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1、(10)申请公布号 CN 102757887 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757887 A *CN102757887A* (21)申请号 201210125525.9 (22)申请日 2012.04.26 102011017596.2 2011.04.27 DE C12M 1/00(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 罗伯特博世有限公司 地址 德国斯图加特 (72)发明人 M. 道布 J. 施泰格特 C. 多勒 J. 鲁普 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 李永波 杨国治 (54) 发明。
2、名称 用于聚合酶链反应的微流系统和方法 (57) 摘要 本发明涉及用于聚合酶链反应的微流系统和 方法。微流系统具有基底并且在基底上具有弹性 薄膜， 该基底具有三个在流体方面相互串联的用 于不同温度水平的腔室， 薄膜封闭腔室， 其中相互 串联的腔室可以在串联结合处的端部上在流体方 面封闭， 其中腔室上的薄膜能够分别运动到腔室 中从而排空腔室。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 7 页 1/1 页 2 1. 用于聚合酶链反应的微流系统 （。
3、10、 30） ， 其具有基底 （11） 并且在基底 （11） 上具有 弹性薄膜 （25） ， 该基底具有三个在流体方面相互串联的用于不同温度水平的腔室 （16、 17、 18） ， 所述薄膜封闭腔室 （16、 17、 18） ， 其中相互串联的腔室 （16、 17、 18） 能够在串联结合处 （24） 的端部上在流体方面封闭， 其特征在于， 腔室 （16、 17、 18） 上的薄膜 （25） 能够分别运动 到腔室 （16、 17、 18） 中以用于排空腔室 （16、 17、 18） 。 2. 按权利要求 1 所述的微流系统， 其特征在于， 所述微流系统 （30） 具有驱动装置用于 使每个腔室。
4、 （16、 17、 18） 上的薄膜 （25） 运动。 3. 按权利要求 2 所述的微流系统， 其特征在于， 微流系统 （30） 在每个腔室 （16、 17、 18） 上具有邻靠薄膜 （25） 的泵室 （36、 37、 38） 。 4. 按权利要求 3 所述的微流系统， 其特征在于， 气动地加载所述泵室 （36、 37、 38） 。 5. 按权利要求 3 所述的微流系统， 其特征在于， 液压地加载所述泵室 （36、 37、 38） 。 6. 按权利要求 2 所述的微流系统， 其特征在于， 所述微流系统 （10） 被设计用于与外部 的驱动装置共同作用以使每个腔室 （16、 17、 18） 上的薄。
5、膜 （25） 运动。 7. 按权利要求 6 所述的微流系统， 其特征在于， 所述外部的驱动装置具有推进器。 8. 按权利要求 1 到 7 中任一项所述的微流系统， 其特征在于， 所述微流系统 （10、 30） 在 串联结合处 （24） 的端部上具有阀门 （22、 23） 。 9.按权利要求1到8中任一项所述的微流系统， 其特征在于， 所述微流系统在外部的腔 室 （61、 63） 之间具有直接的连接通道 （68） 。 10. 在微流系统中实施聚合酶链反应的方法， 该微流系统具有在流体方面相互串联的 第一、 第二以及第三腔室 （16、 17、 18） ， 所述方法具有以下方法步骤 ： a） 将所述。
6、腔室调温到各个预先给定的温度上 ； b） 预先给定 PCR 循环次数 ； 为 PCR 循环次数 c） 将 PCR 溶液泵入第一腔室 （16） 中 ； d） 将 PCR 溶液在第一腔室 （16） 中保持第一时间间隔 ； e） 将 PCR 溶液泵入第二腔室 （17） 中 ； f） 将 PCR 溶液在第二腔室 （17） 中保持第二时间间隔 ； g） 将 PCR 溶液泵入第三腔室 （18） ； h） 将 PCR 溶液在第三腔室 （18） 中保持第三时间间隔 ； 其中方法步骤 a） 、 b） 以及方法步骤 c） 的第一次实施能够以任意顺序进行， 其中借助于 输出腔室上的薄膜 （25） 受控地移入输出腔室。
7、中实现从输出腔室到目标腔室的泵送。 11. 按权利要求 10 所述的方法， 其特征在于， 用于移动薄膜 （25） 的驱动装置在微流系 统 （10） 中。 12. 按权利要求 11 所述的方法， 其特征在于， 每个腔室 （16、 17、 18） 上的驱动装置具有 邻靠薄膜 （25） 的泵腔 （36、 37、 38） 。 13. 按权利要求 12 所述的方法， 其特征在于， 气动地加载泵腔 （36、 37、 38） 。 14. 按权利要求 12 所述的方法， 其特征在于， 液压地加载泵腔 （36、 37、 38） 。 权 利 要 求 书 CN 102757887 A 2 1/4 页 3 用于聚合酶。
8、链反应的微流系统和方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction， PCR） 的微流系 统以及用于实施聚合酶链反应的方法。 背景技术 0002 在分子诊断学中经常实施聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction， PCR） ， 从 而繁殖 DNA 链。在 PCR 中向 DNA 附加 PCR 主混合物， PCR 主混合物包含为了实施 PCR 所需的 物质。DNA 和 PCR 主混合物形成了 PCR 溶液。PCR 溶液多次先后置于三个特定的温度水平 上。按标准为此使用所谓的温度循环器。由文献中公开了 PCR 在微。
9、流系统中流动的系统。 WO 2001/007159 A2 描述了微流装置， 其中各个容器按顺序地置于不同的温度水平上。 0003 Yao 等 人 （et al.） , 生 物 医 学 微 型 装 置 （Biomedical Microdevices） 2005,7,253， 在微流系统中使用较长的微流通道。在一次性流过通道时 DNA 溶液多次引导 通过不同的温度区域。在此使用外部的泵。 0004 Chung 等人 （et al.） , in IEEE MEMS 2011， 865， Cancun， 墨西哥 （MEXICO） ， 一月 （January） 23-27， 2011， 在微流系统中使。
10、用带有三个温度区域的圆形通道。 不使用泵， 而是 利用浮力。 发明内容 0005 本发明实现了按权利要求 1 所述的微流系统。 0006 按本发明提供三个微流处理室， 其中每个微流处理室处于特定的对于 PCR 的各个 步骤所需的温度水平上。PCR 溶液通过泵入具有相应温度水平的处理室中而置于该温度水 平上。PCR 溶液包含 DNA 以及 PCR 主混合物， 其中 PCR 主混合物包含对于实施 PCR 所需的物 质。借助于腔室上的薄膜实现了 PCR 溶液在处理室之间的泵送， 该薄膜相应受控地移动到 腔室中并且改变腔室体积。 0007 本发明同样实现了按权利要求 10 所述的相应的方法。 0008。
11、 本发明的其它有利的实施方式由从属权利要求中获得。 0009 根据本发明， 微流腔室处于恒定的温度水平上。仅加热或者说冷却液体。由此强 烈减少了系统的热量并且可以比在具有温度循环器的系统中快得多地运行 PCR。 0010 在常规的设备中要用显著的开销得以实现快速冷却， 例如通过用帕尔贴元件进行 冷却。与之相比， 例如在使用电阻加热元件时明显更简单并且更便宜地构造本发明的用于 热触发的设备。 0011 通过在处理室上使用薄膜用于泵送， 不需要额外的泵， 空间需求更少了并且液体 不会蒸发。 附图说明 0012 图 1 示出了按本发明实施方式的带有外泵操作的微流系统的截取部分的透视图 ； 说 明 书。
12、 CN 102757887 A 3 2/4 页 4 图 2 示意性示出了图 1 中带有流体元件的基层处于多个操作状态 A 到 D 中 ； 图 3 示出了按本发明另一集成的实施方式的带有内部泵操作的微流系统的截取部分 的相互拉开的透视图 ； 图 4 示意性示出了按本发明另一实施方式的带有循环填充处理室功能的微流系统的 处理室装置 ； 图 5 示意性示出了按本发明另一实施方式的带有通过往复泵填充处理室功能的微流 系统的处理室装置 ； 图 6 示出了在按本发明实施方式的微流系统中实施聚合酶链反应的方法的流程图。 具体实施方式 0013 在图1中透视地示出了按本发明实施方式的微流系统10。 这里是聚合。
13、物基底的基 底 11 在上面 12 包含流体结构 13， 其具有入口通道 14、 出口通道 15 以及三个在流体方面相 互串联的腔室、 也就是第一腔室 16、 第二腔室 17 和第三腔室 18。第一腔室 16 通过较短的 连接通道 20 与第二腔室 17 连接， 并且第二腔室 17 通过较短的连接通道 21 与第三腔室 18 连接。所述入口通道 14 具有进入阀 22 并且出口通道 15 具有排出阀 23。所述进入阀 22 和 排出阀 23 在与串联腔室 16、 17 和 18 的串联接合处 24 的端部上形成了可控制的封闭点。 0014 所述微流系统10在基底11上具有弹性的薄膜25， 例如。
14、由热塑性弹性体TPE制成。 该薄膜 25 在上面 12 与基底 11 连接并且封闭流体结构 13 的空腔。在腔室 16、 17 和 18 上 面的弹性薄膜 25 可以运动到相应的腔室中从而排空腔室。 0015 在所述实施方式中在外部借助于各个用于每个薄膜段的冲头控制薄膜段在腔室 16、 17和18上的位置或者说将薄膜段移动到腔室中。 所述冲头例如借助于压缩空气进行驱 动， 然而也可以进行热磁性和 / 或磁性的驱动。同样从外面操作所述阀门 22 和 23。在没有 示出的替代实施方式中， 所述阀门没有集成到系统中， 而是作为外部的组件。 0016 在运行中所述腔室 16、 17 和 18 处于用于。
15、 PCR 的不同的温度水平上并且保持在该 温度水平上。在此， 在外部从下面进行温度处理， 然而也可以在内部例如用加热元件、 电阻 元件、 微波并且 / 或者通过热辐射实现温度处理。为了腔室 16、 17 和 18 相互间的热隔离， 在连接通道 20 和 21 边上分别在两侧将钻孔 26 置于基底 11 中。 0017 图 2 说明了实施方式中微流系统 10 的运行， 其中为了实施 PCR 将 PCR 溶液往复泵 入三个在流体方面相互串联的腔室 16、 17 和 18 中。为此示出了图 1 中公开的带有流体元 件的基层 11 在多个操作状态 A 到 D 中的情况。各个反应室处于一个温度区域内并且。
16、从下 面和 / 或上面通过各自的加热元件例如电阻加热元件或帕尔贴元件进行加热。相邻的腔室 通过连接通道 20 和 21 连接。外面的腔室 16、 18 通过入口通道 14 和出口通道 15 接触， PCR 溶液能够通过入口通道和出口通道冲入或者说冲出。入口和出口通道可以通过阀门 22 和 23 关闭。为了使温度区域相互间更好地热隔离， 钻孔 26 处于所述腔室之间。通过将弹性薄 膜 25 移动到各个腔室中可以改变腔室 16、 17 和 18 的体积。没有将薄膜移动到腔室中的状 态在下面称作 “腔室敞开” 。最大限度将薄膜移动到腔室中的状态在下面称作 “腔室关闭” 。 在这种状态下液体、 在PC。
17、R中也就是PCR溶液基本上从腔室体积中挤出来， 其中可能会残留 剩余液体。 0018 微流系统 10 的工作原理如下 ： 说 明 书 CN 102757887 A 4 3/4 页 5 操作状态 A 用于准备 PCR。阀门 22 和 23 以及腔室 16、 17、 18 是敞开的。PCR 溶液通过 入口通道 14 冲入第一腔室 16 中。其它两个腔室 17 和 18 基本上保持空的。温度区域置于 目标温度上， 示范值为第一腔室 ： 95， 第二腔室 ： 72， 第三腔室 ： 55。 0019 现在先后关闭进入阀 22、 第二腔室 17、 第三腔室 18 和排出阀 23。在该操作状态 B 下， P。
18、CR 溶液现在基本上位于第一腔室 16 中并且在较短时间之后具有在那里存在的温度。 串联腔室 16、 17 和 18 的串联结合处 24 基本上是没有气泡的。 0020 PCR 溶液在第一腔室 16 中保持所希望的停留时间， 例如 10s。进行 DNA 链的变性。 0021 现在打开第二腔室 17、 关闭第一腔室 16 并且实现操作状态 C。在该状态中 PCR 溶 液现在基本上处于第二腔室 17 中。 0022 随后打开第三腔室 18 并且关闭第二腔室 17 并且实现操作状态 D。通过该顺序将 PCR溶液挤入第三腔室18中并且在较短的时间之后具有在那里存在的温度。 例如体积大约 为 1-10l。
19、 的 PCR 溶液在大约 100ms 内具有腔室中的温度。 0023 PCR 溶液在第三腔室 18 中保持所希望的停留时间， 例如 10s， 并且 DNA 链与引物杂 交。 0024 随后打开第二腔室 17 并且关闭第三腔室 18。由此将 PCR 溶液挤入第二腔室 17 中 并且再实现操作状态 C。PCR 溶液在较短的时间之后具有在那里存在的温度。 0025 PCR 溶液在第二腔室 17 中保持所希望的停留时间例如 10s 并且进行延长。 0026 最后打开第一腔室 16 并且关闭第二腔室 17。由此将 PCR 溶液挤入第一腔室 16 中 并且再实现操作状态 B。由此描绘了整个 PCR 循环。。
20、现在根据所希望的 PCR 循环次数重复 该 PCR 循环， 例如 30 次。 0027 在实现所希望的 PCR 循环次数之后打开阀门 22 和 23 以及腔室 16、 17、 18 并且冲 出 PCR 溶液。 0028 温度区域也可以以其它顺序进行布置。在这种情况下相应地改变触发顺序。然而 上面所描述的布置具有温度梯度最小化的优点。 0029 图 3 示出了按本发明另一集成的实施方式的微流系统 30 的截取部分的相互拉开 的透视图， 其中集成了泵操作。 为了示出层结构， 相互拉开地示出了各个层。 微流系统30包 含图1中公开的带有相同附图标记的元件。 所述元件是基底11连同其元件和弹性薄膜25。
21、。 在薄膜 25 上布置了另一个带有气动结构 32 的基层 31 以及覆盖层 33。在该实施方式中不 再从外部实现阀门的操作以及薄膜在腔室上的移动， 而是在内部借助于气动结构 32 的元 件实现。 0030 其它基层 31 包含气动结构 32 朝基底 11 中的流体结构 13 冲压以及定向， 其中基 底 11 中可操作的元件具有其它基层 31 中相应的元件。基底 11 中可操作的元件与相应的 元件上下布置， 中间具有弹性薄膜 25。如此， 所述阀门 22、 23 相应于气动的阀门腔室 34、 35 并且腔室16、 17、 18相应于气动的腔室36、 37、 38。 气动地加载所述腔室36、 3。
22、7、 38分别使得 弹性薄膜 25 移动到基底 11 中可操作的元件上并且由此操作所述元件。每个气动的阀门腔 室 34、 35 都与配属的气动通道 40、 41 连接并且每个气动的腔室 36、 37、 38 都与配属的气动 通道 42、 43、 44 连接。经由所述通道气动地操作所述气动的阀门腔室 34、 35 以及气动的腔 室 36、 37、 38。其它基层 31 还包括钻孔 45， 所述钻孔对置于钻孔 26 并且通过薄膜 25 与之 隔开。 说 明 书 CN 102757887 A 5 4/4 页 6 0031 所述覆盖层 33 气动地密封气动结构 32 并且在机械方面保护微流系统 30。。
23、 0032 代替气动结构的气动运行， 也可以用相同的结构实现液压运行。 0033 图 4 示意性示出了按本发明另一实施方式带有通过往复泵填充处理室功能的微 流系统的处理室装置 50。该处理室装置 50 相应于图 1 中腔室的布置以及腔室的在图 2 中 描述的运行。所述腔室 51、 52、 53 在流体方面串联， 其中入口通道 54 具有进入阀 55 并且出 口通道 56 具有排出阀 57。所述腔室 51、 52、 53 在各个所属的温度水平上。PCR 溶液在 PCR 之前以及之后在阀门 55、 57 打开时经由通道 54、 56 导入或者说导出。PCR 溶液在 PCR 期间 为了 PCR 循环。
24、在所述腔室 51、 52、 53 之间往复泵送。PCR 溶液的流动方向通过箭头表示。 0034 图 5 示意性地示出了按本发明另一实施方式的带有循环填充处理室功能的微流 系统的处理室装置 60。腔室 61、 62、 63 在流体方面串联， 其中入口通道 64 具有进入阀 65 并 且出口通道 66 具有排出阀 67。该处理室装置 60 额外地具有连接通道 68， 该连接通道直接 将外面的腔室 61、 63 相互连接。所述腔室 61、 62、 63 在相应所属的温度水平上。PCR 溶液在 PCR 之前和之后在阀门 65、 67 打开时经由通道 64、 66 导入或者说导出。PCR 溶液在 PCR。
25、 期 间为了 PCR 循环在所述腔室 61、 62、 63 之间循环地泵送。PCR 溶液的流动方向通过箭头表 示。在为腔室分配温度水平时要注意 PCR 溶液流过腔室的顺序。 0035 图 6 示出了在按本发明实施方式的微流系统中实施聚合酶链反应的方法的流程 图 70。该微流系统具有在流体方面相互串联的第一、 第二以及第三腔室， 例如腔室 51、 52、 53 或腔室 61、 62、 63。所述方法以方法步骤 a） 开始， 即在各个预先给出的温度上温度处理 所述腔室。在方法步骤 b） 中规定 PCR 循环的次数。方法步骤 c） 到 h） 实现了所述次数的 PCR 循环。 0036 在各个 PCR。
26、 循环中一开始在方法步骤 c） 中将 PCR 溶液泵入第一腔室中。在那里 根据方法步骤 d） 将 PCR 溶液保持第一时间间隔。随后在方法步骤 e） 中将 PCR 溶液泵入第 二腔室中。在那里根据方法步骤 f） 将 PCR 溶液保持第二时间间隔。现在在方法步骤 g） 中 将 PCR 溶液泵入第三腔室中。在那里根据方法步骤 h） 将 PCR 溶液保持第三时间间隔。现 在完成了单个 PCR 循环。 0037 在方法步骤 i） 中将所实施的 PCR 循环的次数与预先给出的循环的次数进行比较， 并且如果还没有达到规定的次数就返回到 c） 。否则就结束 PCR 并且在方法步骤 j） 中泵出 PCR 溶液。
27、。 0038 方法步骤 a） 、 b） 以及方法步骤 c） 的第一次实施可以以任意顺序进行。借助于输 出腔室上的薄膜受控地移入输出腔室中实现了从输出腔室到目标腔室的泵送。在此， 通过 关闭所填充的敞开的腔室从中挤出 PCR 溶液并且 PCR 溶液逃入相邻的空的敞开腔室， 如参 照图 1 中的微流系统 10 结合图 2 所描述的， 其中描述了所述方法的其它细节。由于关闭的 阀门 22、 23 以及不参与当前泵送过程的关闭的腔室， PCR 溶液不会不同于进入空的敞开腔 室漏出。 说 明 书 CN 102757887 A 6 1/7 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102757887 A 7 2/7 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757887 A 8 3/7 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757887 A 9 4/7 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 102757887 A 10 5/7 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 102757887 A 11 6/7 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 102757887 A 12 7/7 页 13 图 6 说 明 书 附 图 CN 102757887 A 13 。