测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102747140 A (43)申请公布日 2012.10.24 CN 102747140 A *CN102747140A* (21)申请号 201210071783.3 (22)申请日 2005.12.01 60/634,298 2004.12.08 US 200580041847.3 2005.12.01 C12Q 1/68(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/573(2006.01) (71)申请人 安万特药物公司 地址 美国新泽西州 (72)发明人 D格吕内贝格 黄西 S纳特森 P奥古斯特 (74)专利代理机构 中国专利代

2、理(香港)有限公 司 72001 代理人 孔青 李炳爱 (54) 发明名称 测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法 (57) 摘要 本发明涉及某些新颖、 有效的方法， 这些方法 通过测量特定遗传标记物较对照物的增加或减 少， 可预测或监测患者对紫杉醇类分子的反应。 本 发明还提供了某些试剂盒， 这些试剂盒通过测量 特定遗传标记物的核酸或蛋白质水平并与对照物 或参照标志比较， 可预测或监测患者对紫杉醇类 分子的反应。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 25 页 序列表 70 页 附图 13 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12

3、)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 25 页 序列表 70 页 附图 13 页 1/2 页 2 1. 一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的试剂盒， 其中该试剂盒包括用于 测量如下遗传标记物的试剂 ： Mad2 ： 人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登录号 ： AJ000186)。 2.权利要求1的试剂盒， 其中所述用于测量遗传标记物Mad2的试剂选自带有可检侧标 记的抗体、 带有可检侧标记的抗体片段或带有可检测标记的寡核苷酸， 其中该寡核苷酸能 在严格条件下与所述遗传标记物杂交， 所述抗体片段选自 F(ab )2、 Fab、 Fv 和 Fd 片段。 3. 权利要求

4、 2 的试剂盒， 其中所述可检测标记选自酶、 放射性同位素、 或发荧光的化合 物、 化学发光分子、 不透射线的物质、 脂质体以及半抗原分子。 4. 一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的试剂盒， 其中该试剂盒包含测量 选自如下的一种或一种以上遗传标记物的试剂 ： BubR1 ： 人的类似于蛋白激酶 (BUBR1)mRNA， 完全 cds(GenBank 登录号 ： AF046079) ； Mad2 ： 人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登录号 ： AJ000186) ； Mps 1 ： 人 TTK 蛋白激酶 (TTK)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_0033

5、18) ； Rac1/CDC42 的 GEFT ： 人 RAC/CDC42 交换因子 (GEFT)， 转录变体 2， mRNA(GenBank 登录 号 ： NM_133483) ； Bub1 ： 人 BUB 1( 不受苯并咪唑 1 同系物抑制的芽殖 )( 酵母 )(BUB1)， mRNA(GenBank 登 录号 ： NM_004336) ； hSepharase ： 人额外纺锤体极样 1( 酿酒酵母 (S.cerevisiae)(ESPL1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_012291) ； CamKIId ： 人钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 (CaM 激酶 )II(CA

6、MK2D)， 转录变体 3， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_001221) ； CDK6 ： 人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 6(CDK6)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_001259) ； 和 GRB2 ： 人 生 长 因 子 受 体 结 合 蛋 白 2(GRB2)， 转 录 变 体 1， mRNA(GenBank 登 录 号 ： NM_002086) ； 条件是 ： 所述试剂盒包含测量遗传标记 Mad2 的试剂。 5. 权利要求 4 的试剂盒， 其中测量所述一种或一种以上遗传标记物的试剂选自带有可 检测标记的抗体、 带有可检测标记的抗体片段或带有可检测标记的寡核

7、苷酸， 其中该寡核 苷酸能在严格条件下与所述遗传标记物杂交， 所述抗体片段选自 F(ab )2、 Fab、 Fv 和 Fd 片 段。 6. 权利要求 5 的试剂盒， 其中所述可检测标记选自酶、 放射性同位素、 或发荧光的化合 物、 化学发光分子、 不透射线的物质、 脂质体以及半抗原分子。 7. 权利要求 1-6 任一项的试剂盒， 其中所述试剂盒还包含从身体样品获取总 RNA 的试 剂， 将总 RNA 反转录以获得 cDNA 的试剂， 和对该 cDNA 进行聚合酶链式反应的试剂。 8. 权利要求 7 的试剂盒， 其中对所述 cDNA 进行聚合酶链式反应的试剂包含一套引物， 其中这套引物中的一个或

8、两个具有可检侧标记， 且两个引物均衍生自遗传标记 Mad2 的核 苷酸序列。 9. 权利要求 8 的试剂盒， 其中所述可检测标记选自酶、 放射性同位素、 或发荧光的化合 物、 化学发光分子、 不透射线的物质、 脂质体以及半抗原分子。 权 利 要 求 书 CN 102747140 A 2 2/2 页 3 10. 权利要求 1-6 任一项的试剂盒， 其中所述试剂盒还包含测量选自以下一种或更多 种参照遗传标记物的水平的试剂 ： GAPDH ： 人 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPD)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002046) ； 和 RPS9 ： 人 cDNA 克隆 IMAGE

9、： 6647283， 部分 cds(GenBank 登录号 ： BC071941)。 11. 权利要求 1-6 任一项的试剂盒， 其中所述紫衫醇类分子选自泰素、 多西他赛、 XRP9881 和 XRP6258。 权 利 要 求 书 CN 102747140 A 3 1/25 页 4 测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法 0001 本 申 请 为 分 案 申 请， 原 申 请 的 申 请 日 为 2005 年 12 月 1 日， 申 请 号 为 200580041847.3(PCT/US2005/043578)， 发明名称为 “测量对多西他赛抗药性或敏感性的方 法” 。 发明领域 0002 本发明

10、涉及某些新颖、 有效且在此之前是未知的方法， 这些方法通过测量特定遗 传标记物较对照物的增加或减少， 可预测或监测患者对于紫杉醇类 (taxoid) 化合物分子 的反应。本发明还提供了某些试剂盒， 这些试剂盒通过测量特定遗传标记物的核酸或蛋白 质水平并与对照物或参照标记物比较， 可预测或监测患者对于紫杉醇类分子的反应。 0003 发明背景 0004 多西他赛 (Docetaxel) 是一种抗有丝分裂药物， 广泛地用于乳癌、 肺癌和卵巢癌 的治疗， 其次， 还用于头颈部、 胃部和前列腺的癌症治疗 (Hong， Oncology 16 ： 9， 2002)。多 西他赛通过与 - 微管蛋白结合以及阻

11、止 - 和 - 微管蛋白异二聚体的分解来抑制微 管动力学过程， 从而终止肿瘤的生长 (Ringel 和 Horwitz， J Natl Cancer Inst 83 ： 288， 1991)。多西他赛和一种相关紫杉烷 (taxane) 即泰素 (paclitaxel) 的抗肿瘤活性， 起因 于靶向有丝分裂纺锤体的微管， 阻止染色体的排列和分离， 阻止细胞周期进程并激活凋亡 途径 (Wang 等， Cancer 88 ： 2619， 2000)。通过涉及 p53/p21waf1/Cip1、 raf/ras 和有丝分 裂原激活的蛋白激酶 (MAPK) 的细胞信号事件， 泰素的促凋亡活性与 Bcl-

12、2 的磷酸化和失 活被联系起来 (Wang 等， Cancer 88 ： 2619， 2000)。虽然多西他赛是一种比泰素更有效的 抗癌剂， 但涉及其细胞毒性的途径却尚未很好地确定 (Katsumata， Br J Cancer 89 ： S9， 2003)。在所选择的细胞系中观察到了多西他赛通过一种涉及 Bcl-2 磷酸化和胱天蛋白 酶 -3(caspase-3) 活化的机制所诱导的凋亡 (Kolfschoten 等， Biochem Pharmacol 63 ： 733， 2002)。在各种培养的细胞系内调节紫杉烷诱导的细胞杀伤作用的其它蛋白包括 HeLa 细胞内的Aurora-A(Ana

13、nd等， Cancer Cell3 ： 51， 2003)、 乳腺癌细胞内的HER-2(Tanabe等， Int J Oncol 22 ： 875， 2003)、 胶质母细胞瘤细胞内的 p21waf1/Cip1(Li 等， J Biol Chem 277 ： 11352， 2002)以及卵巢癌细胞内的JNK/MKK1(Lee等， J Biol Chem 273 ： 28253， 1998)。 0005 在本领域内存在着一种需要， 即需要鉴别某些可诱导多西他赛抗药性的药用蛋 白， 这种抗药性使这些蛋白在药物开发过程中可用于鉴别那些可消除其活体内功能并能提 高细胞对于抗肿瘤药物化疗敏感性的药剂 (

14、 小分子、 siRNA 等 )。在本领域内还需要一种测 定方法， 用于在化疗前可靠地预测哪些患者在接受基于多西他赛抗肿瘤药物的化疗之后会 有起色， 而哪些患者则不会。 申请人在本文中描述了一种新颖的测定方法， 该测定方法能预 测对于多西他赛的抗药性和 / 或敏感性， 并为能消除癌症抗药性的新疗法的发展提供了某 些筛选方法。 0006 发明概述 0007 依照本发明提供了某些新颖和有效的方法， 通过比较患者和对照物体内特定遗传 标记物的活化和 / 或表达的水平， 监测和 / 或预测患者对紫杉醇类分子的反应。 说 明 书 CN 102747140 A 4 2/25 页 5 0008 在一实施方案中

15、， 本发明提供了一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应 的方法， 其包括以下步骤 ： 0009 a) 从所述患者的癌症区域获得测试样品 ； 0010 b) 获得对照样品 ； 0011 c) 测量一种或一种以上遗传标记物的水平 ； 以及 0012 d) 在测试样品和对照样品之间比较所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的 水平 ； 0013 其中， 与对照样品相比， 在测试样品内所测量的所述一种或一种以上遗传标记物 水平的下降表明对紫杉醇类分子抗药性的增强。 0014 在本发明该方面所提供的特定遗传标记物包括 ： 0015 BubR1 ： 人 (Homo spiens) 的类似于蛋白激酶 (B

16、UBR1)mRNA， 完全 cds( 互补 DNA) (GenBank 登录号 ： AF046079) ； 0016 Mad2 ： 人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登录号 ： AJ000186) ； 0017 Mps1 ： 人 TTK 蛋白激酶 (TTK)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_003318) ； 0018 Rac1/CDC42 的 GEFT ： 人 RAC/CDC42 交换因子 (GEFT)， 转录变体 2， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_133483) ； 0019 Bub1 ： 人BUB1(不受苯并咪唑1同系物抑制的芽殖)(酵母)(B

17、UB1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_004336) ； 0020 hSepharase ： 人 额 外 纺 锤 体 极 样 1( 酿 酒 酵 母 (S.cerevisiae)(ESPL1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_012291) ； 0021 CamKIId ： 人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)II(CAMK2D)， 转录变体3， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_001221) ； 0022 CDK6 ： 人 细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 蛋 白 激 酶 6(CDK6)， mRNA(GenBank 登 录 号 ： NM_00

18、1259) ； 和 0023 GRB2 ： 人生长因子受体结合蛋白 2(GRB2)， 转录变体 1， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002086)。 0024 在另一实施方案中， 本发明涉及一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应 的方法， 其包括以下步骤 ： 0025 a) 从所述患者的癌症区域获得测试样品 ； 0026 b) 获得对照样品 ； 0027 c) 测量一种或一种以上遗传标记物的水平 ； 以及 0028 d) 在测试样品和对照样品之间比较所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的 水平 ； 0029 其中， 与对照样品相比， 在测试样品内所测量的所述一种或一种以上遗传

19、标记物 水平的下降表明对紫杉醇类分子敏感性的增强。 0030 在本发明的这一具体方面， 一种或一种以上遗传标记物可选自 ： 0031 P21(Waf1) ： 人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂 1A(p21， Cip1)(CDKN1A)， 转 录变体 1， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_000389) ； 0032 Pim-1 ： 人 pim-1 癌基因 (PIM1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002648) ； 说 明 书 CN 102747140 A 5 3/25 页 6 0033 GBP-1 ： 人鸟苷酸结合蛋白 1， 干扰素可诱导， 67kDa(GBP

20、1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002053) ； 0034 RXRA ： 人类类视黄醇 X 受体， (RXRA)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002957) ； 0035 SPF45 ： 人 RNA 结合基序蛋白 17(RBM17)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_032905) ； 0036 Hec1 ： 人动粒相关 2(KNTC2)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_006101) ； 0037 Raf1 ： 人 raf 癌基因的 mRNA(GenBank 登录号 ： X03484) ； 0038 Aurora A ： 人

21、aurora- 相 关 激 酶 1(ARK1)mRNA，完 全 cds(GenBank 登 录 号 ： AF008551) ； 0039 TACC3 ： 人 转 化、 含 酸 性 卷 曲 螺 旋 的 蛋 白 3(TACC3)， mRNA(GenBank 登 录 号 ： NM_006342) ； 0040 RelB ： 人 v-rel 网状内皮组织增生病毒癌基因同系物 B， B- 细胞 3( 鸟类 ) 的 轻 多肽基因增强子的核因子 (RELB)， 0041 mRNA(GenBank 登录号 ： NM_006509) ； 0042 PRKCD ： 人 蛋 白 激 酶 C， (PRKCD)，转 录

22、 变 体 1， mRNA(GenBank 登 录 号 ： NM_006254) ； 0043 BRAF35 ： 人高泳动族 20B(HMG20B)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_006339) ； 0044 HSPA1L ： 人热休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_005345) ； 0045 STK11 ： 人丝氨酸 / 苏氨酸激酶 11( 波 - 杰综合征 )(STK11)， mRNA(GenBank 登录 号 ： NM_000455) ； 和 0046 MKK3 ： 人 MAP 激酶激酶 3(MKK3)mRNA， 完

23、全 cds(GenBank 登录号 ： L36719)。 0047 在一更进一步的实施方案中， 本发明涉及一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分 子的反应的方法， 其包括以下步骤 ： 0048 a) 从所述患者的癌症区域获得测试样品 ； 0049 b) 测量选自以下一种或一种以上遗传标记物的水平 ： 0050 BubR1 ： 人的类似于蛋白激酶 (BUBR1)mRNA， 完全 cds( 互补 DNA)(GenBank 登录号 ： AF046079) ； 0051 Mad2 ： 人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登录号 ： AJ000186) ； 0052 Mps1 ： 人 TTK 蛋

24、白激酶 (TTK)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_003318) ； 0053 Rac1/CDC42 的 GEFT ： 人 RAC/CDC42 交换因子 (GEFT)， 转录变体 2， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_133483) ； 0054 Bub1 ： 人BUB1(不受苯并咪唑1同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUB1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_004336) ； 0055 hSepharase ： 人 额 外 纺 锤 体 极 样 1( 酿 酒 酵 母 (S.cerevisiae)(ESPL1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM

25、_012291) ； 0056 CamKIId ： 人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)II(CAMK2D)， 转录变体3， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_001221) ； 0057 CDK6 ： 人 细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 蛋 白 激 酶 6(CDK6)， mRNA(GenBank 登 录 号 ： NM_001259) ； 和 0058 GRB2 ： 人生长因子受体结合蛋白 2(GRB2)， 转录变体 1， mRNA(GenBank 登录号 ： 说 明 书 CN 102747140 A 6 4/25 页 7 NM_002086)。 0059 c) 测量选自以

26、下一种或一种以上参照遗传标记物的水平 ： 0060 GAPDH ： 人 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPD)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002046) ； 和 0061 RPS9 ： 人 cDNA 克隆 IMAGE ： 6647283， 部分 cds(GenBank 登录号 ： BC071941) ； 0062 d) 比较测试样品中所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水平和所述一种 或一种以上参照遗传标记物的水平 ； 0063 其中， 与所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平相比， 在所述一种或一种以 上遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子抗药性的增强。 0064 本发

27、明的另一个进一步的实施方案涉及一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分 子的反应的方法， 其包括以下步骤 ： 0065 a) 从所述患者的癌症区域获得测试样品 ； 0066 b) 测量选自以下一种或一种以上遗传标记物的水平 ： 0067 P21(Waf1) ： 人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂 1A(p21， Cip1)(CDKN1A)， 转 录变体 1， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_000389) ； 0068 Pim-1 ： 人 pim-1 癌基因 (PIM1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002648) ； 0069 GBP-1 ： 人鸟苷酸结合蛋白 1，

28、干扰素可诱导， 67kDa(GBP1)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002053) ； 0070 RXRA ： 人类类视黄醇 X 受体， (RXRA)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002957) ； 0071 SPF45 ： 人 RNA 结合基序蛋白 17(RBM17)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_032905) ； 0072 Hec1 ： 人动粒相关 2(KNTC2)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_006101) ； 0073 Raf1 ： 人 raf 癌基因的 mRNA(GenBank 登录号 ： X03484) ； 0

29、074 Aurora A ： 人 aurora- 相 关 激 酶 1(ARK1)mRNA，完 全 cds(GenBank 登 录 号 ： AF008551) ； 0075 TACC3 ： 人 转 化、 含 酸 性 卷 曲 螺 旋 的 蛋 白 3(TACC3)， mRNA(GenBank 登 录 号 ： NM_006342) ； 0076 RelB ： 人 v-rel 网状内皮组织增生病毒癌基因同系物 B， B- 细胞 3( 鸟类 ) 的 轻 多肽基因增强子的核因子 (RELB)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_006509) ； 0077 PRKCD ： 人 蛋 白 激 酶 C，

30、 (PRKCD)，转 录 变 体 1， mRNA(GenBank 登 录 号 ： NM_006254) ； 0078 BRAF35 ： 人高泳动族 20B(HMG20B)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_006339) ； 0079 HSPA1L ： 人热休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_005345) ； 0080 STK11 ： 人丝氨酸 / 苏氨酸激酶 11( 波 - 杰综合征 )(STK11)， mRNA(GenBank 登录 号 ： NM_000455) ； 和 0081 MKK3 ： 人 MAP 激酶激酶 3(

31、MKK3)mRNA， 完全 cds(GenBank 登录号 ： L36719)。 0082 c) 测量选自以下一种或一种以上参照遗传标记物的水平 ： 0083 GAPDH ： 人 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPD)， mRNA(GenBank 登录号 ： NM_002046) ； 和 0084 RPS9 ： 人 cDNA 克隆 IMAGE ： 6647283， 部分 cds(GenBank 登录号 ： BC071941) ； 0085 d) 比较测试样品中所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水平和所述一种 或一种以上参照遗传标记物的水平 ； 说 明 书 CN 102747140 A 7 5

32、/25 页 8 0086 其中， 与所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平相比， 所述一种或一种以上 遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子易感性的增强。 0087 本发明涉及预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的各种方法。因此， 本发 明的一个进一步的实施方案包括紫杉醇类分子泰素、 多西他赛 XRP9881 和 XRP6258。 0088 通过采用下文中详述的各种技术来测量 RNA、 DNA 或蛋白质的水平， 可评估本发明 所述的各种遗传标记物。 本发明的另一些实施方案则涉及用于预测或监测患者对紫杉醇类 分子的反应的各种试剂盒。 0089 通过以下结合附图所作的详细说明， 对本发明的上述方

33、面和其它方面、 特点和优 点将能更好地理解。 0090 附图简述 0091 图 1 显示了某些基因的特性， 它们的下调可产生对多西他赛的抗药性。所显示的 多西他赛剂量效应曲线为用RB1、 BubR1、 Mad2和Mps1siRNA(实心正方形)与对照siRNA(空 心正方形 ) 转染的 HCT116 细胞相比的情况。RB1 是在筛选中没有得分的 siRNA 的一个实 例。在加入 WST-1 之后于 450nM 吸收度条件下测量细胞存活率。最小比率 (MR) 是多西他 赛剂量为 40nM 时基因的 WST-1 值与对照物 WST-1 值的比率。 0092 图 2 显示了将 BubR1 和 Mps

34、1shRNA( 实心正方形 ) 与对照 shRNA( 空心正方形 ) 比 较的剂量效应曲线。 0093 图 3 显示了在分别含有 BubR1 shRNA 和 Mps1 shRNA 的细胞内， 对 BubR1 shRNA 和 Mps1 mRNA 水平进行的 TaqMan 实时 PCR 分析。 0094 图 4 分别显示了在使用或不使用多西他赛处理的情况下， 用 Mad2、 BubR1 和 Mps1 siRNA转染的HCT116细胞的细胞存活率和形态学。 在转染后24小时， 对细胞不加处理(-多 西他塞)或以200nM多西他赛处理(+多西他赛)， 并在处理后16和72小时以钙荧光素-AM 染色以显

35、现活细胞。 0095 图 5 显示了用 Mad2、 BubR1、 Mps1 和对照 siRNA 转染的 HCT116 细胞继多西他赛处 理之后的有丝分裂指数。转染后 24 小时细胞以 200nM 多西他赛处理 16 小时和 72 小时并 加以进一步处理。以磷酸化的组蛋白 H3 抗体检测有丝分裂细胞， 此处显示为染色细胞核的 红色斑点 ( 有丝分裂指数试剂盒， Cellomics)。用 Hoechst 染料将细胞核染成蓝色。 0096 图 6 显示了在分别用 Mps1、 BubR1 和 Mad2 siRNA 转染的 HCT116 细胞内， 对 Mps1、 BubR1 和 Mad2 mRNA 水平

36、进行的 TaqMan 实时 PCR 分析。 0097 图 7 显示了用三种有丝分裂检查点基因 siRNA 转染的 HCT116 细胞的细胞周期分 析。在用 Mps1、 BubR1 和 Mad2 siRNA 转染之后， 未用多西他赛 (- 多西他赛 ) 处理细胞或以 200nM 多西他赛 (+ 多西他赛 ) 处理 24 小时。在加入多西他赛后 72 小时， 收获细胞并分析 细胞周期。峰顶的数字表示 DNA 含量， 例如 2N、 4N、 8N、 16N 或 32N。 0098 图 8 显示了使用稳定敲低细胞系进行的产克隆细胞存活分析。将含有 BubR1 或载 体对照 shRNA 的 HCT116

37、细胞接种在 10cm 培养皿中并在 5nM 多西他赛中保持 10 天。用 PBS 洗涤克隆并以结晶紫染色。 0099 图 9 显示了几种基因的剂量效应曲线， 这些基因的下调能增加对多西他赛的敏感 性。所显示的多西他赛剂量效应曲线为用 RB1、 Pim-1、 p21、 Aurora A 和 TACC3 siRNA( 实心 正方形 ) 与对照 siRNA( 空心正方形 ) 转染的 HCT116 细胞相比的情况。最小比率 (MR) 是 说 明 书 CN 102747140 A 8 6/25 页 9 多西他赛浓度为 40nM 时基因的 WST-1 读数与对照物 WST-1 读数的比率。IC50(IR)

38、 比率是 基因的 IC50 与对照物 IC50 的比率。 0100 图 10 显示了 Aurora A shRNA( 实心正方形 ) 与载体对照物 ( 空心正方形 ) 比较 的剂量效应曲线。 0101 图 11 显示了在含有 Aurora A shRNA 的细胞内， 对 Aurora A mRNA 水平的 TaqMan 实时 PCR 分析。 0102 图 12 显示了用 Pim-1 和 TACC3 siRNA( 实心正方形 ) 与对照 siRNA( 空心正方形 ) 转染的 HCT116 细胞比较在增殖方面的区别。也就是在用 Pim-1、 TACC3 和对照 siRNA 转染 后的不同时刻， 在

39、 6 孔培养板内剩下的细胞数量。 0103 图 13 显示了在 siRNA 转染后对 Pim-1 和 TACC3 mRNA 水平进行的 TaqMan 分析。 0104 图 14 显示了在用 Pim-1 和 BubR1siRNA 转染的 HCT116 细胞内活性胱天蛋白酶 -3 的水平。使用活性胱天蛋白酶 -3beadmates 试剂盒 (Upstate)， 活性胱天蛋白酶 -3 的水平 显示为荧光强度。检查了 3 种多西他赛的浓度 ( 即 0、 5 和 40nM) 以及 3 个时刻 ( 即加入多 西他赛后 24、 48 和 72 小时 ) 的情况。 0105 图 15 显示了用 Pim-1 和

40、 BubR1 siRNA 转染的 HCT116 细胞内 AKT 的磷酸化水平。 磷酸化 AKT 和总 AKT 水平的比率是用基于珠的测定法 (bead-based assay)(Biosource) 确 定的。转染后 24 小时， 对细胞不加处理或以 5nM 和 40nM 多西他赛处理。在多西他赛处理 后 48 小时， 分析细胞裂解物。计算磷酸化水平， 并以磷酸化 AKT(p-AKT) 与总 AKT(t-AKT) 的比率表示。 0106 图 16 以 Western 印迹法结果显示转染后 48 小时 Pim-1 和 BubR1 的水平下降。 0107 发明详述 0108 本发明以申请者对基因标

41、记物的鉴定为充分依据， 该基因标记物可预测受试者对 紫杉醇 (taxoid) 类药物是否具有抗性或敏感性。采用以细胞为基础的 RNA 干扰 (RNAi) 筛 选， 申请者观察到对多西他赛的抗药性或敏感性与特定基因标记物相关。 0109 本专利说明及专利权要求中使用了许多术语及短语。这些术语及短语的定义如 下 ： 0110 在本文中，“预后” 这个术语， 是指关于因癌症而引起的死亡或疾病进程的预测或 可能性， 其中包括抗药性以及复发、 转移扩散和赘生性疾病。 0111 在本文中，“预测” 这个术语， 是指患者对一种药物或一组药物反应良好或不良的 可能性以及这些反应的程度， 例如， 患者于手术摘除

42、原发性肿瘤后及 / 或化疗一段时间后 是否能存活而无癌症复发。本发明所预见的预测方法可在临床上使用， 通过为任何特定患 者选择最合适的治疗方法， 尤其是紫杉醇类药物的化疗方法， 而做出治疗决定。 本发明的各 种预测方法对预测患者对某种治疗法(包括采用一种给定药物或药物组合的化疗及/或放 射治疗 ) 是否反应良好， 或在停止化疗或其它形式的治疗后能否长期存活颇有价值。 0112 在本文中，“肿瘤” 这个术语是指所有良性及恶性的赘生细胞生长和增殖， 并指所 有的癌前和癌性细胞与组织。 0113 在本文中，“癌” 和 “癌性” 是指哺乳动物的某种生理病状， 其典型特征为无节制的 细胞生长。癌症的例子

43、包括但不限于以下各种癌症 ： 乳腺癌、 结肠癌、 肺癌、 前列腺癌、 肝细 胞癌、 胃癌、 胰腺癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 肝癌、 膀胱癌、 尿道癌、 癌、 黑素瘤、 脑癌 ( 包括成胶质 说 明 书 CN 102747140 A 9 7/25 页 10 细胞瘤和成神经管细胞瘤 )、 胆道癌、 绒膜癌、 食道癌、 胃癌、 血液肿瘤 ( 包括急性淋巴细胞 性和髓性白血病 )、 多发性骨髓瘤、 爱滋病相关白血病和成人 T- 细胞白血病淋巴瘤、 上皮内 肿瘤 ( 包括鲍恩病和佩吉特病 )、 淋巴瘤 ( 包括何杰金氏病和淋巴细胞性淋巴瘤 )、 成神经 细胞瘤、 口腔癌 ( 包括鳞状细胞癌 )、 肉瘤 (

44、 包括平滑肌肉瘤、 横纹肌肉瘤、 脂肪肉瘤、 纤维 肉瘤和骨肉瘤 )、 皮肤癌 ( 包括黑素瘤、 卡波西肉瘤、 基底细胞性癌和鳞状细胞癌 )、 睾丸癌 ( 包括胚组织瘤如精原细胞瘤、 非精原细胞瘤 ( 畸胎瘤、 绒膜癌 )、 间质瘤以及生殖细胞肿 瘤 )、 甲状腺癌 ( 包括甲状腺腺癌和髓样癌 )、 肾癌 ( 包括腺癌和维尔姆斯瘤 )。 0114 在本文中，“患者” 这个术语主要是指人， 但也可包括非人类灵长类动物、 牛、 马、 猪、 绵羊、 山羊、 狗、 猫和啮齿类动物。优选地， 受试者是人， 其疑似患有癌症， 或已确诊患有 癌症， 或属于患癌高危人群， 例如有家族癌症史。 在本发明的优选实

45、施方案中， 癌为乳腺癌。 鉴定疑似患有癌症的受试者的方法包括手检、 活组织检查、 受试者家族病史、 受试者病史或 若干成像技术， 包括乳房 X 线照相、 磁共振成像、 磁共振波谱或正电子发射断层扫描。癌症 的诊断方法和癌症诊断的临床特性为医疗领域技术人员所熟知。 0115 在本文中，“样品” 这个术语是指采用相关医疗领域内普通技术人员熟知的方法所 取得的组织。活组织检查等各种方法包括分割组织块、 显微解剖、 以激光为基础的显微解 剖或本领域内熟知的其它细胞分离方法。由于病变组织活检材料中细胞类型的可变性和 所用诊断方法灵敏度的可变性， 分析所需样品的细胞数量可从 1、 10、 50、 100、

46、 200、 300、 500、 1000、 5000、 10,000 至 50,000 或更多不等。合适的样品大小取决于细胞组成和活检状况， 确定细胞组成和活检状况时的标准制备步骤及其后在本发明中所采用的核酸分离方法为 本领域内普通技术人员所熟知。例如， 取自活检的样品可能足以评价 RNA 表达而无需扩增。 反之， 若小型活检区域中细胞数量未达合适的数量， 则需要采用RNA转换方法和/或扩增方 法， 或采用其它提高核酸分子分辨率的方法。所述的允许采用有限活检材料的方法为本领 域内普通技术人员所熟知。一些例子包括但不限于直接 RNA 扩增、 RNA 反转录为 cDNA、 cDNA 扩增或生成放射

47、性标记核酸分子。 0116 在本文中， 关于样品的术语 “测试” 是指取自身体癌变区域的样品， 或取自显示某 阶段癌变或癌变特征的身体区域的样品。 0117 在本文中， 关于样品的术语 “对照” 是指用于比较目的的样品。优选地， 这些样品 为 “对照” 意思是指该样品未显示或据信未患有任何影响基因表达的疾病或病症， 在以这些 样品作为标准的疾病方面尤其如此。也可以这样认为 ： 疾病和病症的不同阶段可以加以比 较， 在此情况下，“对照” 样品相当于该疾病或病症的较早阶段。例如， 对照样品可以是取自 身体上非癌变但可比较部位的样品。 此外， 对照样品可取自同一个受试者的可比较部位， 或 与该第一个

48、受试者实质上相似的第二个受试者 ( 物种、 年龄、 体重、 性别等相同或相似 ) 的 非癌变部位。最后， 对照样品亦可取自对紫杉醇类分子治疗产生良好反应的第二个受试者 的癌变部位。 0118 “核酸分子” 是指核苷 ( 腺嘌呤核苷、 鸟嘌呤核苷、 尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷 ；“RNA 分子” ) 或脱氧核苷 ( 腺嘌呤脱氧核苷、 鸟嘌呤脱氧核苷、 胸腺嘧啶脱氧核苷或胞嘧啶脱氧 核苷 ；“DNA 分子” ) 的磷酸酯聚合体形式或其磷酸酯类似物 ( 例如硫代磷酸酯和硫酯 )， 可 为单链形式或双链螺旋形式。也可能是双链 DNA-DNA、 DNA-RNA 和 RNA-RNA 螺旋。核酸分 子 ( 特别

49、是 DNA 或 RNA 分子 ) 这个术语仅指该分子的一级和二级结构， 并不限于任何特定 说 明 书 CN 102747140 A 10 8/25 页 11 的三级结构。因此该术语包括双链 DNA 分子， 其形式可为直链或环形 DNA 分子 ( 如限制片 段)、 质粒和染色体。 在讨论特定双链DNA分子的结构时， 可根据仅给出顺着5端至3端 的方向沿着非转录 DNA 链 ( 即含有与 mRNA 同源序列的链 ) 的序列的惯例来描述序列。 “重 组 DNA 分子” 是指已经过分子生物学操作的 DNA 分子。 0119 在本文中， 为特定蛋白质编码的、 分离的核酸分子的 “部分” 这个术语， 是指包含编 码肽或多肽的足够数量相邻核苷酸的分离核酸分子的部分或片段。自然， 分离核酸分子的 一个 “部分” 不止一个核苷酸， 而由这个部分编码的肽或多肽含有许多氨基酸残基， 如下文 肽和多肽的定义所述。 0120 在本文中，“肽” 这个术语， 是指由肽键共价连接的两个或两个以上氨基酸。在一特 定实施方案中， 一个肽包含至少 10 个氨基酸， 优选至少 20 个、 更优选至少 30 个、 甚至更优 选至少 40 个、 最优选 50 个或更多氨基酸。 0121 在本文中，“多肽” 这个术语， 是指由多个相邻氨基酸组成的直链聚合物， 特别是多 肽的分子量可高于 100k