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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810350993.3 (22)申请日 2018.04.18 (71)申请人 江西农业大学 地址 330045 江西省南昌市经济开发区志 敏大道1101号 (72)发明人 袁干军李菌芳王一旻宋晓媛 许雪杰 (74)专利代理机构 江西省专利事务所 36100 代理人 黄新平 (51)Int.Cl. C07J 63/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 熊果酸衍生物及其制备方法和在制备治疗 MRSA感染药物中的应用 (57)摘要 本发。
2、明公开了熊果酸衍生物及其制备方法 和在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)感染药物中的应用。 将熊果酸用沙瑞特试 剂氧化得熊果酸的3-羟基氧化产物， 然后选用钛 酸异丙酯和三乙酰氧基硼氢化钠， 对熊果酸的3- 羟基氧化产物进行还原胺化法， 制得本发明所述 的熊果酸衍生物。 抗MRSA活性试验证明： 所得熊 果酸衍生物对MRSA试验菌株的MIC为1632g/ mL， 较为熊果酸抗MRSA活性提高48倍， 且可与 等摩尔的盐酸成盐而显著改善其水溶性。 显示本 发明所述熊果酸衍生物具有显著的抗MRSA活性， 且开发前景良好， 可用于制备治疗MRSA感染的药 物。 权利要求书1页 说明书10。
3、页 CN 108822179 A 2018.11.16 CN 108822179 A 1.一种熊果酸衍生物， 其特征在于： 其分子结构式如式I所示： 其中， R1为甲基或氢： 当R1为甲基， R2为甲基时， 式 为3-二甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧 酸； 当R1为氢， R2为氢时， 式 为3-氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸； 当R1为氢， R2为甲基时， 式 为 3-甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸； 当R1为氢， R2为乙基时， 式 为3-乙氨基乌苏-12-烯-28 -羧 酸。 2.一种如权利要求1所述的熊果酸衍生物制备方法， 其特征在于： 取熊果酸溶于二氯甲 烷中， 搅拌下加入沙瑞。
4、特试剂， 1040下反应18h， 反应混合物用二氯甲烷萃取， 经硅胶 柱层析分离纯化， 得熊果酸的3-羟基氧化产物， 然后用无水乙醇溶解， 依次加入含氨或脂肪 胺的醇溶液、 钛酸异丙酯， 2550搅拌反应24h， 降至室温后再加入三乙酰氧基硼氢化 钠反应23h， 随后用乙酸乙酯萃取， 硅胶柱分离纯化， 得熊果酸衍生物。 3.一种如权利要求1所述的熊果酸衍生物在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)感染药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108822179 A 2 熊果酸衍生物及其制备方法和在制备治疗MRSA感染药物中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及熊果酸衍生物及其。
5、制备方法和在制备治疗MRSA感染药物中 的应用。 背景技术 0002 近年来， 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA)感染遍及全球各地， 感染率呈持续上升趋势， 并对多种结构类 型的临床抗生 素相继出现耐药， 其速度已超过目前新抗生素的研发速度， 成为 超级广谱耐药菌， 严重威 胁着人类的生命健康。 病原菌的耐药性是天生固有的， 人们在抗生素药物的使用过程中， 对这些耐药菌起到了富集作用， 而使其变为 优势病原菌进行广泛传播与感染。 长期的临床 和科研实践表明： 很多抗菌药物 对敏感病原菌具有杀灭或抑制作用。
6、， 但却不能杀灭或抑制 耐药菌， 即使是从未 接触过病原菌的抗菌药物， 所以抗耐药菌药物的发现必需通过筛选， 而无法根 据现有抗生素的抗菌作用进行简单的推断。 目前流行最广的耐药菌为MRSA， 由 于其对多种结构类型的抗生素耐药， 已被人们称为 “超级病原菌” 。 故抗MRSA 药物的发现和 研发显得尤为迫切(Daniel A.Methods.Mol.Biol.,2014,1085:311-331)。 0003 熊果酸(Ursolic Acid)为植物来源的五环三萜类化合物， 又名乌索酸、 乌 苏酸， 分子式为： C30H48O3， 化学命名为： 3 -羟基乌苏-12-烯-28 -羧酸， 广泛。
7、 分布于多种植物的不 同部位， 如迷迭香叶、 女贞子、 枇杷叶和长春花叶等。 研 究表明， 熊果酸具有抗肿瘤、 抗菌、 抗炎和抗HIV等功效。 为增强其抗肿瘤、 抗炎和抗HIV等生物活性， 目前对熊果酸的结构修 饰主要集中在C3位羟基、 C28位羧基和A环的开环和骈和新环(Ma CM,et al.Bioorg Med Chem,2009,17: 848-854； Gnoatto SCB,et al.Eur J Med Chem,2008,43:1865-1877)。 未 见有增强其抗菌 活性的结构修饰， 也未见有C3位羟基的胺化取代修饰。 鉴于抗MRSA药物研 发的迫切， 通过对熊果酸抗革兰氏。
8、阳性菌(包括抗多重耐药菌)、 阴性菌和真 菌的系统研 究， 我们首次发现熊果酸具有一定的抗多重耐药菌MRSA活性， 其对测试MRSA菌株的最低抑 菌浓度(MIC)为64128 g/mL， 但活性有待 进一步提高， 且难溶于水， 成药性尚有待加强。 为此我们首次设计出C3羟基 被氨基或脂肪氨基取代的熊果酸衍生物， 并以市售和植物中 提取的熊果酸为原 料， 通过氧化和还原胺化反应制备了上述设计的熊果酸衍生物， 且通过 试验证 明所得熊果酸衍生物具有显著的抗MRSA活性， 比修饰前的熊果酸的抗MRSA 活性增 强48倍； 且水溶性得到显著改善， 显示良好的应用前景和价值， 可 用应用于抗多重耐药 菌。
9、MRSA药物的制备。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种新熊果酸衍生物及其制备方法和在制备抗MRSA 药物中 的应用。 0005 本发明的熊果酸衍生物， 其分子结构如式 所示： 说明书 1/10 页 3 CN 108822179 A 3 0006 0007 式中， R1为甲基或氢： 当R1为甲基， R2为甲基时， 式 为3-二甲氨基乌 苏-12-烯-28 -羧酸(1)； 当R1为氢， R2为氢时， 式 为3-氨基乌苏-12-烯-28 - 羧酸(2)； 当R1为氢， R2为甲 基时， 式 为3-甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(3)； 当R1为氢， R2为乙基时， 式 为3-乙氨基乌 。
10、苏-12-烯-28 -羧酸(4)。 0008 本发明所述熊果酸衍生物的制备方法是： 取一定量的熊果酸溶于二氯甲烷 中， 搅 拌下加入一定量的沙瑞特试剂， 1040下反应18h， 反应混合物用二 氯甲烷萃取， 经硅 胶柱层析分离纯化， 得熊果酸的3-羟基氧化产物(UA-O)， 然后用无水乙醇溶解， 依次加入 一定量含氨或脂肪胺的醇溶液、 钛酸异丙酯， 2550下搅拌反应24h， 降至室温后再加 入三乙酰氧基硼氢化钠反应23h， 随后用乙酸乙酯萃取， 硅胶柱分离纯化， 得本发明的熊 果酸衍生物。 0009 本发明所述熊果酸衍生物制备方法中原料熊果酸的分子结构如式所示： 0010 0011 式所示熊。
11、果酸可由商业购买获得， 也可由商业可获得的含熊果酸的植物 原料 或植物提取物按照熟知的方法和技术， 经提取、 分离和纯化方法制备获得。 0012 本发明所述熊果酸衍生物制备的合成路线如下所示： 说明书 2/10 页 4 CN 108822179 A 4 0013 0014 本发明是在二氯甲烷中用沙瑞特试剂(Sarrett reagent)对熊果酸的C3位羟 基 进行氧化， 得上述熊果酸的3-羟基氧化产物(UA-O)， 其氧化温和， 且较戴 斯马丁氧化剂 (Dess-Martin oxidation reagent)反应快速、 且得率高， 同时也可 保持熊果酸结构中的 双键和羧基不被氧化； 而选。
12、用钛酸异丙酯和三乙酰氧基硼 氢化钠(NaBH(OAc)3， Sodium triacetoxyborohydride)对熊果酸的3-羟基氧化 产物(UA-O)进行C3位酮的还原胺化反 应， 具有操作简单安全、 选择性强和 收率高等特点。 经实验证明： 所得熊果酸衍生物14具 有显著的抗MRSA作 用， 其对测试MRSA菌株的最低抑菌浓度(MIC)为1632 g/mL， 为熊果 酸对测试MRSA菌株MIC的48倍， 且可与等摩尔的盐酸成盐而显著改善其 水溶性。 显示其 作为抗MRSA药物开发的良好前景， 可用于制备治疗MRSA 感染的药物。 具体实施方式 0015 实施例1： 0016 称取熊果。
13、酸(98.6)0.91g(2.0mmol)加入100mL圆底烧瓶中， 加50mL 二氯甲烷， 充分搅拌至完全溶解， 加入0.11g(5.0mmol)沙瑞特试剂， 10 搅拌反应8h， 加入纯水猝灭 反应， 分液漏斗分液， 水层用二氯甲烷再萃取一 次， 合并二氯甲烷萃取液， 经硅胶层析柱 (二氯甲烷 乙酸乙酯， 5 1)分离 纯化， 得熊果酸C3位羟基的氧化产物(UA-O)0.74g， 纯度 98.2。 0017 取0.14g UA-O(0.30mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入氨饱和的无水乙 醇溶液充分 溶解， 在氩气保护下加入0.50mL钛酸异丙酯溶液， 25下搅拌反 应6h后， 再加入。
14、0.063g (0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反应2h， 然后用 纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃取， 有机层水 洗、 无水硫酸钠脱水， 过硅胶柱层析 (甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓缩、 干燥， 得熊 果酸衍生物2： 3- 氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.09g)， 纯度99.1。 取10mg熊果酸衍生物2， 将其溶于70乙醇溶液中， 搅拌下用10盐酸调pH 56， 然后减压回收乙醇， 剩余水溶液 说明书 3/10 页 5 CN 108822179 A 5 冻干， 得熊果酸衍生物2的盐酸盐(10.5mg)。 0018 取0.14g UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧。
15、瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的甲胺醇溶液、 0.5mL钛酸异丙酯溶液， 40下 搅拌反应4h后降至室温， 再加入0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反 应2h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃 取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊果酸 衍生物3： 3-甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.11g)， 纯度98.5。 取10mg 熊果 酸衍生物3， 将其溶于70乙醇溶液中， 搅拌下用10盐酸调pH 56， 然后减 压回收 乙醇， 剩余水溶液冻干， 得熊果酸衍生物3的盐酸。
16、盐(10.3mg)。 0019 取0.14g UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的一乙胺醇溶液、 0.5mL钛酸异丙酯溶液， 35 下搅拌反应6h后降至室 温， 再加入0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠 反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯 萃取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱 水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊 果酸衍生物4： 3-乙氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.08g)， 纯度98.1。 取10mg 熊果酸衍生物4， 将其溶于70乙醇溶液中， 搅拌。
17、下用10盐酸调pH 56， 然 后减压回收 乙醇， 剩余水溶液冻干， 得熊果酸衍生物4的盐酸盐(10.1mg)。 0020 取0.14g UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的二甲胺醇溶液、 0.5mL钛酸异丙酯溶液， 50 下搅拌反应4h后降至室 温， 再加入0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠 反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯 萃取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱 水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊 果酸衍生物1： 3-二甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸。
18、(0.10g)， 纯度98.3。 取 10mg 熊果酸衍生物1， 将其溶于70乙醇溶液中， 搅拌下用10盐酸调pH 56， 然 后减压 回收乙醇， 剩余水溶液冻干， 得熊果酸衍生物1的盐酸盐(10.1mg)。 0021 实施例2： 0022 称取购买的熊果酸(99)1.37g(3mmol)加入100mL圆底烧瓶中， 加 50mL二氯甲 烷， 充分搅拌至完全溶解， 加入1.61g(约7.5mmol)沙瑞特试 剂， 40搅拌反应1h， 加入纯水 猝灭反应， 分液漏斗分液， 水层用二氯甲烷 再萃取一次， 合并二氯甲烷萃取液， 经硅胶层析 柱(二氯甲烷 乙酸乙酯， 5 1)分离纯化， 得熊果酸C3位羟。
19、基的氧化产物(UA-O)1.02g， 纯度 98.6。 0023 取0.28g UA-O(0.60mmol)置100mL三口烧瓶中， 加入氨饱和的无水乙 醇溶液充分 溶解， 在氩气保护下加入1.0mL钛酸异丙酯溶液， 35下搅拌反 应5h后降至室温， 再加入 0.13g(0.6mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反应2h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃取， 有机 层水洗、 无水硫酸钠脱水， 过硅胶 柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓缩、 干燥， 得熊果酸衍生物 2： 3-氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.19g)， 纯度98.0。 取20mg熊果酸衍生 物 2， 将其溶于70。
20、乙醇溶液中， 搅拌下用10盐酸调pH 56， 然后减压回收乙 醇， 剩余 水溶液冻干， 得熊果酸衍生物2的盐酸盐(21.1mg)。 0024 取0.14g UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的甲胺醇溶液、 0.5mL钛酸异丙酯溶液， 40下 搅拌反应4h后降至室温， 再加入0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反 应2h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃 取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 说明书 4/10 页 6 CN 108822179 A 6 缩、。
21、 干燥， 得熊果酸 衍生物3： 3-甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.09g)， 纯度99.1。 0025 取0.14g UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的一乙胺醇溶液、 0.5mL钛酸异丙酯溶液， 50 下搅拌反应2h后降至室 温， 再加入0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠 反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯 萃取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱 水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊 果酸衍生物4： 3-乙氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.10g。
22、)， 纯度98.4。 0026 取0.28g UA-O(0.6mmol)置100mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在氩气保护下 依次加入3倍当量的二甲胺醇溶液、 1.0mL钛酸异丙酯溶液， 40 下搅拌反应2h后降至室 温， 再加入0.13g(0.6mmol)三乙酰氧基硼氢化钠 反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯 萃取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱 水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊 果酸衍生物1： 3-二甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.18g)， 纯度98.7。 0027 实施例3： 0028 称取熊果酸(98.6)1.3。
23、7g(3mmol)加入100mL圆底烧瓶中， 加50mL 二氯甲烷， 充 分搅拌至完全溶解， 加入1.61g(约7.5mmol)沙瑞特试剂， 15 搅拌反应6h， 加入纯水猝灭 反应， 分液漏斗分液， 水层用二氯甲烷再萃取一 次， 合并二氯甲烷萃取液， 经硅胶层析柱 (二氯甲烷 乙酸乙酯， 5 1)分离 纯化， 得熊果酸C3位羟基的氧化产物(UA-O)1.19g， 纯度 98.7。 0029 取0.28g UA-O(0.60mmol)置100mL三口烧瓶中， 加入氨饱和的无水乙 醇溶液溶 解， 在氩气保护下加入1.0mL钛酸异丙酯溶液， 35下搅拌反应5h 后降至室温， 再加入 0.13g(0。
24、.6mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反应3h， 然后用 纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃取， 有机 层水洗、 无水硫酸钠脱水， 过硅胶柱层析 (甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓缩、 干燥， 得熊果酸衍生物2： 3- 氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.17g)， 纯度98.8。 取30mg熊果酸衍生 物2， 将其溶于70乙醇溶液中， 搅拌下用10盐酸调pH 56， 然后减压回收乙醇， 剩余 水溶液冻干， 得熊果酸衍生物2的盐酸盐(30.7mg)。 0030 取0.14g UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的甲胺醇溶液、 0。
25、.5mL钛酸异丙酯溶液， 25下 搅拌反应4h后， 再加入 0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反应2h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃取， 有机 层水洗、 无水硫酸钠脱水， 过硅胶 柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓缩、 干燥， 得熊果酸衍生物 3： 3-甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.08g)， 纯度98.1。 0031 取0.14g UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的一乙胺醇溶液、 0.5mL钛酸异丙酯溶液， 35 下搅拌反应2h后降至室 温， 再加入0.063g(0.3mmo。
26、l)三乙酰氧基硼氢化钠 反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯 萃取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱 水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊 果酸衍生物4： 3-乙氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.11g)， 纯度98.2。 0032 取0.28g UA-O(0.6mmol)置100mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在氩气保护下 依次加入3倍当量的二甲胺醇溶液、 1.0mL钛酸异丙酯溶液， 25 下搅拌反应3h后， 再加入 0.13g(0.6mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃取， 有机 层水洗、 无水。
27、硫酸钠脱水， 过硅胶 柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓缩、 干燥， 得熊果酸衍生物 1： 3-二甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.20g)， 纯度98.5。 说明书 5/10 页 7 CN 108822179 A 7 0033 实施例4： 0034 称取购买的熊果酸(99)1.37g(3mmol)加入100mL圆底烧瓶中， 加 50mL二氯甲 烷， 充分搅拌至完全溶解， 加入1.61g(约7.5mmol)沙瑞特试 剂， 25搅拌反应4h， 加入纯水 猝灭反应， 分液漏斗分液， 水层用二氯甲烷 再萃取一次， 合并二氯甲烷萃取液， 经硅胶层析 柱(二氯甲烷 乙酸乙酯， 5。
28、 1)分离纯化， 得熊果酸C3位羟基的氧化产物(UA-O)1.13g， 纯度 98.4。 0035 取0.14g UA-O(0.30mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入氨饱和的无水乙 醇溶液溶解， 在氩气保护下加入0.5mL钛酸异丙酯溶液， 25下搅拌回流6h 后， 再加入0.063g(0.3mmol) 三乙酰氧基硼氢化钠反应2h， 然后用纯水猝 灭反应， 乙酸乙酯萃取， 有机层水洗、 无水硫酸 钠脱水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓缩、 干燥， 得熊果酸衍生物2： 3-氨基乌 苏-12-烯-28 -羧酸(0.09g)， 纯度98.1。 0036 取0.14g 。
29、UA-O(0.3mmol)置50mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在 氩气保护下 依次加入3倍当量的甲胺醇溶液、 0.5mL钛酸异丙酯溶液， 45下 搅拌反应5h后降至室温， 再加入0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠反 应2h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯萃 取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊果酸 衍生物3： 3-甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.10g)， 纯度98.3。 0037 取0.28g UA-O(0.3mmol)置100mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇溶解， 在氩气保护下 依。
30、次加入3倍当量的一乙胺醇溶液、 1.0mL钛酸异丙酯溶液， 35 下搅拌反应2h后降至室 温， 再加入0.063g(0.3mmol)三乙酰氧基硼氢化钠 反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙酯 萃取， 有机层水洗、 无水硫酸钠脱 水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压浓 缩、 干燥， 得熊 果酸衍生物4： 3-乙氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.21g)， 纯度98.5。 取20mg 熊果酸衍生物4， 将其溶于70乙醇溶液中， 搅拌下用10盐酸调pH 56， 然 后减压回收 乙醇， 剩余水溶液冻干， 得熊果酸衍生物4的盐酸盐(20.7mg)。 0038 取0.28。
31、g UA-O(0.6mmol)置100mL三口烧瓶中， 加入无水乙醇充分溶 解， 在氩气保 护下依次加入3倍当量的二甲胺醇溶液、 1.0mL钛酸异丙酯溶液， 50下搅拌反应4h后降至 室温， 再加入0.13g(0.6mmol)三乙酰氧基硼氢 化钠反应3h， 然后用纯水猝灭反应， 乙酸乙 酯萃取， 有机层水洗、 无水硫酸 钠脱水， 过硅胶柱层析(甲醇 乙酸乙酯， 10 1)， 洗脱液减压 浓缩、 干燥， 得熊果酸衍生物1： 3-二甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸(0.17g)， 纯度98.5。 0039 实施例5： 0040 3-氧代乌苏-12-烯-28 -羧酸(UA-O)： 分子式为C30H。
32、46O3， 白色无定形粉 末， 溶于甲 醇、 乙醇， 易溶于乙酸乙酯、 丙酮等； TLC薄层板上5硫酸乙醇 显红色、 改良碘化铋钾显橘 黄色； ESI-MS(m/z):455.4M+H+， 其13C NMR (MeOH-d4,100MHz)数据见表1。 0041 熊果酸衍生物1： 3-二甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸， 分子式为C32H53NO2， 白色无定 形粉末， 易溶于甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 二甲基亚砜等， 微溶于石油 醚， 其盐酸盐可溶于水； TLC薄层板上5硫酸乙醇显红色、 改良碘化铋钾显 橘黄色；220 (1.5)； ESI-MS(m/z):484.4M+H+， 其13C 。
33、NMR (MeOH-d4,100MHz)数据见表1。 0042 熊果酸衍生物2： 3-氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸， 分子式为C30H49NO2， 白色 无定形粉 末， 易溶于甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 二甲基亚砜等， 微溶于石油醚， 其盐酸盐可溶于水； TLC薄 说明书 6/10 页 8 CN 108822179 A 8 层板上5硫酸乙醇显红色、 改良碘化铋钾显橘黄 色；220(1.5)； ESI-MS(m/z):456.4M+H+， 其13C NMR (MeOH-d4,100MHz)数据见表1。 0043 熊果酸衍生物3： 3-甲氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸， 分子式为C31H51。
34、NO2， 白 色无定形 粉末， 易溶于甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 二甲基亚砜等， 微溶于石油醚， 其盐酸盐可溶于水； TLC 薄层板上5硫酸乙醇显红色、 改良碘化铋钾显橘黄 色；220(1.5)； ESI-MS(m/z):470.4M+H+， 其13C NMR (MeOH-d4,100MHz)数据见表1。 0044 熊果酸衍生物4： 3-乙氨基乌苏-12-烯-28 -羧酸， 分子式为C32H53NO2， 白 色无定形 粉末， 易溶于甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 二甲基亚砜等， 微溶于石油醚， 其盐酸盐可溶于水； TLC 薄层板上5硫酸乙醇显红色、 改良碘化铋钾显橘黄 色；220(1.5)； ES。
35、I-MS(m/z):484.4M+H+， 其13C NMR (MeOH-d4,100MHz)数据见表1。 0045 表1熊果酸衍生物14的13C NMR(100MHz)数据( in MeOH-d4) 0046 0047。 0048 实施例6： 说明书 7/10 页 9 CN 108822179 A 9 0049 取迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)叶2kg依次加95乙醇20L、 15L回流 提 取2次， 合并提取液， 减压浓缩、 干燥， 得迷迭香叶乙醇提物， 然后用氯仿 索氏提取得提取 液， 减压浓缩后， 上硅胶层析柱， 用二氯甲烷:乙酸乙酯(4:1) 洗脱， 收集富。
36、含熊果酸的部 位， 收集液减压浓缩、 干燥， 然后用乙醇结晶和重 结晶， 得熊果酸10.7g， HPLC分析表明其纯度 为98.6， 色谱条件为： SinoChrom ODS-BP反相色谱柱(4.525mm,5 m)， DAD检测器， 检测波 长210nm， 流 动相为乙腈:甲醇:0.5醋酸铵水溶液(67:12:21)， 流速1.0mL/min， 柱温25， 检测时长20min。 上述所制备熊果酸的分子式为C30H48O3， 沙粒状结晶(乙醇)， 不溶于水， 溶于 甲醇、 乙醇、 氯仿、 乙酸乙酯、 二甲基亚砜； m.p.282285 (Dec.)； 220(1.5)；3340,2946,28。
37、36,1696, 1389,1364,1321,1304,1273,1184, 1032； HR-ESI-MS： 457.3685M+H+； 13C NMR(MeOH-d4,100MHz) ppm： 181.7、 139.6、 126.9、 79.7、 56.7、 54.4、 49.2、 48.6、 43.2、 40.8、 40.4、 40.4、 40.0、 39.8、 38.2、 38.1、 34.3、 31.8、 29.2、 28.8、 27.8、 25.3、 24.3、 21.6、 21.0、 19.5、 17.8、 17.7、 16.4、 15.9。 0050 此从迷迭香叶制备的熊果酸。
38、可用于本发明所述熊果酸衍生物制备的原料， 同时， 熊果酸衍生物制备的原料熊果酸也可从枇杷叶和长春花等多种植物采用 上述方法制备而 广泛获得。 另外， 熊果酸衍生物制备的原料熊果酸也可从市场 上通过购买的方式广泛获 得。 0051 熊果酸衍生物14的抗MRSA活性试验 0052 1、 实验材料及方法 0053 试验菌株： 0054 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株： MRSA ATCC 33592 (Methicillin- resistant Staphylococcus aureus ATCC 33592)； 耐甲氧西林金 黄色葡萄球菌临床菌 株： MRSA 01和MRSA 03。 0055。
39、 牛肉膏蛋白胨培养基： 0056 牛肉膏3g， 蛋白胨10g， 氯化钠5g， 纯水1000mL， pH 7.4。 0057 测试化合物： 熊果酸衍生物14。 0058 对照化合物： 熊果酸(Ursolic acid)。 0059 测试溶液的配制： 分别准确称取熊果酸、 熊果酸衍生物1、 2、 3和4适量， 加入少量 DMSO溶解， 然后用牛肉膏蛋白胨培养液制成终浓度为512 g/mL 的测试用对照品溶液和样 品溶液(DMSO浓度小于5)。 0060 上述化合物的抗MRSA活性均采用微量肉汤稀释法进行测试， 过程如下： 将牛肉膏 蛋白胨培养基加到灭菌好的96孔聚苯乙烯板中， 每孔加100 L， 。
40、然 后在同一板上分别将100 L对照品溶液和样品溶液加入对应行的第1孔， 最 后1行做溶剂空白对照， 混匀， 然后按倍 比稀释法进行稀释， 使第1孔至第11 孔化合物的浓度分别为512、 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1和0.50 g/mL， 第12孔做生长对照， 不加任何样品和对照品溶液。 最后于每孔中加入经 牛肉 膏蛋白胨培养基稀释成孢子浓度为1.0107CFU/mL的试验菌悬液， 每孔加100 L， 即 得到化合物浓度分别为256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5和0.25 g/mL的菌样混合物。 盖封 后置温度37、 转。
41、速150rpm的恒温摇床中， 孵育 20h判断结果。 当生长对照孔和溶剂对照孔 内试验菌株明显生长时， 以小孔内 完全抑制试验菌株生长的最低化合物浓度为该化合物 说明书 8/10 页 10 CN 108822179 A 10 对试验菌株的最低抑菌 浓度(MIC)。 0061 2、 实验结果 0062 熊果酸、 熊果酸衍生物1、 2、 3和4的抗MRSA活性(以最低抑菌浓度表 示)试验结果 见表2； 0063 表2熊果酸及衍生物的抗MRSA的活性 0064。 0065 3、 结论 0066 由表2可知， 熊果酸衍生物1、 2、 3和4对上述MRSA菌株生长具有显 著的抑制作用， 其抗MRSA活性。
42、明显强于熊果酸， 为熊果酸的48倍。 因此， 本发明的式 所示的熊果酸衍生 物具有显著的抗MRSA作用， 且活性明显强 于修饰前的熊果酸， 故可用于制备治疗MRSA感染 的药物。 另外， 熊果酸衍 生物1、 2和3的结构和理化性质相似， 且表1显示三个化合物的抗 MRSA活 性无明显差别。 故可选用其中的任意一个， 也可选用二个或三个的混合物来制 备 抗MRSA药物， 用于治疗MRSA感染的疾病。 0067 熊果酸衍生物2的片剂制备 0068 0069 2.制法： 0070 (1)10淀粉浆的制备： 将2g淀粉加入约20ml纯化水中， 加热糊化， 制成10的淀 粉浆。 0071 (2)制粒： 。
43、取处方量熊果酸衍生物2与淀粉混合均匀， 加适量10淀粉 浆制软材， 过16目筛制粒， 将湿粒于4050干燥， 用16目筛整粒并与滑石 粉混匀。 0072 (3)压片： 将上述熊果酸衍生物2颗粒在压片机上压片， 得熊果酸衍生 物2片。 0073 3.片剂质量测定 0074 (1)检查项目及方法： 分别按照现行版 中华人民共和国药典 附录 A 和A测定 上述片剂的重量差异和崩解时限。 0075 (2)结果： 上述制备片剂的含量差异和崩解时限结果见表3。 0076 表3制备片剂的重量差异和崩解时限 说明书 9/10 页 11 CN 108822179 A 11 0077 0078。 0079 熊果酸。
44、衍生物1片剂的制备 0080 0081 2.制法： 0082 (1)10淀粉浆的制备： 将2g淀粉加入约20ml纯化水中， 加热糊化， 制成10的淀 粉浆。 0083 (2)制粒： 取处方量熊果酸衍生物1与淀粉混合均匀， 加适量10淀粉 浆制软材， 过16目筛制粒， 将湿粒于4050干燥， 用16目筛整粒并与滑石 粉混匀。 0084 (3)压片： 将上述熊果酸衍生物1颗粒在压片机上压片， 得熊果酸衍生 物1片。 0085 3.片剂质量测定 0086 (1)检查项目及方法： 分别按照现行版 中华人民共和国药典 附录 A 和A测定 上述片剂的重量差异和崩解时限。 0087 (2)结果： 上述制备片剂的含量差异和崩解时限结果见表4。 0088 表4制备片剂的重量差异和崩解时限 0089。 说明书 10/10 页 12 CN 108822179 A 12 。