加，但最终该细胞 变得对多西他赛具有抗药性。单独的Pim-1 siRNA通过24小时造成了细 胞死亡，而TACC3 siRNA则未造成死亡。这些结果显示，BubR1的下调 与上升的细胞存活率和抗药性相关，而Pim-1和TACC3的下调则与上升 的细胞死亡率和药物敏感性相关。Pim-1和TACC3均显示在多西他赛存 在时其杀伤作用增强，但这一分析不能区别叠加作用和协作杀伤作用之间 的差异。
实施例8：多西他赛诱导的胱天蛋白酶-3活性因BubR1的下调而降低但因 Pim-1的下调而增强
多西他赛能诱导凋亡而造成细胞的死亡(Kim等，Int J Mol Med 11：799，2003)。为了确定Pim-1和BubR1 siRNA在多西他赛存在和不存在 的情况下是否能调节标准凋亡途径，我们(使用bioplex分析)研究了 HCT116细胞内的活化胱天蛋白酶-3水平(图14)。在用40nM多西他赛处 理48小时后，在对照细胞内诱导了胱天蛋白酶-3活性，这种诱导因Pim-1 的下调而进一步增强，但因BubR1的下调而降低(中图和下图)。在多西他 赛不存在的情况下，Pim-1的下调导致了处理后24小时胱天蛋白酶-3活 性略有增加，但在处理后48小时和72小时则回到了对照水平(上图)，这 表明其它的凋亡机制已被激活以维持通过WST-1和LIVE/DEAD分析法 于处理后72小时所观察到的增强杀伤作用。在多西他赛不存在的情况下， BubR1的下调导致了胱天蛋白酶-3活性很轻微的增加，这与以下观察结果 是一致的：在LIVE/DEAD分析中，BubR1的敲低在处理后72小时最初 造成了细胞的死亡。这些结果进一步提示，Pim-1和BubR1通过胱天蛋白 酶-3活性的调节作为多西他赛杀伤作用的效应子。
实施例9：涉及多西他赛诱导的Pim 1相关敏感性和BubR1相关抗药性的 信号通路
Pim-1引起的活性有力地表明，Pim-1在阻止导致细胞死亡的信号事 件而促进有利于细胞存活的信号事件过程中起着关键的作用。为了定义与 Pim-1敲低相关的细胞死亡增加的分子基础，我们研究了涉及细胞存活的 关键细胞通路AKT的活化状态。将HCT116按每孔4×105细胞接种在6 孔培养板上，并于次日使用脂质体试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)以 16nM siRNA转染。24小时之后，以5nM和40nM多西他赛处理细胞或 不加处理。在加入多西他赛后24、48和72小时，用冰冷的裂解缓冲液(50 mM HEPES缓冲液(PH7.4)、1％NP40、2.5mM EDTA、100mM氟化钠、 10mM钠PPI、蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche)、2mM原钒酸钠)来溶解细 胞，并以12,000g离心10分钟。然后采用DC蛋白分析法(BioRad)定量 分析裂解产物的总蛋白水平。使用活性胱天蛋白酶-3beadmates试剂盒 (Upstate)和Luminex 100TM系统并按照制造商推荐的方法确定活性胱天蛋 白酶-3水平。使用总AKT抗体bead试剂盒和磷特异性AKT S473抗体bead 试剂盒(Biosource)以及Luminex 100TM系统并按照制造商推荐的方法确定 总AKT和磷酸化AKT的水平。
图15所示的实验结果表明，与对照样品相比，Pim-1的下调减少了 AKT的基线磷酸化，而且随着多西他赛浓度的增加这种影响显著地加强。 通过比较，BubR1的下调增加了AKT的基线磷酸化而且这种影响在多西 他赛浓度较低而不是较高时得到加强，表明在较高剂量时也许有其它的信 号通路被激活。
申请人进行了Western印迹分析，使用抗Pim-1和BubR1的抗体于 第48小时测量蛋白水平。将等量蛋白加载NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶 (Invitrogen)。按照制造商的推荐，使用了抗Pim-1(Santa Cruz biotechnology)、BubR1(BD bioscience)和α-微管蛋白(Sigma)的抗体。将第 二抗体与HRP(BioRad)缀合并通过ECL Western印迹检测系统 (Amhersham Biosciences)检测，然后再用Hyperfilm ECL(Amhersham Biosciences)曝光。图16所示的实验结果显示，与对照样品相比，Pim-1和 BubR1蛋白水平降低，显示了降低的蛋白水平对应于某种功能改变(图15)。 这些数据表明，Pim-1蛋白水平的下调能够阻止AKT的磷酸化和活化， 以迫使细胞趋向凋亡。Pim-1似乎能通过激活促存活通路而导致细胞的生 存。
本发明的范围不限于此处所述的特定实施方案。确实，除了此处所述 的那些实施方案，本发明的多种修改，通过前面的说明和附图，对于本领 域的专业人员将变得显而易见。这类修改均处于所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献在此整体引用作为参考。
Anand S，Penrhyn-Lowe S，Venkitaraman AR.(2003)AURORA-A amplification overrides the mitotic spindle assembly checkpoint，inducing resistance to Taxol.Caancer Cell.3：51-62.
Aza-Blanc P，Cooper CL，Wagner K，Batalov S，Deveranx QL，Cooke MP.(2003)Identification of modulators of TRAIL-induced apoptosis via RNAi-based phenotypic screening.Mol Cell.12：627-37.
Chang JC，Wooten EC，Tsimelzon A，Hilsenbeck SG，Gutierrez MC， Elledge R，Mohsin S，Osborne CK，Chamness GC，Allred DC，O′Connell P. (2003)Gene expression profiling for the prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breast cancer.Lancet.362：362-9.
Hong，WK(2002)The current status of docetaxel in solid tumors. Oncology 16：9-15.
Jackson AL，Bartz SR，Schelter J，Kobayashi SV，Burchard J，Mao M， Li B，Cavet G，Linsley PS.(2003)Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nat Biotechnol.21：635-7.
Katsumata N.(2003)Docetaxel：an alternative taxane in ovarian cancer.Br J Cancer.89 Suppl 3：S9-S15.
Kim R，Tanabe K，Uchida Y，Emi M，Toge T.(2003)Effect of Bcl-2 antisense oligonucleotide on drug-sensitivity in association with apoptosis in undifferentiated thyroid carcinoma.Int J Mol Med.11：799-804. Kolfschoten GM，Hulscher TM，Duyndam MC，Pinedo HM，Boven E. (2002)Variation in the kinetics of caspase-3 activation，Bcl-2 phosphorylation and apoptotic morphology in unselected human ovarian cancer cell lines as a response to docetaxel.Biochem Pharmacol.63：733-43. Kung AL，Sherwood SW，Schimke RT.(1990)Cell line-specific differences in the control of cell cycle progfession in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A.87：9553-7.
Lanni JS，Jacks T.(1998)Characterization of the p53-dependent postmitotic checkpoint following spindle disruption.Mol Cell Biol. 18：1055-64.
Lee LF，Li G，Templeton DJ，Ting JP.(1998)Paclitaxel (Taxol)-induced gene expression and cell death are both mediated by the activation of c-Jun NH2-terminal kinase(JNK/SAPK).J Biol Chem. 273：28253-60.
Li Y，Dowbenko D，Lasky LA.(2002)AKT/PKB phosphorylation of p21Cip/WAF1 enhances protein stability of p21Cip/WAF1 and promotes cell survival.J Biol Chem.277：11352-61.
Lum L，Yao S，MozerB，Rovescalli A，Von Kessler D，Nirenberg M， Beachy PA.(2003)Identification of Hedgehog pathway components by RNAi in Drosophila cultured cells.Science.299：2039-45.
Masuda A，Maeno K，Nakagawa T，Saito H，Takahashi T.(2003) Association between mitotic spindle checkpoint impairment and susceptibility to the induction of apoptosis by anti-microtubule agents in human lung cancers.Am J Pathol.163：1109-16.
McManus MT，Sharp PA.(2002)Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.Nat Rev Genet.3：737-47.
Meraldi P，Honda R，Nigg EA.(2004)Aurora kinases link chromosome segregation and cell division to cancer susceptibility.Curr Opin Genet Dev.14：29-36.
Michel L，Diaz-Rodriguez E，Narayan G，Hernando E，Murty VV， Benezra R.(2004)Complete loss of the tumor suppressor MAD2 causes premature cyclin B degradation and mitotic failure in human somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A.101：4459-64.
Ojima，I.and Geney，R.109881 Aventis(2004)Curr Opin Investig Drugs 4：737-40.
Ringel I，Horwitz SB.(1991)Studies with RP 56976(taxotere)：a semisynthetic analogue of taxol.J Natl Cancer Inst.83：288-91.
Roh M，Gary B，Song C，Said-Al-Naief N，Tousson A，Kraft A，Eltoum IE，Abdulkadir SA.(2003)Overexpression of the oncogenic kinase Pim-1 leads to genomic instability.Cancer Res.63：8079-84.
Shin HJ，Baek KH，Jeon AH，Park MT，Lee SJ，Kang CM，Lee HS， Yoo SH，Chung DH，Sung YC，McKeon F，Lee CW.(2003)Dual roles of human BubR1，a mitotic checkpoint kinase，in the monitoring of chromosomal instability.Cancer Cell.4：483-97.
Simmer F，Moorman C，Van Der Linden AM，Kuijk E，Van Den Berghe PV，Kamath R，Fraser AG，Ahringer J，Plasterk RH.(2003) Genome-Wide RNAi of C.elegan s Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.PLoS Biol.1：E12.
Sudo T，Nitta M，SayaH，Ueno NT.(2004)Dependence of paclitaxel sensitivity on a functional spindle assembly checkpoint.Cancer Res. 64：2502-8.
Tanabe K，Kim R，Inoue H，Emi M，Uchida Y，Toge T.(2003) Antisense Bcl-2 and HER-2 oligonucleotide treatment of breast cancer cells enhances their sensitivity to anticancer drugs.Int J Oncol.22：875-81. Taylor SS，McKeon F.(1997)Kinetochore localization of murine Bub1 is required for normal mitotic timing and checkpoint response to spindle damage.Cell.89：727-35.
Wang TH，Wang HS，Soong YK(2000)Paclitaxel-induced cell death： where the cell cycle and apoptosis come together.Cancer.88：2619-28.
Wang Z，Bhattacharya N，Mixter PF，Wei W，Sedivy J，Magnuson NS. (2002)Phosphorylation of the cell cycle inhibitor p21Cip1/WAF1by Pim-1 kinase.Biochim Biophys Acta.1593：45-55.
Zhou J，Yao J，Joshi HC.(2002)Attachment and tension in the spindle assembly checkpoint.J Cell Sci.115：3547-55.