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1、(10)授权公告号 CN 102399704 B (45)授权公告日 2013.11.13 CN 102399704 B *CN102399704B* (21)申请号 201110385809.7 (22)申请日 2011.11.29 C12N 1/14(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 谢君 冯蕾 罗思施 徐晓立 张爱萍 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (54) 发明名称 一种。
2、适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养 基及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种适合白腐真菌生长及产漆 酶的液体培养基及其应用。本发明所述液体培养 基由碳源、 氮源、 大量元素、 微量元素和水组成。 该 液体培养基不仅适合白腐真菌的生长， 还能够促 进真菌分泌漆酶， 与普通 PDA 液体培养基相比， 同 种真菌的漆酶产量提高了450倍。 本发明所述液 体培养基还具有配制方便、 发酵周期短等优点， 适 合推广应用。 (51)Int.Cl. 审查员 冯娟 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 (10)授权公告号 CN。
3、 102399704 B CN 102399704 B *CN102399704B* 1/1 页 2 1. 一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基， 其特征在于由碳源、 氮源、 大量元 素、 微量元素和水组成 ； 其中， 所述碳源为 1% v/v 甘油， 所述氮源为 1.5% w/v 酸水解干酪 素与 1.5% 麦麸或麦麸水解物的混合 ； 所述大量元素为 2g/L 磷酸氢二铵、 1g/L 磷酸二氢钾、 1.5g/L七水硫酸镁、 1.3g/L琥珀酸钠、 2g/L五水硫酸铜、 0.01g/L维生素B1和0.05% v/v吐 温-80 ； 所述微量元素为0.00010.1g/L氯化钠、 0.000。
4、10.1g/L一水硫酸锰、 0.00010.1g/ L氯化钙、 0.00010.1g/L七水硫酸亚铁、 0.00010.1g/L硫酸锌、 0.000010.01g/L氯化钴、 0.000010.01g/L 十二水硫酸铝钾、 0.000010.01g/L 钼酸钠和 0.000010.01g/L 硼酸。 2. 权利要求 1 所述适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基的制备方法， 其特征在于 是将各组分混合， 搅拌均匀， 调节 pH 至 2.08.0 后， 分装灭菌而得。 3. 权利要求 1 所述液体培养基在培养栓菌属Trametes白腐真菌中的应用。 4. 权利要求 1 所述液体培养基在促进栓菌属T。
5、ramete白腐真菌分泌漆酶中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102399704 B 2 1/3 页 3 一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基及其应用 技术领域 0001 本发明涉及真菌培养技术领域， 具体涉及一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体 培养基及其应用。 背景技术 0002 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶， 其作用底物广泛， 能够有效降解木质素及催化氧 化多种酚和芳胺类化合物， 在生物能源、 环境保护、 造纸工业、 食品工业、 生物检测等领域 均具有广阔的应用前景和潜在应用价值。大部分能够引起木本或草本植物腐化的真菌均 能产生漆酶。其中， 白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真。
6、菌的统称， 具有突出 的木质素降解能力， 主要为担子菌， 少部分为子囊菌， 包括革盖菌属 （Coriolus） 、 卧孔菌属 （Poria） 、 多孔菌属 （Polyporus） 、 原毛平革菌属 （Phanerochaete） 、 侧耳属 （Pleurotus） 、 烟 管菌属 （Bjerkandera） 和栓菌属 （Trametes） 等。 0003 白腐真菌多为好氧微生物， 培养温度一般在 2830左右， 在 pH3.0 8.0 的范围 均能稳定产酶。白腐真菌的产酶能力与其培养条件密切相关。碳源、 氮源、 无机盐及各类诱 导物是提高漆酶产量的关键因素。 0004 碳源和氮源对于微生物的生。
7、长和代谢是必不可少的。然而， 来源不同的微生物对 培养基成分的要求有很大差异。对于白腐真菌， 常见的碳源有葡萄糖、 蔗糖、 甘油、 玉米粉、 麦草粉、 麸皮等 ； 常用的氮源为 (NH4)2SO4 、 NH4Cl 等无机氮源， 酵母提取物、 蛋白胨等有机氮 源以及玉米粉、 马铃薯、 麦麸等天然含氮物质。 0005 此外， 许多金属离子和化合物以不同的方式添加到培养基中， 以诱导漆酶基因表 达， 提高漆酶产量。常见的金属离子诱导物有 Cu2+、 Mn2+等， 常见的诱导剂有香兰素、 愈创木 酚和丹宁酸等。一些天然的含木质素的物质， 如麸皮、 麦草粉、 木屑木汁、 蔗渣等， 不仅为培 养基提供碳氮。
8、源， 同时也可用于诱导漆酶的产生。 0006 目前， 最常见的用于培养白腐真菌的培养基是新鲜土豆所制成的 PDA 液体培养， 通常于培养基中添加适量的麦麸诱导漆酶产生。然而， 于 PDA 液体培养基中培养白腐真菌， 虽然菌体生长快速， 但是漆酶产量却十分低下， 不足以用于纯化利用。 本发明涉及的适合白 腐真菌生长和高产漆酶的液体培养基， 不仅为菌体生长提供充足的营养成分， 还能促进菌 体分泌漆酶。与一般的 PDA 液体培养基相比， 同种真菌的漆酶产量可提高 5 至 50 倍， 足以 分离纯化并加以利用。 发明内容 0007 本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足， 提供一种不仅适合白腐真。
9、菌 的生长， 还能够促进白腐真菌分泌漆酶的液体培养基。 0008 本发明另一目的在于提供上述液体培养基的制备方法。 0009 本发明还有一个目的在于提供上述液体培养基的应用。 0010 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现 ： 说 明 书 CN 102399704 B 3 2/3 页 4 0011 一种适合白腐真菌生长的液体培养基， 由碳源、 氮源、 大量元素、 微量元素和水组 成 ； 其中， 所述碳源为甘油， 所述氮源为酸水解干酪素与麦麸或麦麸水解物的混合 ； 所述 大量元素为磷酸氢二铵、 磷酸二氢钾、 七水硫酸镁、 琥珀酸钠、 五水硫酸铜、 维生素 B1 和吐 温 -80 ； 所述微量元。
10、素为氯化钠、 一水硫酸锰、 氯化钙、 七水硫酸亚铁、 硫酸锌、 氯化钴、 十二 水硫酸铝钾、 钼酸钠和硼酸。 0012 作为一种优选方案， 上述液体培养基由如下组分组成 ： 0.00110%（v/v）甘油， 0.00110%（w/v）酸水解干酵素， 0.00110% 麦麸或麦麸水解物， 0.0110g/L 磷酸氢二 铵， 0.0110g/L 磷酸二氢钾， 0.0110g/L 七水硫酸镁， 0.0110g/L 琥珀酸钠， 0.0110g/ L 五水硫酸铜， 0.00110g/L 维生素 B1， 0.00110% (v/v) 吐温 -80， 0.00010.1g/L 氯化 钠， 0.00010.1。
11、g/L 一水硫酸锰， 0.00010.1g/L 氯化钙， 0.00010.1g/L 七水硫酸亚铁， 0.00010.1g/L 硫酸锌， 0.000010.01g/L 氯化钴， 0.000010.01g/L 十二水硫酸铝钾， 0.000010.01g/L 钼酸钠， 0.000010.01g/L 硼酸。 0013 本发明上述液体培养基的制备方法是将各组分混合， 搅拌均匀， 调节 pH 至 2.08.0 后， 分装灭菌而得。 0014 本发明上述液体培养基可以用于培养白腐真菌， 还可以促进白腐真菌分泌漆酶。 0015 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 0016 1. 本发明所涉及的一种适。
12、合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基， 含有多种营 养成分和金属离子， 不仅能为白腐真菌的生长繁殖提供足够的营养， 而且促进白腐真菌分 泌漆酶， 同一来源的白腐真菌在本发明所涉及的液体培养基中生长比在一般的 PDA 液体培 养基中生长， 漆酶活力提高 550 倍。 0017 2. 本发明所涉及的液体培养基， 原料获取方便、 配制简单。 具体实施方式 0018 以下结合具体实施例来进一步解释本发明， 但实施例并不对本发明做任何形式的 限定。 实施例 0019 1. 量取 10 mL 甘油、 0.5 mL 吐温 -80。 0020 2. 称量15 g酸水解干酪素、 2 g磷酸氢二铵、 1 g磷酸二氢。
13、钾、 1.5 g七水硫酸镁、 1.3 g 琥珀酸钠、 2 g 五水硫酸铜、 0.01g 维生素 B1。 0021 3. 将上述成分混合， 加入 500mL 水充分溶解。 0022 4. 分别配制微量元素各个成分的母液， 按比例加入上述溶液中， 加水至大约 800 mL， 充分混匀， 调节 pH 至 5.0， 定容 1000mL。 0023 5. 往上述培养基中加入 10 目的麦麸 15g， 混匀， 分装， 灭菌， 待用。 0024 6. 将栓菌属白腐真菌按接种量 5% 接种于上述培养基中， 培养 13 天。 0025 7. 上述培养物胞外漆酶活力达 50U/mL。 0026 分别采用PDA液体培养基以及上述方法制得的液体培养基培养栓菌属真菌11天， 从第 5 天起每隔一天收集粗酶液， 用 ABTS 法测定漆酶酶活力， 产酶情况如下 ：（酶活力单位 U/mL） 说 明 书 CN 102399704 B 4 3/3 页 5 0027 培养基种类5 天7 天9 天11 天 PDA 液体培养基0.160.320.520.53 本发明培养基0.7845.1055.8553.33 说 明 书 CN 102399704 B 5 。