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1、(10)申请公布号 CN 102329782 A (43)申请公布日 2012.01.25 CN 102329782 A *CN102329782A* (21)申请号 201110235230.2 (22)申请日 2011.08.16 CCTCC V201126 2011.07.29 C12N 7/00(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店埔垱 (72)发明人 陈少莺 陈仕龙 林锋强 俞伏松 程晓霞 王劭 。
2、朱小丽 李兆龙 江斌 (54) 发明名称 鸡黄病毒分离株及其在疫苗制备中的应用 (57) 摘要 本发明公开了分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病 毒 CJD05 株， 保藏在 CCTCC， 保藏日期 2011 年 7 月 29 日， 保藏编号 ： CCTCC V201126。本发明还公开 了鸡黄病毒分离株在制备鸡黄病毒病疫苗上的应 用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102329792 A1/1 页 2 1. 分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒 CJD05 株， 保藏在 CCTCC， 保藏日期。
3、 2011 年 7 月 29 日， 保藏编号 ： CCTCC V201126。 2. 根据权利要求 1 所述的鸡黄病毒 CJD05 株在制备鸡黄病毒病疫苗上的应用。 权 利 要 求 书 CN 102329782 A CN 102329792 A1/3 页 3 鸡黄病毒分离株及其在疫苗制备中的应用 技术领域 0001 本发明涉及鸡黄病毒病疫苗的制备方法及在鸡黄病毒病防制中的应用。 背景技术 0002 鸡黄病毒病是 2009 年以来在我国首先出现的一种新疫病， 临床特征主要表现为 产蛋鸡发热、 产蛋急降或停止、 采食减少或食欲废绝为 ； 剖检特征主要表现为卵泡出血、 萎 缩， 部分卵黄破裂， 形成。
4、卵黄性腹膜炎。该病主要侵害产蛋 ( 种 ) 鸡， 给我国蛋 ( 种 ) 鸡养 殖业造成很大经济损失。福建省农业科学院畜牧兽医研究所在国内外首先分离、 鉴定了鸡 黄病毒 (Chicken Flavivirus， CFV)， 确认 CFV 是鸡黄病毒病的病原， 是黄病毒科黄病毒属 的新成员， 丰富了动物病毒学内容。建立了检测鸡黄病毒病抗原的 RT-LAMP 方法和检测抗 体的微量血清中和方法， 制备的疫苗可有效预防鸡黄病毒病。 发明内容 0003 本发明的目的之一是提供鸡黄病毒 CJD05 株 ： 0004 分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒 CJD05 株， 保藏在中国典型培养物保藏中心 (China。
5、 Center for Type Culture Collection， 简称CCTCC)， 保藏日2011年7月29日， 保 藏编号 ： CCTCC V201126。保藏单位 CCTCC 地址在中国武汉市武汉大学。 0005 本发明的目的之二是提供鸡黄病毒 CJD05 株应用于鸡黄病毒病疫苗的制备方法， 将上述的鸡黄病毒分离株在番鸭胚或鸡胚尿囊腔中增殖， 收获死胚尿囊液经甲醛灭活并超 滤浓缩后， 按适当比例与油佐剂混匀， 研制成安全有效的鸡黄病毒病灭活疫苗， 并应用于该 病的防制。 0006 本发明的创新点在于， 鸡黄病毒病是 2009 年以来新出现的疫病， 至今还无法预防 和控制， 本发明。
6、在明确病原的基础上， 在国内外率先将鸡黄病毒分离株应用于制备疫苗， 并 研制成安全有效的鸡黄病毒病灭活疫苗， 为该病防制提供了技术支撑。 具体实施方式 0007 以下结合具体实施例对本发明进一步说明 ( 但不是对本发明的限制 )。 0008 分离自产蛋下降病鸡的鸡黄病毒 CJD05 株， 能在 9 日龄鸡胚、 12 日龄番鸭胚和 MDEF 细胞中稳定增殖， 并能致胚胎死亡和细胞病变， 具有如下特性 ： CJD05 株经尿囊腔接种 12 日龄番鸭胚， 其 ELD50 10-4.5/0.1ml ； 对番鸭胚成纤维单层细胞 TCID50 10-4.5/0.1ml ； 该毒株保藏在 CCTCC， 保藏。
7、日 2011 年 7 月 29 日， 保藏编号 ： CCTCC V201126。 0009 上述鸡黄病毒 CJD05 株应用于鸡黄病毒病疫苗的制备方法如下 ： 0010 1、 病毒增殖 ： 将鸡黄病毒 CJD05 株用灭菌 Hanks 液 1 10 稀释后， 经尿囊腔途径 接种 12 日龄番鸭胚或 9 日龄鸡胚， 0.1ml/ 枚， 37温箱培养， 每日观察 2 次至第 7 天， 弃去 24h 内的死胚， 胚胎濒死时置 4冰箱 4 小时以上， 收获死胚尿囊液， -20冻存。 0011 2、 病毒含量 ELD50 测定 ： 取上述尿囊液毒以 Hank s10 倍系列稀释后， 经尿囊腔接 说 明 。
8、书 CN 102329782 A CN 102329792 A2/3 页 4 种12日龄番鸭胚或9日龄鸡胚， 每稀释度接种4枚， 0.1ML/胚， 置37继续孵化， 观察7天， 弃除 24 小时内的死胚， 计算 ELD50。当尿囊液毒 ELD50 10-4.0/0.1ml 时， 可用于病毒灭活。 0012 3、 病毒灭活和浓缩 ： 将收获的尿囊液， 加入终浓度为 0.1的甲醛， 37 24h 灭活， 经适当超滤浓缩后即为制备疫苗用的抗原， 37保存备用。 0013 4、 灭活验证 ： 取灭活并浓缩后的抗原接种 9 日龄 SPF 鸡胚或 12 日龄番鸭胚， 0.1ml/ 胚， 37温箱继续孵化，。
9、 观察 7 天， 除接种后 24h 内死亡的胚胎外， 接种胚应全部存 活。 0014 5、 疫苗配制， 按 1 1 1.5 的比例加入灭活抗原和油佐剂， 搅拌均匀制成油包水 型乳剂疫苗。 0015 6、 疫苗主要指标测定 0016 6.1 无菌检验 ： 按现行 中华人民共和国兽药典 附录进行， 应无菌生长。 0017 6.2 安全性测定 ： 用 27 周龄健康易感的产蛋高峰期海兰褐蛋鸡 30 羽， 随机分成 2 组， 每组 15 羽。试验组每羽颈部皮下注射 5ml 疫苗 ； 对照组每羽腿部肌肉注射 5ml Hanks 液， 隔离饲养并观察 20 天。接种鸡全部存活， 且采食、 饮水、 精神状态。
10、等均未见异常， 试验 组产蛋率与对照组无统计差异， 接种后 10 天和 20 天各随机剖杀 3 羽， 内脏器官、 卵泡、 卵巢 和输卵管等也未见异常。 0018 6.3 免疫力测定 ( 免疫抗体、 攻毒保护力 ) 0019 6.3.1 试验设计 ： 取 12 周龄海兰褐蛋鸡 40 羽， 随机分成免疫组和对照组。免疫组 每羽颈部皮下接种疫苗1ml/l羽份， 对照组每羽颈部皮下注射Hanks液1ml ； 间隔4周， 取经 上述免疫的 16 周龄蛋鸡同剂量颈部皮下加强免疫一次。分别于首次免疫后 14 天、 28 天和 加强免疫后 7 天 ( 首免后 35 天， 即 17 周龄， 以此类推 )、 14。
11、 天、 21 天、 28 天、 42 天、 56 天、 77 天、 90天采血， 测定免疫后不同时间的中和抗体效价， 评价疫苗诱导的抗体水平。 同时， 取二 免后 35 天 ( 即 21 周龄 ) 的免疫组和对照组蛋鸡各 10 羽， 经口、 鼻和肌注攻击强毒， 1.0ml/ 羽， 观察 20 天， 记录各组蛋鸡的饮食欲、 精神状态及产蛋数量， 评价疫苗的攻毒保护力。 0020 6.3.2 血清中和抗体结果 ： 从表 1 可知， 蛋鸡首免后 14 天部分免疫鸡血清中出现 较低水平的中和抗体， 首免后 28 天中和抗体达 22； 二免后 14 天中和抗体水平为 23， 随后逐 渐上升， 二免后 2。
12、8 天达 24.5， 直到 90 天抗体水平仍维持较高水平 (24.3)。 0021 表 1 12 周龄蛋鸡疫苗免疫后血清中和抗体水平动态变化 (Log2) 0022 0023 6.3.3 攻毒保护结果 ： 取加强免疫后 35 天 ( 即 21 周龄 ) 的免疫组和对照组蛋鸡 各 10 羽， 分别攻击鸡黄病毒强毒， 另设 10 羽不免疫不攻毒鸡为健康对照， 隔离饲养并观察 20 天。结果显示 ： (1) 健康对照组 ( 不免疫不攻毒 ) 在整个观察期， 采食、 饮水、 精神状态等 均正常， 产蛋率为 58， 随机剖杀 2 羽， 内脏器官、 输卵管、 卵巢等均未见异常， 并可见不同 说 明 书 。
13、CN 102329782 A CN 102329792 A3/3 页 5 阶段发育的正常卵泡。(2) 攻毒对照组 ( 非免疫 ) 攻毒后第 4 天开始出现采食下降， 体温升 高， 产蛋下降， 且产蛋 率仅为 20， 随机剖杀 2 羽， 见卵泡萎缩、 出血， 部分卵黄破裂， 形成 卵黄性腹膜炎。(3) 免疫组攻毒后在整个观察期间， 采食、 饮水、 精神状态等均正常， 产蛋率 为 55， 随机剖杀 2 羽， 均未见异常 ( 同健康对照组 )， 表明蛋鸡黄病毒病疫苗免疫后可抵 抗强毒的攻击。 0024 上述结果说明应用鸡黄病毒分离株制备的灭活疫苗安全、 有效， 可用于预防黄病 毒引起的蛋 ( 种 ) 鸡产蛋下降。 说 明 书 CN 102329782 A 。