《肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 102747166 B (45)授权公告日 2014.05.07 CN 102747166 B (21)申请号 201210262158.7 (22)申请日 2012.07.26 C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (73)专利权人 首都儿科研究所 地址 100020 北京市朝阳区雅宝路 2 号 (72)发明人 孙红妹 李少丽 薛冠华 赵汉青 冯燕玲 (74)专利代理机构 北京中伟智信专利商标代理 事务所 11325 代理人 张岱 (54) 发明名称 肺炎支原体耐药菌株的 PCR-SNP 检测方法 (57) 摘要 本发明根据已知。
2、的 Mp23S rRNA 中的耐药突 变基因位点设计 3 条引物对其进行特异性扩增， 为增加引物的特异性， 人为在特异性引物的 3 端引入一个错配碱基且 3端末端落在突变位点 上 ； 利用上述引物及其它 PCR 组份构建 PCR 反应 体系 ； 提取待测样本 DNA， 加入上述 PCR 反应体系 并进行扩增， 将上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳， 判定是否发生耐药基因突变。 (51)Int.Cl. 审查员 武雪梅 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 (10)授。
3、权公告号 CN 102747166 B CN 102747166 B 1/1 页 2 1. 一种肺炎支原体耐药菌株的 PCR-SNP 检测的引物， 其特征在于引物序列为 F ： 5 AGAAGGAGGTTAGCGCAAGCG3 ， S ： 5 TATATTAGGCGCAACGGGACAGA3 ， R ： 5 CTGGATAACAGTTACC AATTAGAACAGC3 ， 所述的引物是针对 Mp23S rRNA 中的耐药突变基因位点 2063。 权 利 要 求 书 CN 102747166 B 2 1/4 页 3 肺炎支原体耐药菌株的 PCR-SNP 检测方法 技术领域 0001 本发明属于生。
4、物、 医药领域， 具体地涉及一种肺炎支原体耐药菌株的 PCR-SNP 检 测方法。 背景技术 0002 肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae， Mp) 是社区获得性呼吸道感染的重要致病 菌之一， 其感染后的临床表现可以从轻度的咽喉炎、 支气管炎到重症间质性肺炎 ( 原发性 非典型肺炎)及神经系统、 心血管系统并发症等。 Mp流行具有周期性， 每3-7年在不同地区 出现发病率高峰。儿童肺炎中 10-30的病例是 Mp 引起的， 在流行高峰年 Mp 肺炎可高达 30-50， 且流行可持续 1-2 年。进入 21 世纪以来， 全球性的 Mp 感染暴发流行已出现了两 次， 分别在2。
5、005-2007年和2010-2012年初发生。 Mp感染暴发流行对家庭、 学校、 部队、 社会 都会产生较大的经济损失和社会不良影响。 0003 肺炎支原体无细胞壁， 是目前已知的能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核 细胞型微生物， 其对青霉素等作用于细胞壁的抗生素天然耐药。能用于治疗支原体肺炎的 药物目前仅有大环内酯类、 喹诺酮类、 氨基糖甙类、 四环素类等药物， 由于大部分药物对儿 童正常生长发育有副作用， 目前大环内酯类抗生素是治疗儿童支原体感染的首选药物。以 往的研究表明， 及时采用适当的抗生素可预防、 治疗肺炎支原体感染导致的肺炎， 能够缩短 暴发流行的过程。但是， 随着大环内酯。
6、类药物在临床上的广泛应用， 其耐药现象也不断出 现， 并呈逐渐增加趋势。近年来， 已有美国、 日本、 法国、 德国、 芬兰等多个国家报道了 MP 耐 药株的出现， 我国则有更多耐药株出现的报道， 造成治疗用的抗生素失效。 0004 目前， 大量的研究资料表明， 肺炎支原体耐大环内酯类药物的机制主要为基因突 变， 其中 23S rRNA 基因区部分的基因突变是其对大环内酯类药物耐药的主要原因之一。这 些位点主要集中在2063、 2064和2617等。 而目前国内外用于Mp耐药性检测的方法主要有 ： 对 PCR 产物的直接测序法， 毛细管电泳法， 限制性片段长度多态性， 荧光定量 PCR 等。虽然。
7、 这些方法比较可靠， 但均存在费时和工作量大等问题， 应用于大规模的临床检测服务还有 待探讨。理想的 Mp 耐药突变检测方法应该是不需复杂的设备、 操作简单、 花费低、 不需使用 有害试剂或同位素、 高效率、 耗时短等。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种肺炎支原体耐药菌株的 PCR-SNP 检测方法， 通过设计 3 条引物可一次性检测出肺炎支原体的任一耐药突变位点， 以解决目前肺炎支原 体耐药性检测方法中费时、 费力且不能在临床上大规模检测标本的问题。 0006 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 0007 (1) 一种肺炎支原体耐药菌株的 PCR-SNP 检测方法， 具体。
8、包括以下步骤 ： 0008 根据已知的Mp23S rRNA中的耐药突变基因位点(2063、 2064、 2611、 2616、 2617等) 设计 1 条上游引物、 1 条下游引物和 1 条特异性引物对其进行特异性扩增， 特异性引物是人 说 明 书 CN 102747166 B 3 2/4 页 4 为在引物的 3端引入一个错配碱基且 3端末端落在突变位点 ； 0009 (2) 提取待测样本 DNA ； 0010 (3) 利用上述 3 条引物、 样本 DNA 及其它 PCR 组份构建 PCR 反应体系并进行扩增 ； 0011 (4) 对上述 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 判定是否发生耐药基因。
9、突变。 0012 进一步， 所述的步骤 (1) 中的 3 条引物为 F ： 5 AGAAGGAGGTTAGCGCAAGCG3 ， S ： 5 TATATTAGGCGCAACGGGACAGA 3 ， R ： 5 CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACAGC 3 。 0013 进 一 步， 所 述 的 步 骤 (3) 中 的 PCR 反 应 体 系 为 25l ： 10PCR reaction buffer2.5l， MgCl2(25mM)2l， dNTPs(2.5mM)2l， 上游引物 F(10M)1.0l， 下游引物 R(10M)1.0l， 特异性引物 S(10M)1.5l， Ta。
10、q DNA polymerase(2.5U)1l， DNA 模板 3l、 双蒸水 11l。 0014 进 一 步， 所 述 的 步 骤 (3) 中 的 PCR 扩 增 条 件 为 预 变 性 94 10min， 接 着 94 0.5min， 58 0.5min， 72 1min， 30 个循环， 最后 72延伸 10min。 0015 本发明的原理是根据已知的 Mp23S rRNA 中的耐药突变基因位点 (2063、 2064、 2611、 2616、 2617等)设计3条引物对其进行特异性扩增， 为增加引物的特异性， 人为在特异 性引物的 3端引入一个错配碱基且 3端末端落在突变位点， 如果。
11、特异性引物和下游引 物扩增的片段的第一个碱基发生了基因突变， 特异性引物则不能继续延伸扩增下去， 反之， 则可扩增。根据琼脂糖凝胶电泳结果结果判定是否发生耐药基因突变。以下 DNA 序列标记 部分依次显示为 2063、 2064、 2611、 2616、 2617 等突变位点。 0016 gtgacacctgcccagtgctggaaggttaaagaaggaggttagcgcaagcgaagcttttaactgaagccc cagtgaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattcctagtcgggtaaattccgtcccgcttgaat ggtgtaa。
12、ccatctcttgactgtctcggctatagactcggtgaaatccaggtacgggtgaagacacccgttaggcgca acgggacggaaagaccccgtgaagctttactgtagcttaatattgatcaggacattatcatgtagagaataggtagg agcaatcgatgcaagttcgctaggacttgttgatgcgaaaggtggaatactacccttggttgtgtgctgttctaatt ggtaactgttatccagtttcaagacagtgttaggtgggcagtttgactggggcggtcgcctcctaaaaggtaa。
13、cgga ggcgtacaaaggtaccttcagtacggttggaaatcgtatgtagagtgtaatggtgtaagggtgcttgactgtgagac atacaggtcgaacaggtgagaaatcaggtcatagtgatccggtggtccagtatggaatggccatcgctcaacggata aaagctactccggggataacaggctgatactgcccaagagttcatatcgacggcagtgtttggcacctcgatgtcga ctcatctcatcctcgagctgaagcaggttcgaagggttcggctgttcgccgattaaagaga。
14、tacgtgagttgggttc aaaccgtcgtgagacaggttggtccctatctattgtgcccgtaggaagattgaagagtgttgcttcta 附图说明 0017 图 1 基于 SNP 方法的单管 PCR 法 (PCR-SNP 法 ) 示意图 ； 0018 图2根据2063位点设计的3条引物对样本扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳图谱 ： M ： Marker， 1-9 ： 临床标本， FH ： Mp 标准株， N ： 阴性对照。 具体实施方式 0019 下面通过实施例结合附图对本发明的技术方案做进一步解释。 0020 根据已知的 Mp23S rRNA 中的耐药突变基因位点。
15、 2063 设计 3 条引物对其进行特异 性扩增， 为增加引物的特异性， 人为在特异性引物的 3端引入一个错配碱基且 3端末端 说 明 书 CN 102747166 B 4 3/4 页 5 落在 2063 位点， 如果特异性引物和下游引物扩增的片段的第一个碱基即 2063 位点发生了 基因突变， 特异性引物则不能继续延伸扩增下去， 反之， 则可扩增， 具体反应原理示意图见 图 1。根据琼脂糖凝胶电泳结果判定是否发生耐药基因突变。 0021 一种肺炎支原体耐药菌株的 PCR-SNP 检测方法， 具体包括以下步骤 ： 0022 (1) 针对 Mp23S rRNA 中的耐药突变基因位点 2063 设。
16、计 3 条引物 ： 常规 PCR 引物 的 3 末端不能发生错配， 因为序列的延伸是从引物的 3 开始。在该 PCR-SNP 方法中， 我们 设计特异性引物 (S) 的 3 末端最后一位碱基落在 2063 位点， 该碱基可以与未突变株序列 互补而与突变株不匹配， 但是如果该引物的 3 端只有一个错配碱基， 在 2063 位点发生突 变时， 该引物仍可或多或少地被延伸， 因此为了保证该检测的准确性， 防止错配情况下序列 仍被延伸， 我们在特异性引物的 3 端的倒数第三位人为引入一个错配碱基， 即 accession no.X68422.1. 基因序列的 2061 位点 g a 错配改变 ( 表 。
17、1 引物 S 序列黄色部分 )， 保证了 扩增的特异性， 3 条引物序列见表 1。 0023 表 1 ： PCR-SNP 法扩增 Mp23S rRNA 2063 位点的引物序列 0024 0025 注 ： 1、 该核苷酸位置参照 GenBank 中的 accession no.X68422.1. 0026 2、 364bp 是上游引物 (F) 和下游引物 (R) 扩增的片段长度 ； 183bp 是特异性引物 (S) 和下游引物 (R) 扩增的片段长度， 扩增示意图见图 1。 0027 (2) 样本 DNA 的提取 ： 样本来自疑似支原体感染患者， 标本可以为痰、 鼻咽拭子、 肺 泡灌洗液、 胸。
18、腔积液、 脑脊液、 关节液、 血液等所有可来自患者的体液 ； 取标本原液 400ul， 15000rpm离心15分钟， 弃上清。 加裂解液A 50ul(含5NP-40)， 裂解液B2ul(蛋白酶K)。 涡旋震荡混匀， 稍离心， 运行 56 1 小时， 100 10 分钟， 程序结束后 15000rpm 离心 15 秒， 即为样本 DNA。 0028 (3)PCR 反应体系建立及扩增程序 0029 PCR 扩 增 体 系 为 25l ： 10PCR reaction buffer2.5l， MgCl2(25mM)2l， dNTPs(2.5mM)2.0l， 上游引物 (10M)1.0l， 下游引物。
19、 (10M)1.0l， 特异性引物 (10M)1.5l， Taq DNA polymerase(2.5U)1l， DNA 模板 3l、 双蒸水 11l。 0030 扩 增 条 件 为 预 变 性 94 5min， 接 着 30 个 循 环 ： 变 性 94 0.5min， 退 火 58 0.5min， 延伸 72 1min， 最后 72延伸 10min。同时设立阳性对照和阴性对照。 0031 (4) 琼脂糖凝胶电泳检测 ： PCR 产物用 2琼脂糖凝胶电泳即可区分是否耐药。 0032 (5) 结果判定 ： 0033 对 PCR 产物进行 2琼脂糖凝胶电泳， 120V 30min， 紫外光下观察。
20、， 或者在凝胶成 像系统中观察分析， 结果如图 2 所示， 第 5、 6、 7、 8、 10 泳道为 1 条带， 说明这些标本发生了耐 说 明 书 CN 102747166 B 5 4/4 页 6 药突变 ； 第 4、 9 泳道为 2 条带， 说明这两个标本未发生耐药突变。第 1、 2、 3 泳道没有扩增产 物为非肺炎支原体感染标本。 说 明 书 CN 102747166 B 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102747166 B 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 102747166 B 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102747166 B 9 。